بررسی‌های متعدد آزمایشگاهی، مؤید این حقیقت است که اسپرم پستانداران پس از خارج شدن از بیضه‌ها و داخل شدن در اپیدیدم، حرکت پیشرونده‌ای نداشته و یا این حرکت بسیار ناچیز بوده است (5). اسپرم پس از انتقال و عبور از طول اپیدیدیم، بتدریج توانایی کامل برای حرکت پیشرونده را کسب می‌نماید. اگر چه اسپرم در داخل بدن پستانداران (بیضه و اپیدیدیم) ساکن و بی‌حرکت است، ولی توانایی حرکتی اسپرم با رقیق شدن در محیط کشت‌های مناسب آزمایشگاهی، قابل بازیافت و مطالعه است (1،2).
در ارتباط با بررسی میزان تغییرات و بلوغ اسپرم در طول اپیدیدیم و همچنین بررسی تأثیر سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم بر بلوغ اسپرم، وجود یک متد کمی اندازه‌گیری حرکت اسپرم ضروری است (16،17). هدف از این تحقیق و مطالعه، بررسی امکان استفاده از آنالیزر کامپیوتری اسپرم [Computer Assisted Sperm Analyser (CASA)]، برای داشتن یک مقیاس روشن اندازه‌گیری حرکت اسپرم رت می‌باشد. پس از ارزش‌گذاری و بدست آوردن معیارهای ارزیابی مناسب، این سیستم قادر خواهد بود که بلوغ آزمایشگاهی اسپرم را بررسی نماید.
آنالایزر کامپیوتری اسپرم (CASA) با داشتن یک آنالیز تصویری کامپیوتری پیشرفته و جالب (شامل سخت افزار و نرم افزار)، امکان ردیابی الکترونیکی اسپرم را دارا است (11). مطالعه بر روی اسپرم تعدادی از پستانداران نشان داده است که پارامترهای حرکتی اسپرم بعنوان مثال حرکت پیشرونده Progressive velocity، جابجایی سر اسپرم (Lateral head displacement) بستگی مستقیمی به توانایی باروری اسپرم در داخل بدن و یا خارج از بدن را دارد (10،16،19).
تلاش برای اندازه‌گیری تغییرات کمی حرکت اسپرم رت در روند بلوغ (7) شامل ارزش‌گذاری منحصر به اسپرم رت (8،20) اندازه‌گیری تعداد زدن دم (9) و استفاده از CASA می‌باشد (23) در آخرین گزارشها تنها تعداد نسبتاً کمی از اسپرم (300-100) بطور مداوم و مرتب و حداکثر در فواصل زمانی کوتاه مدت 67% ثانیه مورد آنالیز قرار گرفته است.
مطالعه حاضر از آنالایزر کامپیوتری اسپرم (CASA) با برتری‌های ویژه برای آنالیز (Hobson Sperm Tracker) و همچنین آنالایزرهای تصویری دیگر برای اندازه‌گیری جزئیات تغییر در پارامترهای حرکتی اسپرم رت در هنگام روند بلوغ و پس از انزال استفاده شده است.
حرکت اسپرم رت در روند بلوغ داخل بدن
تهیه و آماده‌سازی اسپرم اپیدیدیم رت
رت‌های بالغ با ضربه‌ای محکم بر سر آنها کشته شدند. اپیدیدیم در شرایط استریل، از بدن خارج و در داخل محیط کشت RPMI-1640 از خون و چربی عاری و شستشو داده شده و سپس در یک پتری دیش کوچک آزمایشگاهی (35 میلی‌متری) و در محیط کشت محتوی آنتی‌بیوتیک قرار داده شد. اپیدیدیم به چند قسمت مجزا تقسیم و این تقسیمات هر کدام در داخل یک خانه از پلیت 24 خانه حاوی 5/0-25/0 میلی‌لیتر از محیط کشت فوق حاوی BSA (آلبومین سرم گاوی) و آنتی‌بیوتیک قرار داده شد. قطعات اپیدیدیم مجدداً با قیچی به قطعات ریزتری تقسیم و بمدت 20-15 دقیقه داخل انکوباتور C37 قرار داده شد. سپس بافت‌های قطعه قطعه شده از محیط کشت خارج و سوسپانسیون اسپرم بدست آمده، مجدداً تا زمان استفاده در انکوباتور نگهداری شد.
تهیه و آماده‌سازی اسپرم انزال شده رت
متأسفانه جمع‌آوری اسپرم حاصل از انزال رت با تحریک مستقیم حیوان ممکن نیست. بنابراین اسپرم باید پس از ارتباط جنسی طبیعی از واژن جنس مخالف جمع‌آوری شود. بدین منظور رت‌های ماده 300-250 گرمی در داخل قفس‌های مجزای از رت‌های نر قرار داده شده و تحت مشاهده مستقیم قرار گرفتند. رت‌های ماده در زمان ایستروس رفتار جنسی متفاوتی را همراه با ارتباط جنسی در مدت 5-2 دقیقه پس از قرار داده شدن در قفس نشان می‌دادند. پس از 30 دقیقه و انجام حدود 50-30 بار انزال توسط رت نر، رت ماده از قفس جدا و به روش توضیح داده شده کشته شد. ناحیه تناسلی در شرایط استریل خارج و موضع بالای واژن و پایین رحم باز شد. توده اسپرم بسیار غلیظ و با ویسکوزیته بالا بوسیله اسپاچولای استریل کوچک برداشته و بداخل 1-5/0 میلی‌لیتر محیط کشت منتقل شد. رت‌هایی که در مدت 5-2 دقیقه هیچگونه ارتباط جنسی را نشان ندادند، از هم جدا و به قفس‌های خود بازگردانده شدند.
تهیه رقت مناسب از اسپرم با روش قطره‌ای (Droplet Method)
مقداری اسپرم از سوسپانسیون تهیه شده اصلی برداشته و بمیزان 1065 اسپرم در هر میلی لیتر رقیق و سپس l3 از این اسپرم رقیق شده به داخل l27 از از قطره محیط کشتی که وسط یک پتری دیش کوچک 35 میلی متری اضافه شد که سطح آن با روغن پارافین پوشیده شده بود.
تهیه رقت مناسب از اسپرم با روش لام و لامل (Coverslip Method)
30 میکرولیتر از اسپرم رقیق شده با روش فوق در وسط یک پتری دیش کوچک 35 میلی متری قرار داده شده و با یک لامل شیشه‌ای به ابعاد 2222 میلی‌لیتر پوشانده شد. عمق این میزان محیط کشت حاوی اسپرم، بین لامل و کف پلیت حدود 60 میکرومتر می‌باشد و این در صورتی است که محیط کشت از اطراف لامل منتشر نشود. روی لامل برای کنترل رطوبت و گرما با روغن پارافین پوشیده شد.
آنالیز حرکت اسپرم نواحی مختلف اپیدیدیم رت توسط آنالایزر کامپیوتری اسپرم (CASA)
اسپرمهای آماده شده به روش‌های فوق در داخل میکروسکوپ اینورت نیکون (Nikon UK, Ltd.) که اطراف آن با یک کابینت، با قابلیت تنظیم درجه حرارت هوای داخل آن بطور اتوماتیک روی C37، قرار داده شد. میکروسکوپ حاوی یک صفحه اتوماتیکی (Prior Scientific Instruments Ltd., UK) یک دوربین ویدیوئی (Pulnix Ltd.) London, 05 Lux متصل به آنالایزر حرکتی اسپرم (Hobson Sperm Tracker, Hobson Tracking System Ltd; Sheffild, UK) و یک ویدئو بود.
استفاده از این نوع آنالایزر اسپرم، تأثیر جدی بر نتایج بررسی داشت. تنظیم این آنالایزر اسپرم بگونه‌ای است که دقیقاً همان تصویری که در آنالایزر تصویری مشاهده می‌شود، قابل شناسایی و آنالیز است. لذا باید برای هر نوع اسپرم از پستانداران مختلف، یک تنظیم صحیح، شناسایی و انجام شود. در این ارتباط شکل سر اسپرم، شکل دم اسپرم و اندازه اسپرم و ضمائمی نظیر قطره سیتوپلاسمی، باید در نظر گرفته شود. این بررسیها با عدسی شیئی 4 و 10 فاز کنتراست بالا و منفی نیکون صورت پذیرفت. استفاده از این نوع اپتیک موجب ایجاد بهترین کنتراست برای سر اسپرم جوندگان (که داس مانند است) می‌شود. بخصوص زمانی که اسپرمها ضمن حرکت پیشرونده خود، بدون هیچگونه مانعی در حال چرخش هستند. این موضوع از این جهت قابل اهمیت است، که تحت حالت فاز کنتراست نرمال، سرهای اسپرم جوندگان، ضمن حرکت پیشرونده و در حال چرخش، بصورت متناوب روشن و تیره می‌شوند. این امر منجر به قطع ردیابی حرکت اسپرم توسط آنالایزرهای حرکتی اسپرم می‌شود. بهترین و مناسب‌ترین تنظیم در این آنالایزر (HST=Hobson Sperm Tracker) براساس استفاده از دستورالعمل ارائه شده توسط تولید کننده دستگاه و با تکرار آنالیزهای انجام شده از روی نوار ضبط شده ویدئویی حرکت اسپرم تعیین گردید. تنظیمها برای آنالیز تصویری عدسی شیئی 10 براساس ذیل بود:
Search radius=15.31m, predict=off, video= pal, aspect=1049, refresh time=1 second, threshold= 20/-66 و filter weighting 1=-2,2= 4,3=3,4=4.
آنالایزر Hobson Sperm Tracker می‌تواند تصاویر مورد نظر را بمیزان 25، 30 و یا 60 تصویر در هر ثانیه گرفته و مورد آنالیز قرار دهد. در این مطالعه 25 تصویر در هر ثانیه مورد استفاده جهت آنالیز اسپرم قرار گرفت. برتری قابل ذکر در این آنالایزر در مقابل با CASA سیستم‌های دیگر این است که در آنالایزرهای دیگر، میدان دید مورد مشاهده تنها در زمان بسیار کوتاهی (کمتر از یک ثانیه) مورد مطالعه قرار می‌گیرد در حالیکه این آنالایزر (HST) قادر به آنالیز حرکتی میدان دید مورد مشاهده در زمان تنظیم شده و قابل کنترل بین 15 ثانیه (با قابلیت اندازه‌گیری ردیابی صدها اسپرم) تا 5 دقیقه (ردیابی هزاران هزار اسپرم) را دارد.
ردیابی دقیق بوسیله یک امکان نصب شده بر روی این آنالایز، تحت عنوان trail draw انجام می‌پذیرد. در بهترین شکل تنظیم، صفحه مونیتور آنالایزر قادر است همزمان در حدود 200 اسپرم را آنالیز و بررسی نماید. معمولاً در غلظت تهیه شده 1061/0 اسپرم در هر میلی‌لیتر، فقط 80-50 اسپرم متحرک در هر مشاهده با یک عدسی شیئی 10 قابل رؤیت است. لذا این دستگاه با این تنظیم، قادر به مطالعه تعداد قابل توجهی اسپرم خواهد بود.
آنالایزر HST همچنین قادر است که پارامترهای متعدد حرکتی اسپرم را اندازه‌گیری نماید. (Curvilinear velocity) VCL (مجموع فواصل پیموده شده در مسیر عبور در هر تصویر تقسیم بر مجموع زمان ردیابی). VAP (Velocity Average Path)، (راه پیموده شده براساس معدل تعداد نقطه‌های بدست آمده در مسیر حرکت، تقسیم بر زمان ردیابی)، VSL (Velocity Straight Line) (فاصله مستقیم بین مسیر پیموده شده در هر ردیابی، تقسیم بر زمان هر ردیابی)، MAD (Mean Angular Displacement) معدل تغییر جهت سر اسپرم در هر تصویر)، BCF (Beat Cross Frequency)، (نقاط چرخش سر اسپرم)، LHD (Lateral Head Displacement) (معدل انحراف سر اسپرم از یک مسیر مستقیم) و Linearity LIN (فاصله خط مستقیم مسیرهای پیموده شده تقسیم بر مجموع فواصل مسیرهای پیموده شده 100). علاوه بر آن میزان اسپرمهای متحرک، غلظت و میزان درصد اسپرمهای متحرک نیز قابل اندازه‌گیری است. در این مطالعه فقط اندازه‌های اصلی تحرک اسپرم (VAP, VSL, VCL) مورد آنالیز و بررسی قرار گرفت.
آنالیز تصویری از حرکت اسپرم
حرکت اسپرم بطور جزئی‌تر و دقیق‌تر و بصورت تصویر به تصویر، توسط آنالیزر تصویری و از طریق نوار ضبط شده حرکت اسپرم، تصویربرداری گردید. این تصویرها بوسیله تسهیلات موجود در انتخاب تصویر (Improvision Ltd.) و نرم افزار آنالایزر تصویری (NIH, Washington, USA) 52/1 انجام شد. با انتخاب حداقل 10 تصویر برای هر اسپرم، حرکت واقعی هر اسپرم در مراحل مختلف بلوغ، بصورت تصویری بدست آمد. نتیجه این آزمایش قابل مقایسه با ردیابی انجام شده در مرحله قبلی آزمایش (trail draw) توسط CASA می‌باشد.
حرکت اسپرم رت در روند بلوغ خارج از بدن انکوباسیون اسپرم روی کشت سلول‌های اپیدیدیم
اسپرم ناحیه انتهایی caput و ناحیه ابتدایی Corpus اپیدیدیم رت براساس آنچه در بالا توضیح داده شد، تهیه گردید. اسپرمها بمیزان 1055 در هر میلی لیتر به مدت 24 ساعت براساس سه الگوی ذیل انکوبه شدند. الف) بطور مستقیم بر روی سلول‌های کشت داده شده اپیدیدیم. ب) داخل محیط کشت برداشته شده از کشت سلول‌های اپیدیدیم پس از 24 ساعت ج) داخل محیط کشت
آنالیز حرکت اسپرم، در مدت انجام کشت همزمان (انکوباسیون) اسپرم با سلول‌های اپیتلیال
اسپرم استفاده شده در آزمایشات فوق، توسط CASA و براساس زیر آنالیز شد: الف) همزمان با شروع انکوباسیون ب) 5/4 ساعت پس از انکوباسیون ج) 24 ساعت پس از انکوباسیون. از آنجا که بررسی حرکتی اسپرم توسط CASA در حضور سلول‌های اپیتلیال امکان پذیر نبود، لذا برای رفع این مشکل، بمیزان 30 میکرولیتر از سوسپانسیون محیط کشت حاوی اسپرم به یک پتری دیش کوچک مشابه آنچه قبلاً توضیح داده شده بود، منتقل و آنالیز انجام پذیرفت.
نمایش ردیابی حرکت اسپرم در روند انجام هم کشتی
همزمان با انجام آنالیز حرکتی اسپرم توسط CASA، نمایش ردیابی حرکت اسپرم بوسیله trail draw بدست آمد. این نمایش ترسیم کننده حرکت حداقل یک اسپرم در نواحی مزبور در روند آزمایش بود.
محاسبات آماری
اطلاعات بدست آمده به برنامه نرم افزاری آماری، (Fig. P. Software Corporation, Scientifi Figure Processor, Durham, N.C., USA) منتقل و سپس محاسبات آماری انجام گردید. محاسبات آماری برای هر کدام از پارامترهای حرکتی اسپرم (VCL, VAP, VSL) بصورت test "t" Paired انجام شد.
حرکت اسپرم رت در روند بلوغ داخل بدن آنالیز اسپرم توسط تکنیک قطره‌ای (droplet Method):
بررسی و آنالیز اسپرم از نواحی مختلف اپیدیدیم براساس آنچه توضیح داده شد، برای شش رت انجام شد. نمونه‌های برداشته شده از نواحی caput با توجه به زمان حرکت محدود اسپرم در آن ناحیه و فرصت بسیار کوتاه جهت بررسی حداقل 12 بار آنالیز شد، در حالیکه نمونه‌های برداشت شده از نواحی corpus و cauda حداقل 18 مرتبه آزمایش شد. معدل (mean) مربوط به حرکت پیشرونده اسپرم (VCL, VAP, VSL) از نواحی مختلف اپیدیدیم در شکل شماره 1 نمایش داده شده است.
آنالیز اسپرم توسط تکنیک لام و لامل (Coverslip method)
بررسی و آنالیز اسپرم از نواحی مختلف اپیدیدیم بر روی 6 رت انجام شد، همچنین 6 آنالیز از اسپرم انزال شده نیز مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. معدل (mean) مربوط به حرکت پیشرونده اسپرم (VCL, VAP, VSL) مربوط به نواحی مختلف اپیدیدیم و همچنین اسپرم انزال شده در شکل شماره 2 نمایش داده شده است.
پارامترهای حرکتی اسپرم براساس آنالیز با trail draw
بوسیله استفاده از امکان ثبت و مشاهده حرکت اسپرم trail draw بر روی HST، نمایش ردیابی حرکتی اسپرم نواحی مختلف اپیدیدیم و پس از انزال در شکل 3 تهیه شد.
این ردیابی انعکاس معدل اطلاعات حرکتی اسپرم ارائه شده در شکل 1 و 2 می‌باشد. اسپرم ناحیه ابتدایی اپیدیدیم (initial segment)، حرکت پیشرونده بسیار کمی داشت.
اسپرمهای برداشته شده از ناحیه ابتدایی و انتهایی Caput، دارای حرکت تاژکی دم، بشکل پهن آن بودند. این نوع حرکت دم منجر به حرکت پیشرونده بسیار ناچیزی برای اسپرم می‌باشد. اسپرم براشت شده از ناحیه اولیه corpus، دارای حرکت دورانی بودند.
تغییر این حرکت به سمت حرکت مستقیم و پیشرونده در اسپرم نواحی انتهایی corpus، با کاهش پهنای حرکت تاژکی دم دیده می‌شود.
اسپرم ناحیه اولیه cauda نمایش حرکتی پیشرونده کاملتری از اسپرم برداشت شده از ناحیه انتهایی cauda داشت. ولی پس از انزال، اسپرم نمایش حرکت پیشرونده کاملتری از همه نواحی اپیدیدیم داشت.
پارامترهای حرکتی اسپرم براساس آنالیز با برنامه کامپیوتری 52/1 Image
با این روش، پارامترهای حرکتی اسپرم از هر ناحیه از اپیدیدیم با استفاده از انتخاب تصاویر متناوب و منظم از فیلم ویدئویی حرکت اسپرم، بصورت انیمیشن برای مشاهده و همچنین امکان چاپ و نمایش تصویری بررسی و تهیه شد. تصاویر اسپرم از ناحیه انتهایی caput، ابتدایی و انتهایی corpus و همچنین از ناحیه انتهایی cauda در شکل 4 الی 7 بترتیب نمایش داده شده است. این اشکال و تصاویر بیانگر وجود تغییرات اساسی در حرکت اسپرم رت و در روند بلوغ آن در اپیدیدیم می‌باشد.
اسپرم ناحیه انتهایی caput (شکل 4) دارای حرکت پهن و کمانی زدن دم از ناحیه قسمت میانی دم بود.
این نوع حرکت دم، موجب حرکت بسیار کم پیشرونده و پیشرفت کم سر اسپر به سمت جلو در مقایسه تصویر 1 الی 16 بود. اسپرم ناحیه ابتدایی corpus، حتی بیش از ناحیه انتهایی caput دارای حرکت پهن زدن دم ولی بصورت سریعتر بود، که منجر به داشتن حرکت دورانی میشد (تصویر 1 الی 28 شکل5).
ولی تغییرات مشخصی در پارامترهای حرکتی اسپرم در ناحیه انتهایی corpus (تصویر 1 الی 14 شکل 6) بوجود می‌آید. این تغییرات نشان دهنده انعطاف کمتر تاژک در ایجاد حرکت پهن بود، این مساله می‌تواند بواسطه استحکام بیشتر دم اسپرم در این ناحیه باشد.
این نوع حرکت دم، موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپرم در ناحیه انتهایی cauda شده است (تصویر 1 الی 16 شکل7)، که گرفتن و نمایش تصویر این ناحیه بواسطه سرعت زیاد حرکت اسپرم بسیار مشکلتر از نواحی دیگر اپیدیدیم بود.
حرکت اسپرم رت در روند بلوغ آزمایشگاهی
آنالیز حرکتی اسپرم در مدت انکوباسیون بر روی سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم: اپیتلیال اپیدیدیم ناحیه caput و corpus براساس روش مندرج در مقاله (1). بمدت 3 روز کشت داده شد. اسپرمهای تهیه شده از نواحی مختلف اپیدیدیم جهت بررسی تأثیر هم کشتی اسپرم بر بلوغ آزمایشگاهی آن، مورد استفاده قرار گرفت. اسپرم ناحیه انتهایی و ناحیه ابتدایی corpus بر روی کشت‌های اپیدیدیم فوق کشت داده شد و همزمان آزمایشات مشابهی با انکوباسیون اسپرم نواحی فوق در محیط کشت برداشته شده از کشت سلول‌های اپیتلیوم اپیدیدیم پس از 24 ساعت از کشت (Conditioned medium) و محیط کشت به تنهایی انجام شد. حرکت اسپرم ناحیه انتهایی caput و ناحیه ابتدایی corpus با اندازه گیری بوسیله CASA در آماده سازی‌های متعدد در شکل 8 و 9 بترتیب ارائه شده است.
اسپرم ناحیه انتهایی Caput در حضور کشت اپیتلیال اپیدیدیم، بمیزان قابل توجهی افزایش حرکت را در مدت انکوباسیون از خود نشان داد.
در حالیکه در conditioned medium، اسپرم ناحیه انتهایی Caput، تنها حرکات ابتدایی را در مدت انکوباسیون از خود نشان داد و جالب توجه اینکه همین اسپرم در محیط کشت معمولی، پس از انکوباسیون بدون حرکت بود. مشاهدات بر روی هم کشتی اسپرم ناحیه ابتدایی corpus تقریباً مشابه آنچه در قسمت انتهایی caput گفته شد، بود. ولی تنها تغییرات حرکتی اسپرم در این ناحیه و در مجاورت کشت سلول‌های اپیتلیال، بسیار بهتر از ناحیه انتهایی caput بود.
در این مطالعه از یک سیستم جدید CASA، برای نمایش تغییرات حرکت اسپرم، همزمان با بلوغ آن در داخل بدن، در اپیدیدیم و پس از بلوغ و انزال و همچنین همزمان با بلوغ آن در آزمایشگاه با انکوباسیون بر روی سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم و محیط کشت، استفاده شد.
این نکته پذیرفته شده و بدیهی است که نتایج بدست آمده توسط CASA، بستگی به چگونگی تنظیم الکترونیکی آن دارد (13) و لذا می‌تواند تأثیر مشخصی را بر نتایج آنالیز بگذارد. این تنظیم الکترونیکی، مشخص کننده این مطلب است که، آیا اسپرم بخوبی توسط CASA شناسایی شده است؟ اینکه چگونه اسپرم بعنوان یک متحرک توسط CASA تشخیص داده می‌شود؟ و اینکه آیا تنظیم دقیق جهت ردیابی پارامترهای مختلف حرکتی اسپرم صورت گرفته است؟
این تنظیم الکترونیکی براساس پارامترهای عملکردی انواع مختلف CASA، متنوع و همچنین بستگی به نوع اسپرم حیوانی دارد که مورد آنالیز قرار می‌گیرد. در حال حاضر سیستم‌های متنوعی از CASA در حال ارزشیابی هستند. استراتژی مشخصی که برای ردیابی اسپرم توسط CASA استفاده می‌شود، متنوع و بستگی به امکانات و توانایی‌های استفاده ساختمانی آن دستگاه‌ها دارد.
برای HST، تنظیم دقیق براساس ردیابی بدون انقطاع اسپرم و همچنین عدم تداخل ردیابی حرکت دو اسپرم، صورت می‌پذیرد.
در CASA معمولاً بطور طبیعی از برخورد تابش نور بر سر قرینه اسپرم و با موقعیت فاز کنتراست میکروسکوپ، استفاده می‌شود. مشکل وقتی ایجاد می‌شود که اسپرم، با سر غیر قرینه، نظیر اسپرم رت مورد بررسی قرار می‌گیرد. علاوه بر آن، قطره سیتوپلاسمی که معمولاً در اسپرمهای نوحی ابتدایی اپیدیدیم و قبل از بلوغ کامل اسپرم و در کنار سر اسپرم دیده می‌شود، منجر به ارائه نتایج غیر واقعی می‌گردد. ولی با (Hobson Sperm Trachor)HST، امکان فائق آمدن بر این مشکلات، با تنظیم دقیق آستانه وجود دارد.
حرکت اسپرم به عمق نمونه تهیه شده نیز بستگی دارد (11). اگر خیلی عمیق باشد، حرکت تاژک اسپرم تغییر نموده و اسپرم در ابعاد مختلف حرکت می‌نماید ولی وقتی که اسپرم در بین لام و لامل و با عمق تقریبی m60 و در زیر روغن قرار گیرد، این عمق احتمالاً برای حرکت آزاد اسپرم بمدت نسبتاً طولانی کافی به نظر می‌رسد. اگرچه مقادیر حرکتی بطور محسوسی در اسپرم موجود در قطره محیط کشت (droplet) که عمق آن بیش از m200 است، افزایش می‌یابد.
این موضوع ممکن است بیانگر این مطلب باشد که روش لام و لامل (coverslip) موجب محدود نمودن حرکت اسپرم می‌شود. اگرچه فاکتورهای دیگری نظیر تبادلات گازی نیز ممکن است بر تحرک اسپرم اثر گذارد.
آنالیز تصویری با استفاده از trail draw و نرم افزارهای تصویری مورد استفاده در این بررسی بیانگر این مطلب است، که بلوغ حرکتی اسپرم اپیدیدیم رت در سه فاز مختلف صورت می‌پذیرد. فاز اول از ناحیه ابتدایی اپیدیدیم (Initial segment) تا ناحیه انتهایی caput، که اسپرم حرکت تنظیم نشده و غیر متقارن تاژک را بدست می‌آورد. و این یک حرکت غیر پیشرونده و با زدن دم در پهنای وسیع آن است. فاز دوم از ابتدای ناحیه corpus، و این فاز، بوسیله حرکت کاملاً دایره‌ای اسپرم شناخته شده است. این حرکت انعکاس حرکت ناقص تاژک در قسمت انتهایی دم است. حرکت دایره‌ای اسپرم برای عبور از ناحیه اتصال رحم به لوله‌ها، در اسپرم رت (8) و اسپرم هامستر (12)، کافی بنظر نمی‌رسد. فاز سوم بوسیله افزایش حرکت پیشرونده اسپرم و شروع آن از اسپرمهای ناحیه انتهایی corpus مشاهده می‌شود. تغییرات ناشی از استحکام و سختی تاژک در اسپرمهای این ناحیه، احتمالاً مربوط به اکسیداسیون پل‌های دی سولفید، در قسمت انتهایی فیبرها است. این تغییر می‌تواند زمینه حرکت پیشرونده را همچنانکه در هامستر نیز مشاهده شده است (6 و 23)، فراهم آورد.
حرکت پیشرونده می‌تواند زمینه عبور اسپرم را از اتصال رحم به لوله‌ها و نفوذ اسپرم در زوناپلوسیدا و اتصال اسپرم با ویتلوس را (22)، فراهم آورد. مطالعات دیگر نیز نشان داده است که قدرت باروری اسپرم رت در آزمایشگاه بستگی مستقیمی به VSL دارد (16).
توجه به این نکته بسیار جالب و با اهمیت است که تغییرات در حرکت اسپرم اپیدیدیم و بلوغ آن، نیز می‌تواند در آزمایشگاه انجام شود، و آن وقتی است که اسپرم اپیدیدیم در مجاورت کشت اپیتلیال اپیدیدیم قرار گیرد (2). مطالعات نشان داد که باقی ماندن اسپرم در قسمت اولیه اپیدیدیم بدلایل انسدادی، نتوانسته است موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپرم شود.
این نکته بیانگر این مطلب است که فاکتورهای مربوط به اپیتلیوم اپیدیدیم برای بلوغ اسپرم بسیار با اهمیت هستند. این ایده همچنین با انجام هم کشتی اسپرم هامستر با سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم، که نتایج مفیدی بر بلوغ حرکتی اسپرم و زنده ماندن آن در آزمایشگاه داشته‌اند، نشان داده شده است، محیط کشت برداشته شده از کشت سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم (conditioned medium) نیز برای این بلوغ مفید است و نشان دهنده این مطلب است که ترشحات اپیتلیال اپیدیدیم مسئول تأثیرات این بلوغ اسپرم هستند (16). محیط کشت به تنهایی هیچ تأثیری بر بلوغ حرکتی اسپرم نداشته و حتی امکان زنده نگه داشتن اسپرم اپیدیدیم را در مدت زمان مشابه هم کشتی‌های فوق نداشته است.
