Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Production and characterization of a murine monoclonal antibody recognizing a conformational epitope on hCG

Authors
Ali Akbar Sabooryaraghi 1
Roya Ghods 2
Fazel Shokri 2
1 Department of Biochemistry, Medical Faculty, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran
2 Department of Immunology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Abstract
Human chorionic gonadotropin hormone (hCG) belongs to glycoprotein hormones family. Other members of this family include follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and thyroid stimulating hormone (TSH). All these hormones consist of a common alfa and a distinct beta subunit. There is a strong similarity between the members of these hormones. Therefore, detection and quantitative measurment of these hormones require production of monoclonal antibodies specific for non-overlapping epitopes on the beta chain or a conformational epitope specific for each hormone. In this study a murine monoclonal antibody against the hCG dimer molecule was produced by hybridoma technology. The specificity of the antibody was assessed by ELISA and Immunoblotting using a panel of highly purified and recombinant forms of glycoprotein hormones including: native hCG and hLH, recombinant hCG, hCG, hCG, hCG carboxyl terminal peptide covering amino acid residues 109-145 (hCG-CTP), recombinant TSH and native FSH, as well as urine proteins (UP). It was found that the monoclonal antibody reacted with, dimer recombinant and urine purified hCG and hLH, but not with the reduced form of the hormone, nor with recombinant hCG, hCG, TSH, native FSH and UP. Using hCG-CTP fragment with different concentrations to monitor inhibition of hormone – monoclonal antibody interactions, no interference was observed. This implies that the epitope recognized by the monoclonal antibody is different from that presented by hCG–CTP. These results suggest that the monoclonal antibody recognizes a conformational epitope located at the dimer form of hCG molecule and closely associated with the beta subunit of the hormone.
Keywords
epitope mapping
Glycoprotein hormones
hCG
Monoclonal antibody

مقدمه

هورمون hCG تنها عضو خانواده هورمون های گلیکوپروتئینی است که توسط جفت ترشح می شود. سایر هورمون های این خانواده شامل FSH,LH و TSH از غده هیپوفیز ترشح می شوند (1). هر یک از اعضا این خانواده از دو زیر واحد آلفا و بتا تشکیل شده اند که زیر واحد آلفا در تمام این هورمون ها یکسان و از 92 اسیدآمینه ساخته شده است ولی زیر واحد بتای هر هورمون با هورمون دیگر متفاوت است. با این وجود بین زیر واحد بتای هورمون hCG (hCG) و بتای هورمون hLH (hLH) بیش از 80 درصد همولوژی وجود دارد. در حقیقت تنها تفاوت اساسی hCG و hLH وجود یک قطعه پپتیدی واقع در انتهای کربوکسیل زیر واحد hCG بنام hCG-CTP است که شامل اسیدهای آمینه 145-115 می باشد. این قطعه فقط درزیر واحد hCG وجود دارد و زیر واحد hLH فاقد آن است (2و1).

hCG و سایر هورمون های گلیکوپروتئینی ملکول های غنی از پیوندهای دی سولفیدی بوده، بطوریکه زیر واحدهای آلفا و بتای هورمون hCG به ترتیب دارای 5و6 پیوند دی سولفیدی در ساختمان خود هستند (3و2).

اخیراً مقالات مروری در مورد انواع اشکال متابولیکی، ضرورت و اهمیت بالینی اندازه گیری، روش های سنجش ایمونولوژیکی هورمون hCG و متابولیت های آن به چاپ رسیده است (5و4). سنجش و تشخیص ایمونولوژیکی hCG با آنتی سرم یا آنتی بادی پلی کلونال دارای مشکلات زیادی است که مهمترین آن وجود واکنش متقاطع بین اعضاء خانواده هورمون های گلیکو پروتئینی است که بنوبه خود مربوط به یکسان بودن زیر واحد آلفا در این هورمون ها و شباهت نسبی زیر واحدهای بتا است. یکی از راههای بالقوه در جهت برداشتن این مشکل تولید آنتی بادی منوکلونال علیه اپی توپهای اختصاصی برای این هورمون ها است.

این اپی توپها ممکن است بصورت خطی و پیوسته (Continuous) و یا بطور غیر پیوسته (Discontinuous) باشد (9). اپی توپهایی نیز شناخته شده اند که اسیدهای آمینه سازنده آنها قسمتی بر روی یک زیر واحد و قسمتی بر روی زیر واحد دیگر هورمون وجود دارد. اینگونه اپی توپ ها را که وابسته به ساختمان سوم و چهارم پروتئین هستند، اصطلاحاً اپی توپ های فضایی (Conformational) می نامند. به استثناء دو اپی توپ پیوسته و خطی که در ناحیه انتهای کربوکسیلی مولکول hCG (hCG-CTP) و بخشی از دو جایگاه آنتی ژنی که در زیر واحد آلفا وجود دارد، اپی توپ هایی که درمولکول hCG وجود دارند از نوع غیر پیوسته و وابسته به ساختمان سوم و چهارم ملکول hCG و زیر واحدهای آن است (7و6).

در این پژوهش یک آنتی بادی منوکلونال موشی علیه هورمون hCG تولید شده و خصوصیات این آنتی بادی مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

- ایمونیزاسیون:

ایمونیزاسیون بروی موش های ماده نژاد Balb/C با سن 8-6 هفته انجام و hCG تخلیص شده از منبع ادراری به عنوان ایمونوژن استفاده شد. تزریق hCG به این موش ها در سه نوبت انجام گرفت، در نوبت اول 40 میکروگرم آنتی ژن با ادجوانت کامل فروند U.S.A) Sigma,) بداخل صفاق موش تزریق شد. تزریقات دوم وسوم با فاصله 3 هفته و مقدار 20 میکروگرم آنتی ژن به همراه ادجوانت ناقص فروند U.S.A) Sigma,) و بصورت داخل صفاقی انجام گرفت. حدود 2 تا 3 هفته پس از سومین تزریق از موشها خونگیری به عمل آمد و حیوان دارای بیشترین تیتر آنتی بادی برای انجام فیوژن انتخاب و سه روز قبل از فیوژن 20 میکروگرم از آنتی ژن محلول در بافر سالین بصورت داخل وریدی به حیوان مورد نظر تزریق شد.

- تکثیر و آماده سازی سلول های میلوما:

یک هفته قبل از فیوژن سلول های میلومای موشی با نام SP2/O در محیط کشت کامل حاوی محیط DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle's Medium,Gibco,U.S.A) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو

(Fetal bovine serum,Gibco,U.S.A)FCS و آنتی بیوتیکهای پنی سیلین G (U/L 100000 ) و استرپتومایسین (mg/L 100) (U.S.A Sigma,) و اسیدآمینه ال- گلوتامین، در انکوباتور 37 درجه با 5 درصد CO2 و رطوبت اشباع، تکثیر شدند. هنگامیکه رشد سلول ها به فاز لگاریتمی رسید و تعداد سلولهای زنده به بیش از 95 درصد رسید از آنها برای فیوژن استفاده شد.

- فیوژن وتولید سلول های هیبریدوما:

سلولهای طحال موش ایمن شده بیرون آورده

شد و با استفاده از پلی اتیلن گلیکول (, Sigma, U.S.A 50% (PEG 1000 با سلول های میلومای موشی SP2/0 بانسبت 1:7 با روش استاندارد ادغام شدند (10). سلول های بدست آمده از این فیوژن در محیط کشت کامل DMEM حاوی 20 درصد سرم جنین گاو قرار داده شد و سپس سلول ها با پی پت هم زده شد تا بطور یکنواخت پراکنده شود. این سلول ها در پلیت های 96 حفره ای (Nunc,Denmark) تقسیم شدند. پلیت ها در انکوباتور با 5 درصد Co2 و حرارت 37 درجه سانتیگراد و رطوبت اشباع به مدت یک روز قرارگرفتند. سپس50 میکرولیتر از محیط انتخابی HAT حاوی هپیوگزانتین3-10*5 مولار، آمینوپترین 5-10×2 مولار و تیمیدین4-10×8 مولار Sigma,U.S.A) HAT,50X,) به آنها اضافه شد. حفرات سلولی به فاصله چند روز یکبار با محیط انتخابی HAT تعویض محیط شدند.

- غربالگری و کلونینگ هیبریدها:

محلول رویی (سوپرناتانت) پلیت 96 حفره ای حاوی سلول های هیبرید در حال رشد از نظر تولید آنتی بادی مورد آزمون قرار گرفت. سلول های هیبرید مثبت، پایدار و مولد آنتی بادی با استفاده از روش رقت محدود کننده (Limiting dilution) چند مرتبه کلون شدند و هر بار بهترین حفرات از نظر تولید آنتی بادی و تراکم سلولی انتخاب و تا حصول اطمینان از تک کلون شدن هیبریدها، عمل کلونینگ ادامه داده شد. تک کلون انتخابی تکثیر و از پلیت 96 حفره ای به پلیت 24 حفره ای (Nunc,Denmark) وسپس فلاسک های 50 میلی لیتری (Nunc,Denmark) انتقال داده و به تعداد کافی جمع آوری و در ازت مایع نگهداری شد.

- تعیین مشخصات آنتی بادی منوکلونال:

تعیین مشخصات آنتی بادی منوکلونال با استفاده از روشهای الایزا و ایمونوبلاتینگ مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. یک مجموعه از هورمونهای بسیار خالص و نیز شکل نوترکیب آنها شامل hCG طبیعی CG-B,Sigma,U.S.A)) و hLH طبیعی (Seradyn,U.S.A ) و هورمونهای نوترکیبhCG,hCG,hCG,TSH hCG-CTP, (Sigma,U.S.A) وFSH طبیعی (Seradyn, U.S.A) در این بررسی مورد استفاده قرار گرفت.

1- آزمون الایزا برای تعیین ویژگی آنتی بادی منوکلونال ترشحی ضد hCG

ابتدا محلول حاوی 2 میکروگرم در میلی لیتر هر آنتی ژن را در بافر PBS 15/0 مولار و 2/7=pH تهیه کرده و 50 میکرولیتر از آن را به حفرات میکروپلیت الایزا(Maxi sorp,Nunc,Denmark) اضافه شد. پلیت های مذکور 90 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند و سپس با بافر شستشو ](بافر PBS حاوی 05/0 درصد توئین 20 (Merck,Germany)[ سه مرتبه شسته شدند. در لایه دوم از 50 میکرولیتر سوپ روئی سلول های مولد آنتی بادی یا 50 میکرولیتر از آنتی بادی تخلیص شده با غلظت 4-2 میلی گرم در میلی لیتر استفاده شد و پس از 90 دقیقه انکوباسیون در37درجه سانتی گراد و شستشوی پلیت ها با بافر شستشو، برای آشکار کردن آنتی بادیهای منوکلونال متصل به آنتی ژن از کونژوگه پراکسید از ضدایمونوگلوبولین موش (HRP-Sheep anti mouse-Ig) (Sigma, U.S.A) با رقت 1:1000 استفاده شد. پس از 90 دقیقه انکوباسیون و شستشوی مجدد از سوبسترای O-Phenylenediamine(OPD, Sigma, U.S.A)به منظور تولید رنگ استفاده شد. پس از 15-10 دقیقه واکنش با اسید سولفوریک 20 درصد متوقف و (Optical Density)OD حاصل با استفاده از دستگاه (Organon Teknika, Reader 210 ,Austria) Elisa Reader در طول موج 492 نونامتر تعیین و نتایج ثبت شد.

2- آزمون الایزا برای تشخیص ایمونوگلوبولین ترشحی موش :

سوپ حفرات حاوی هیبریدهای در حال رشد از نظر تولید مجموع آنتی بادیهای موشی با روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا 50 میکرولیتر آنتی بادی تصفیه شده گوسفند ضد ایمونوگلوبولین موش ( تولید شده در آزمایشگاه آقای دکتر شکری) با غلظت 10 میکروگرم در میلی لیتر در بافر PBS 15/0 مولار و 2/7=pH در حفرات الایزا قرارگرفت. پس از شستشوی حفرات با بافر شستشو ، 50 میکرولیتر از سوپ حفرات سلول های هیبرید به پلیت اضافه شد. ادامه آزمون الایزا مشابه روش ذکر شده در قسمت قبل انجام گرفت.

3- بررسی تاثیر مهاری پپتید hCG-CTP بر اتصال hCG به آنتی بادی منوکلونال:

ابتدا 50 میکرولیتر از هورمون hCG نوترکیب با غلظت 2 میکروگرم در بافر PBS در حفرات الایزا تثبیت شد. سپس کونژوگه پراکسید ازآنتی بادی منوکلونال تولید شده علیه hCG با رقت 1:750 موارد فوق باشد. اضافه شد ( این کونژوگه بروش پرآیودات در آزمایشگاه دکتر شکری تولید شده است). قبل از اضافه کردن کونژوگه؛ به مدت 2 ساعت این کونژوگه با پپتید (Sigma,U.S.A)hCG-CTP با غلظت های 10،5،5/2،25/1و61/0 میکروگرم در میلی لیتر در دمای 37 درجه انکوبه شد. در حفرات کنترل کونژوگه مورد نظر بدون مجاورت با پپتید استفاده شد و میزان مهار آنتی بادی توسط هورمون hCG با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

4- تعیین ایزوتیپ آنتی بادی منوکلونال بروش الایزا:

ابتدا آنتی بادی های ضد زیر کلاس های IgA,IgG3,IgG2b,IgG2a,IgG1 و IgM موشی که از بز تهیه شده اند Sigma, U.S.A)) با رقت مناسب در پلیت الایزا تثبیت شدند. سپس سوپ مربوط به آنتی بادی منوکلونال به همه حفرات اضافه شد.شرایط آزمون الایزا و ادامه آزمون مشابه مراحل مورد 1 در بالا می باشد.

5- ایمونوبلاتینگ:

فعالیت و ویژگی آنتی بادی منوکلونال با استفاده از روش استاندارد ایمونوبلاتینگ (11) مورد ارزیابی قرار گرفت. بطور خلاصه ابتدا آنتی ژن های طبیعی خالص ویا نوترکیب با روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) با استفاده از ژل 5/12 درصد الکتروفورز شد. این آنتی ژنها قبل از الکتروفورز به دو گروه تقسیم شدند. گروه اول بدون احیاء پیوندهای دی سولفیدی موجود در ساختمان آنها و گروه دوم همان آنتی ژنها با احیاء پیوندهای دی سولفیدی به کمک ترکیب احیاء کننده 2- مرکاپتواتانول 2ME)) الکتروفورز شدند. هر دو گروه آنتی ژن ها در بافر Tris-Hcl یک مولار و pH=7 حاوی SDS و رنگ بروموفنل بلو و ساکاروز 80 درصد حل شدند. و قبل از الکتروفورز به مدت 3-2 دقیقه جوشانیده شده و سپس به چاهک های ژل الکتروفورز منتقل و الکتروفورز با جریان حداکثر و ولتاژ 150 ولت انجام شد. پس از الکتروفورز، پروتئین ها از داخل ژل به کاغذ نیترات سلولز (Schleicher & Schuell,Germany) منتقل شد. عمل انتقال با استفاده از دستگاه الکتروبلاتینگ (شرکت اختریان ، ایران) و در طول شب با ولتاژ ماکزیمم و شدت جریان 60 میلی آمپر انجام گرفت. با رنگ آمیزی کاغذ نیترات سلولز بارنگ پانسو-S (Ponceau S stain,Gelman,U.S.A) با غلظت 5/0 گرم در لیتر، در بافرPBSمحل انتقال باندها مشخص و ردیف های مربوط به هر آنتی ژن با تیغ بریده و شمارگذاری شد. سپس رنگ پانسو S با بافر PBS شسته شد. به منظور بلوکه کردن نواحی فاقد پروتئین در ورقه نیترات سلولز و پیشگیری از واکنش غیر اختصاصی از شیر خشک فاقد چربی (Skim Milk,Merck,Germany) با غلظت 5/2 گرم درصد استفاده شد سپس آنتی ژنهای روی کاغذ نیترات سلولز بمدت 120 دقیقه باسوپ حاوی آنتی بادی منوکلونال بر روی شیکر مجاور شدند. پس از 5 بار شستشو با PBS هر بار به مدت 5 دقیقه روی شیکر، کاغذهای نیترات سلولز با کونژوگه پراکسید از ضد ایمونوگلوبولین موش (Sigma, U.S.A. (HRP-Sheep anti mouse-Ig, با رقت 1:500 به مدت90 دقیقه مجاور و سپس 5 بار با PBS شسته شدند. تشکیل اتصال آنتی ژن- آنتی بادی با استفاده از 25 میلی گرم سوبسترای دی آمینوبنزیدین (DAB hydrochloride.Sigma, U.S.A.) در 50 میلی لیتر با فرTris – Hcl 05/0 مولار و 6/7 =PH بهمراه 150 میکرولیتر محلول 3 درصد H2O2 ظاهر شد. پس از ظهور باندها و اکنش با شستشوی کاغذ نیترات سلولز با آب مقطر متوقف گردید.

- تهیه آسیت و تشخیص آنتی بادی منوکلونال با روش الکتروفورز استات سلولز:

4-3 میلیون از سلول های هیبریدومای مولد آنتی بادی را با 5/0 میلی لیتر از محیط DMEM بدون سرم مخلوط کرده و بداخل صفاق موش Balb/C تزریق گردید. موشها یک هفته قبل از تزریق سلول 5/0 میلی لیتر ماده پریستین (Pristane,Sigma,U.S.A.) بطور داخل صفاقی دریافت کرده بودند. 15-10 روز پس از تزریق سلول ها، مایع آسیت در زیر صفاق موش جمع شد که پس از کشتن موش در شرایط استریل از صفاق خارج و به داخل لوله استریل منتقل و پس از سانتریفوژ، مایع رویی بعنوان مایع آسیت که منبع غنی از آنتی بادی است جمع آوری و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. سلول های تکثیر شده در صفاق موش نیز فریز و نگهداری شدند. مایع آسیت با استفاده از روش استاندارد الکتروفورز استات سلولز، الکتروفورز شد. بطور خلاصه نمونه مایع آسیت بروی کاغذ استات سلولز (Helena,U.S.A) قرار گرفت و با استفاده از منبع تغذیه و تانک الکتروفورز (شرکت اختریان ، ایران) و بافر باربیتال سدیم 03/0 مولار و 6/8=PH با ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقیقه عمل الکتروفورز انجام شد. سپس کاغذ استات سلولز به مدت 10 دقیقه در رنگ پانسو-S قرار گرفت و بعد از آن سه مرتبه هر بار 2 دقیقه در داخل محلول رنگبر (اسید استیک 5 درصد) رنگ آن حذف گردید. در مرحله بعد کاغذ استات سلولز بمدت 5 دقیقه در متانول خالص آبگیری شد و سپس 10 دقیقه در محلول شفاف کننده(Clearaid, Helena,U.S.A.) قرار گرفت و بالاخره کاغذ استات سلولز در انکوباتور 60-50 درجه سانتیگراد خشک شد.

-تعیین تیتر آنتی بادی منوکلونال در مایع آسیت با روش الایزا:

مشابه آزمونهای قبل hCG با غلظت 2 میکروگرم در میلی لیتر در پلیت الایزا تثبیت شد. سپس مایع آسیت در رقت های متوالی از 1:250 تا 1:106 به حفرات پلیت اضافه و به مدت 90 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. همزمان از سرم موش ایمن نشده با رقت های متوالی از 1:50 تا 1:2000 به عنوان کنترل منفی استفاده شده است مشابه روش الایزا در قسمتهای قبل ادامه آزمون انجام گرفت.

نتایج

- ایمونیزاسیون حیوانات:

تیتراسیون سرم موش های ایمن شده با hCG طبیعی نشان داد که تمام حیوانات پس از دریافت سومین دوز آنتی ژن، آنتی بادی با تیتر مناسب تولید کرده اند. منحنی تیتراسیون سرم یکی از موش ها در مقایسه با موش ایمن نشده در شکل (1) نشان داده شده است.

شکل (1): منحنی تیتراسیون سرم موش ایمن شده با هورمون hCG و مقایسه آن با موش ایمن نشده

- تولید و انتخاب هیبریدومای مولد آنتی بادی ضد hCG

پس از غربالگری اولیه، از بین هیبریدهای در حال رشد یکی از آنها که با hCG و اکنش مثبت قوی نشان داده و با پروتئین های ادراری UP)) واکنش نداشت انتخاب و پس از کلون و ساب کلون کردن ویژگی آن مورد بررسی بیشتر قرار گرفت. سوپ کلون مورد نظر با یک سری کامل از آنتی ژن های خالص وهمچنین اشکال نوترکیب هورمونهای گلیکوپروتئینی با آزمون الایزا و ایمونوبلاتینگ مورد بررسی قرارگرفت و نتایج حاصل در جدول (1) آمده است.

- بررسی ویژگی آنتی بادی منوکلونال ضد hCG با آزمون الایزا

نتایج الایزا نشان داد که آنتی بادی منوکلونال بدست آمده با hCG تخلیص شده از منبع ادرار و hCG نوترکیب بیشترین واکنش را دارد و با سایر هورمونهای گلیکوپروتئینی به استثناء hLH واکنش نمی دهد (جدول 1).

پاسخ این آنتی بادی منوکلونال با هورمون FSH و شکل نوترکیب TSH تقریباً صفر است. از طرفی آنتی بادی منوکلونال بدست آمده با زیر واحدهای آلفا و بتای نوترکیب هورمون hCG به تنهایی پاسخ نمی دهد.

- تعیین ایزوتیپ آنتی بادی منوکلونال:

آزمون الایزا مربوط به تعیین ایزوتیپ آنتی بادی تولید شده نشان داد که این آنتی بادی دارای زیر کلاس IgG1 می باشد (جدول 2).

- بررسی اثرمهاری hCG-CTP بر واکنش هورمون با آنتی بادی منوکلونال

نتایج مربوط به بررسی اثر مهاری پپتید hCG-CTP بر اتصال hCG به آنتی بادی منوکلونال تولید شده نشان داد که انکوباسیون این قطعه پپتیدی در غلظت های متفاوت با کونژوگه پراکسیداز آنتی بادی منوکلونال تاثیر مهاری برواکنش هورمون hCG با آنتی بادی منوکلونال ندارد (جدول 3).

مطالعه ویژگی آنتی بادی منوکلونال ضد hCG با روش ایمونوبلاتینگ:

آنتی ژنهای اصلی بکار رفته در آزمون الایزا، در ایمونوبلاتینگ نیز مورد استفاده قرارگرفتند. نتایج ایمونوبلاتینگ نشان میدهد که آنتی بادی منوکلونال بدست آمده در گروه اول آنتی ژن ها که شامل هورمونهای احیاء نشده است، فقط با شکل دایمر hCG و hLH طبیعی و hCG نوترکیب واکنش می دهد. این آنتی بادی منوکلونال هیچگونه واکنشی با فرم احیاء شده هورمونها نشان نداده است (شکل 2).

شکل 2- الگوی ایمونوبلاتینگ آنتی بادی منوکلونال ضد hCG با اشکال احیاء نشده (ردیف های 1 الی 6 ) و احیاء شده( ردیف های 7 الی 11) هورمونهای گلیکوپروتئینی که به ترتیب شامل : 1- UP (پروتئین های ادرار)،2- hCG تخلیص شده از ادرار، 3- hCG نوترکیب، 4- hLH طبیعی، 5- FSH طبیعی، 6- TSH نوترکیب، 7- hCG تخلیص شده از ادرار،8- hCG نوترکیب،9- hLH طبیعی،10- FSH طبیعی، 11- TSH نوترکیب

- تشخیص وجود آنتی بادی منوکلونال در مایع آسیت و تتراسیون آن:

با تزریق 6 میلیون سلول به 2 موش Balb/C حدود 3 میلی لیتر مایع آسیت بدست آمد. الگوی الکتروفورز استات سلولز مایع آسیت وجود باند قوی مربوط به آنتی بادی منوکلونال را در ناحیه گاما نشان میدهد (شکل 3). تیتراسیون مایع آسیت باآزمون الایزا نشان داد که مایع آسیت تا رقت 106 :1 قادر است جذب نوری نسبتاً خوبی ناشی از اتصال آنتی بادی با آنتی ژن داشته باشد که بیانگر غلظت و آفینیتی بالای آنتی بادی در مایع آسیت است.

الگوی الکتروفورز استات سلولز آسیت در ناحیه ایمونوگلوبولین ها نیز یک باند قوی را نشان میدهد (شکل 4) که نتایج تیتراسیون مایع آسیت را تائید می کند.

شکل 3- الگوی الکتروفورز استات سلولز پروتئین های مایع آسیت حاوی آنتی بادی منوکلونال ضد hCG

شکل 4- منحنی تیتراسیون مایع آسیت موش

بحث

چنانچه پروتئین بیگانه ای در معرض سیستم ایمنی قرار گیرد، همة اجزاء و اپی اتوپهای آن می توانند مورد شناسایی قرار گرفته و علیه آنها آنتی بادی تولید شود. بنابراین تمرکز تولید آنتی بادی علیه بعضی از شاخصهای آنتی‏ژنیک بر روی یک مولکول پروتئین که اصطلاحاً آنها را اپی‏توپهای غالب می‏نامند، مطلق نبوده و بستگی به ساختار پروتئین و زمینه‏های ژنتیکی حیوان پاسخ دهنده دارد (12).

این اصل کلی در مورد هورمونهای گلیکوپروتئینی نیز مصداق دارد و آنتی‏بادیهای مونوکلونال مختلفی علیه این هورمونها تولید و از آنها جهت مطالعه جایگاههای آنتی‏ژنی و تهیه نقشه جغرافیایی اپی‏توپهای

این هورمونها استفاده شده است (13،9،6). این مطالعات نشانداده است که سه نوع اپی‏توپ اصلی در تمام هورمونهای گلیکوپروتئینی انسان قابل شناسایی است. گروهی از اپی‏توپها فقط در زیر واحد آلفای این هورمونها قرار دارد و از آنجائیکه زیر واحد آلفا در تمام این هورمونها مشترک است، آنتی‏بادیهای مونوکلونال تولید شده علیه این اپی‏توپها با سایر هورمونهای این خانواده واکنش متقاطع دارند. گروه دوم، اپی‏توپهایی هستند که منحصراً در زیر واحدهای بتای این هورمونها قرار دارند و لذا آنتی‏بادیهای تولید شده علیه این اپی‏توپها غالباً اختصاصی بوده و با سایر هورمونهای این خانواده واکنش متقاطع ندارند. گروه سوم اپی‏توپهایی هستند که قسمتی از آنها در زیر واحد آلفا و قسمتی در زیرواحد بتای این هورمونها قرار دارد و یا اینکه کلاً بروی یک زیر واحد قرار داردولی بروز آنها نیاز به شکل فضایی طبیعی آن زیر واحد و یا اتصال دو زیر واحد آلفا و بتا دارد و به همین دلیل به اپی‏توپهای فضایی معروف هستند (13، 8-6). کلیه اپی‏توپهای فوق‏الذکر بروی هورمون hCG نیز مطالعه و شناسایی شده است. اخیراً در مطالعاتی که توسط Nagy و همکارانش (13) انجام گرفته چندین آنتی‏بادی مونوکلونال علیه hCG و زیرواحدهای آن تولید شده است. این آنتی‏بادیها بر اساس نوع اپی‏توپ مورد شناسایی به گروه های متفاوتی تقسیم‏بندی شده‏اند که شامل آنتی‏بادیهای مونوکلونال علیه زیرواحد آلفا، زیرواحد بتا، و شکل دایمر و یا آنتی‏بادیهای که بطور مشترک فرم دایمر و آلفا و یا فرم دایمر و بتا را شناسایی می‏کنند. این دانشمندان با استفاده از روش ایمونوبلاتینگ نشان دادند که در اثر احیاء hCG با ماده 2-مرکاپتواتانل (2ME) باندهای دی‏سولفیدی در هر دو زیرواحد آلفا و بتا باز شده و آن گروه از آنتی‏بادیهای منوکلونالی که اپی‏توپهای فضایی را شناسایی می‏کنند قدرت شناسایی خود را از دست داده و قادر به اتصال به هورمون احیاء شده نیستند. این یافته‏ها قبلاً توسط دانشمندان دیگر نیز گزارش شده است (18،17). از طرفی اپی‏توپهای خطی و فضایی متفاوت و گاهی منحصر بفردی توسط محققین مختلف شناسایی و گزارش شده است که در بازشناسی ساختار هورمون و تعیین نقشة جغرافیایی اپی‏توپهای آن بسیار مفید و مؤثر بوده است (9-6).

در این پژوهش ویژگی یکی از آنتی بادیهای منوکلونال انتخابی که برعلیه هورمون hCG تولید شده و اپی توپ فضایی جالب توجهی را شناسایی می کند مورد مطالعه قرارگرفته است. نتایج مربوط به الایزا نشان داد که این آنتی بادی منوکلونال با فرم دایمر hCG طبیعی و نوترکیب واکنش قوی دارد ولی با هیچکدام از زیر واحدهای الفا و بتای هورمون به تنهایی واکنش نمی دهد. بنابراین اولین نتیجه منطقی در مورد این آنتی بادی این است که یک اپی توپ وابسته به ساختمان سوم و چهارم پروتئین را شناسایی می کند. از طرفی نتایج الایزا نشانداده است که این آنتی بادی با FSH طبیعی و TSH نوترکیب هیچگونه واکنش متقاطعی ندارد، لذا دومین نتیجه منطقی این است که زیر واحد آلفا به تنهایی در شکل فضایی خود برای شناسایی این آنتی بادی منوکلونال کافی نیست و حضور هر دو زیر واحد آلفا وبتا (شکل فضایی دایمر) ضروری است. از طرفی این آنتی بادی منوکلونال با هورمون hLH واکنش متقاطع دارد (جدول 1). این مسئله نشان میدهد که چون تنها اختلاف hLH و hCG وجود قطعه پپتیدی واقع در انتهای کربوکسیل زیر واحد hCG است، لذا اپی توپ مربوط به این آنتی بادی منوکلونال احتمالاً در ناحیه hCG-CTP قرار ندارد، چرا که اگر اپی توپ مورد شناسایی در این ناحیه قرار می گرفت آنتی بادی منوکلونال بدست آمده با hLH واکنش متقاطع نداشت (16-14). نتایج بدست آمده از الایزای مربوط به اثر مهاری قطعه پپتیدی انتهای کربوکسیل (hCG-CTP) بر اتصال آنتی بادی منوکلونال به hCG در جدول (3). این استنتاج را تائید کرده است. نتایج این الایزا نشان میدهد که حتی غلظت های بالای پپتید hCG-CTP تا 10 میکروگرم در میلی لیتر تاثیری در مهار واکنش آنتی ژن – آنتی بادی ندارد. مطالعات قبلی نشانداده است که اپی توپ های موجود در ناحیه hCG-CTP فقط از نوع خطی و پیوسته بوده و سایر اپی توپ های hCG عموماً از نوع غیر پیوسته هستند (8-6). عدم واکنش این آنتی بادی با قطعه پپتیدی حاوی اسیدهای آمینه

119-109 که مربوط به قسمت انتهایی کربوکسیل هورمون hCG است نیز این نظر را تائید می کند (جدول 1). اپی توپهای مشترکی که بروی هر دو مولکول hCG و hLH بروز می یابند نیز قبلاً توسط دانشمندان دیگر شناسائی گزارش شده است (18).

نتایج مربوط به ایمونوبلاتینگ، نتایج آزمون الایزا را تائید و برصحت نتیجه گیریهای فوق تاکید میکند. نتایج ایمونوبلاتینگ نشان میدهد که آنتی بادی منوکلونال بدست آمده با آنتی ژن hCG و hLH احیاء نشده پاسخ داده و باندهای قوی در ایمونوبلاتینگ ایجاد میکند اما هورمونهای فوق هنگامیکه با استفاده از ترکیب 2ME احیاء میشوند وباندهای دی سولفیدی درون ملکولی از هم گسستهمیشود و شکل فضایی هورمون از بین می رود دیگر با آنتی بادی منوکلونالتولید شده واکنشی نمی دهند.

عدم وجود واکنش با هورمونهای FSH طبیعی و TSH نوترکیب و پروتئین های ادراری (UP) نیز در ایمونوبلاتینگ تائید شده است. استفاده از پروتئین های ادراری بدین منظور انجام شده است تا احتمال واکنش غیر اختصاصی آنتی بادی باپروتئین های ناخالص درهورمون های hCG و FSH که از ادرار تخلیص شده اند منتفی گردد.

شباهت زیاد بین ساختمان اول هورمونهای hCG و hLH منجر به شباهت بین اشکال طبیعی این دو هورمون نیز شده است بطوریکه برای هر دو هورمون فوق یک نوع گیرنده وجود دارد. بنابراین اثرات بیولوژیکی این دو هورمون بسیار بهم شبیه بوده به همین دلیل در درمان اختلالات ناباروری مربوط به کمبود LHو یا در القاء تخمک گذاری(LH surge) از داروی hCG استفاده می شود. با توجه به چنین شباهت ساختمانی از آنتی بادی منوکلونال تولید شده می توان در پیشگیری از اتصال هورمون به گیرنده و در نتیجه خنثی نمودن اثرات بیولوژیکی مربوط به این دو هورمون در تحقیقات پیش گیری از اثرات هورمون hCG در بارداری و موارد مشابه استفاده کرد. از طرفی به دلیل وجود مقادیر بسیار جزئی hCG در سرم افراد طبیعی و خانم های غیر باردار می توان این آنتی بادی را در سنجش هورمون hLH نیز بکار گرفت. از

آنتی بادی های منوکلونال علیه hCG در تشخیص های بالینی متعددی نظیر تشخیص بارداری و اختلالات مربوط به آن ، بیماریهای تروفوبلاستیک و نیز تشخیص انواع سرطانها و تومورهای غیر تروفوبلاستیک می توان استفاده کرد (19). از طرفی در تشخیص به موقع بارداریهای نابجا و تشخیص قبل از تولد سندرم دان و بیماریهای متعدد دیگر این آنتی بادیها قابل استفاده هستند (21و20).

در خاتمه نتایج بدست آمده در مورد آنتی بادی منوکلونال تولید شده در این پژوهش بشرح زیر جمع بندی می شود:

1- این آنتی بادی منوکلونال اختصاصاً هورمون hCG راشناسایی نموده و به استثناء هورمون hLH با سایر هورمونهای گلیکو پروتئینی وپروتئین های ادراری واکنش متقاطع ندارد.

2- این آنتی بادی منحصراً شکل دایمر هورمون hCG و hLH را شناسایی کرده و با زیر واحدهای هورمون به تنهایی واکنشی ندارد.

3- این آنتی بادی یک اپی توپ غیر پیوسته و فضایی وابسته به زیر واحد بتا را در ملکول hCG شناسایی نموده که بروز آن به حضور هر دو زیر واحد آلفا و بتای هورمون بطور همزمان نیاز دارد.

تشکر و قدردانی

از راهنمائیها و ارشادات سرکار خانم دکتر فاطمه کرمی تهرانی و پیشنهادات و انتقادات سازنده جناب آقای دکتر جواد رسایی ازگروه بیوشیمی دانشگاه تربیت مدرس سپاسگزاری می نماید. همچنین از استاد ارجمند جناب آقای دکتر محمود جدی تهرانی از پژوهشکده ابن سینا و سرکار خانم قرگزلو، جناب آقای خشنودی و سرکار خانم روحی از بخش ایمونولوژی دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران بدلیل ارائه کمک های علمی و عملی ارزنده صمیمانه تشکر و قدردانی می نماید. بخش عمده ای از هزینه های مالی این مطالعه توسط معاونت پژوهشی وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی تأمین شده است. که بدینوسیله از آن معاونت محترم سپاسگزاری می نماید. از زحمات خانم سلیمی و خانم اسکندری از واحد نشریات پژوهشکده ابن سینا نیز تشکر و قدردانی می شود.

  1. Cole L.A. hCG, its free subunits and its metabolites, roles in pregnancy and trophoblastic disease. J Reprod Med. 1998, 43: 3-10.
  2. Pierce JG, parsons TF. Glycoprotein hormones: structure and function. Ann Rev Biochem. 1981, 50:465-95.
  3. Lapthorn A J, Harris DC, et al. Crystal structure of human chorionic gonadotropin. Nature. 1994, 369:455-61.
  4. Sturgeon CM, McAllister, EJ. Analysis of hCG: Clinical applications and assay requirement. Ann Clin Biochem.1998, 35:460-91.
  5. Cole LA. Immunoassay of human chorionic gonadotropin, its free subunits, and metabolites, Clin Chem. 1997, 43:2233-43.
  6. Berger P, Bidart, J M, et al. Immunochemical mapping of gonadotropins, Mol Cell Endocrinol. 1996, 125:33-43.
  7. Berger P, Klieber R, et al. Monoclonal antibodies against the free subunits of human chorionic gonadotropin. J Endocrinol. 1990, 125: 301-9.
  8. Venketesh N, Krishnaswamy, S, et al. Epitope analysis and molecular modeling reveal the topography of the C-terminal peptide of the ?-subunit of human chorionic gonadotropin. Eur J Biochem. 1999, 265:1061-6.
  9. Bidart JM. Functional mapping of proteins with monoclonal antibodies. In: Gosling, J. P. and Reen, D.J(eds). Immunotechnology, portland press, U.K. 1993, 77-89.
  10. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antiboby of predefined specificity. Nature. 1975, 256:495-7.
  11. Gharagozloo S, Sharifian RA, et al. Analysis of the expressed immunoglobulin variable region heavy chain gene products in paraproteins from Iranian patients with multiple myeloma, Pathol Oncol Res. 2000, 6:185-90.
  12. Benjamin DC, Berzofsky JA, et al. The antigenic structure of proteins: A Reappraisal. Ann Rev Immunol. 1984, 2:67-101.
  13. Nagy AM, Vanbellinghen AM, et al. Epitope mapping on intact, heated and reduced molecular variants of human chorioric gonadotrophin. Mol Cell Endocrinol. 1996, 122:51-7.
  14. Caraux J, Chichehian B, et al. Non cross-reactive monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin generated after immunization with a synthetic peptide. J Immonol. 1985, 134:835-40.
  15. Bidart JM, Bellet DH, et al. The immune response to a synthetic peptide analogous to the 109-145 ?hCG carboxyl terminus is directed against two major and two minor regions. Mol Immunol. 1987, 24:339-45.
  16. Bellet D, Bidart JM, et al. A monoclonal antibody against a synthetic peptide is specific for the free native human chorionic gonadotropin ?- subunit. Endocrino. 1984, 115:330-6.
  17. Bidart JM, Tralen F, et al. Immunochemical mapping of a specific domain on human choriogonadotropin using anti-protein and anti-peptide monoclonal antibodies. J Biol Chem. 1987, 262:15483-9.
  18. Ehrich PH, Mostapha Z, et al. Characterization and relative orientation of epitopes for monoclonal antibodies and antisera specific for human chorionic gonadotropin. Am J Reprod Immunol Microbiol. 1985, 8:48-54.
  19. Alfthan H, Stenman U. Pathophysiological importance of various molecular forms of human choriogonadotropin. Mol Cell Endocrinol. 1996, 125:107-120.
  20. Ankum WM. Diagnosing suspected ectopic pregrancy.Biomed J. 2000, 321:1235-6.
  21. Kornman LH, Morssink LP, et al. Maternal urinary ?- core hCG in chromosomally abnormal pregnanies in the first trimester. Prenat Diagnos. 1997, 17:135-9.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 1, Issue 4
Autumn 2000
Pages 44-54