استرس اکسیداتیو در علم زیست شناسی به‌طور کلی برای بیان شرایطی به کار می رود که میزان اکسیدانتها بالا باشد و یا میزان آنتی اکسیدانتها در سلول کم باشد؛ این شرایط بگونه ای است که در آن غلظت رادیکال های آزاد اکسیژن بالاتر از سطوح بیولوژیک می باشد (1،2). تغییرات اکسیداتیوی اجزاء سلول در طی اثر رادیکال های آزاد اکسیژن یکی از فرآیند های آسیب رسان بالقوه بسیار مخرب در عملکرد سلول است که ممکن است منجر به مرگ سلول از طریق نکروز یا مرگ برنامه‌ریزی شده گردد (3،4). در شرایط کشت آزمایشگاهی، غلظت اکسیژن در مقایسه با شرایط داخل بدن به مراتب بیشتر است و این امر سبب افزایش تولید رادیکال های آزاد اکسیژن در شرایط کشت آزمایشگاهی می شود (5). رادیکال های آزاد اکسیژن در محیط کشت می توانند رشد جنینی، میزان آبستنی کلینیکی و سطح باروری را تحت تاثیر قرار دهند. در هر دو برنامه لقاح خارج رحمی (IVF) و تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) ، مشخص شد که بالا بردن غلظت ROS در محیط کشت در روز اول با کاهش میزان بارداری ارتباط دارد (6). با رعایت این مسئله، در برنامه های لقاح آزمایشگاهی– انتقال جنین انسان، این نظریه وجود دارد که در حضور غلظت بالای اکسیژن در سیستم کشت آزمایشگاهی تعداد جنین های با کیفیت رشد خوب کم خواهد بود (8-6). Yoneda و همکاران اثرات افزایش غلظت اکسیژن و H2O2 را بر کیفیت جنین گزارش کرده و نشان دادند که کاهش سطح H2O2 در شرایط محیط کشت موجب بهبود کیفیت جنین در مرحله بلاستوسیست می شود (9،10). علاوه بر این، ارتباط مستقیم بین غلظت بالای پراکسید هیدروژن و بالا رفتن درجه فراگمانتاسیون یا مرگ برنامه‌ریزی شده در جنین های موش نشان داده شده است (8،11). Wang و همکاران گزارش کردند که افزودن آنتی اکسیدانها نسبت تکوین بلاستوسیست را در جنین های موش بهبود می بخشد (12). Catt و همکاران نشان دادند که استفاده از آنتی اکسیدان در محیط کشت باعث بهبود نسبت باروری و افزایش لانه‌گزینی می شود (11).
اثرات تخریبی رادیکال های آزاد توسط سیستم آنتی‌اکسیدان درون سلولی مانند گلوتاتیون، اسید آسکوربیک و آنزیم هایی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز کنترل و یا مهار می گردد (13). با این وجود به نظر می رسد که در شرایط کشت آزمایشگاهی جنین‌های پستانداران، میزان تولید این رادیکال های آزاد بیش از ظرفیت آنتی اکسیدانی این جنینها می باشد؛ لذا به منظور غلبه بر این عدم تعادل اکسیدانی انواع آنتی اکسیدان های با منشا خارجی پیش بینی و ارائه گردیده اند (14). از سوی دیگر به نظر می رسد که توان دفاع آنتی اکسیدانتی جنین‌های آزمایشگاهی در مقاطع مختلف تکوین تا مرحله بلاستوسیست متفاوت باشد. گروهی از محققین معتقدند که ظرفیت اصلی آنتی اکسیدانی جنینها در مراحل اولیه تقسیمات زیگوت وابسته به ذخیره mRNA مادری به ارث رسیده درون تخمک می باشد و تدریجاً در مرحله فعالیت ژنوم جنینی (ZGA) است که ژنوم جنین قادر به فعالیت متقابل در مقابل اکسیدان‌های تولید شده درون سلول و یا محیط کشت می‌گردد. لذا به نظر می رسد که نیاز خاص جنین به آنتی‌اکسیدان های خارجی در مقاطع قبل و بعد از فعال شدن ژنوم زایگوت متفاوت باشد (15).
اگرچه آنتی اکسیدان های با منشا خارجی نقش بسیار مهمی در تقویت ظرفیت آنتی اکسیدانی سلول های زنده دارند، عدم نفوذ پذیری سلول های زنده نسبت به اکثر این آنتی اکسیدانها مانع عملکرد مناسب آنها در حذف رادیکال های آزاد تولید شده در درون سلولها می شود (14). لذا در دهه اخیر تلاش‌های زیادی در جهت تولید آنتی اکسیدان های سنتتیک قابل جذب و یا نفوذپذیر انجام پذیرفته است. تمپول (TEMPOL) یک ملکول کوچک قابل نفوذ به داخل سلولی سوپراکسید دیسموتاز میمتیک است و باعث تقلیل آنیون سوپراکساید و پراکسی نیتریت ایجاد کننده آماس می‌گردد. ولی تاکنون هیچ گزارشی مبنی بر توان این آنتی‌اکسیدان‌های سنتتیک در افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی جنین های آزمایشگاهی ارائه نگردیده است. لذا با توجه به اهمیت فوق‌العاده افزایش کیفیت و کمیت تولید جنین های آزمایشگاهی، مطالعه اخیر به عنوان اولین مطالعه در نوع خود، به بررسی اثر آنتی اکسیدانی ماده تمپول به عنوان یک آنتی اکسیدان سنتتیک در طی کشت آزمایشگاهی جنین های موش سوری در شرایط تنش‌اکسیداتیو می پردازد.
مواد و تجهیزات: برای تهیه محیط کشت HTF (Sigma, USA)، PMSG (Folligon, Netherland)، hCG (Folligon, Netherland)، BSA (Sigma, USA)، پتریدیش cm6 (Falcon, USA)، روغن معدنی (Sigma, USA)، هیدروژن پراکسید (H2O2) (Sigma, USA)، تمپول (Sigma, USA)، پی پت پاستور بلند (Normax، Portugal)، لوله ml5 و 10 (Falcon, USA، BD)، انکوباتور CO2 (LEEC, England)، استریومیکروسکوپ (Olympus, Japan)، میکروسکوپ اینورت (Olympus, Japan) مواد مورد نیاز می‌باشد.
برای انجام این مطالعه از موش های سوری نژاد NMRI ماده بارور جوان 10-6 هفته ای و نر 12-8 هفته که از موسسه پاستور تهیه و در مرکز پرورش و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی بخش جنین شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه نگهداری می شدند استفاده شد که در شرایط استاندارد با دمای C2±22، رطوبت 60-30% و با سیکل نوری، 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی نگهداری می شدند. آب و غذا به صورت آزاد در دسترس بود.
این مطالعه روی جنین های حاصل از لقاح آزمایشگاهی صورت گرفت که نیاز به تحریک تخمک گذاری دارد و به شرح زیر صورت گرفت:
تزریق 5/7 واحد هورمونPMSG به حجم ml1/0 و 48-46 ساعت بعد تزریق 5/7 واحد هورمون hCG به حجم ml1/0 به روش داخل صفاقی صورت گرفت. عمل تخمک‌گذاری معمولاً 12-10 ساعت بعد از تزریق hCG صورت می گیرد.
لقاح آزمایشگاهی: ابتدا برای تهیه اسپرم، موش نر را به روش جابجایی گردن کشته و بعد از جدا کردن بافت های همبندی اطراف دم اپیدیدیم را همراه با مقداری از کانال دفران از بیضه جدا کرده و در داخل پتریدیش cm6 حاوی محیط کشت HTF حاوی mg/ml BSA4، که قبلاً جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شده بود قرار داده و بعد از ایجاد چند برش در دم اپیدیدیم و فشار در کانال دفران برای خروج اسپرمها در داخل انکوباتور CO2 گذاشته شد. بعد از 5/0 ساعت اسپرمها خارج و در محیط پخش شدند، سپس اسپرمها را شستشو داده و با استفاده از روش شناورسازی اسپرم‌های متحرک را جدا نموده و جهت ظرفیت یابی، اسپرمها به مدت یک ساعت در انکوباتور CO2 با دمای C37 قرار داده شدند (16).
تخمک گیری و لقاح داخل آزمایشگاهی: 12-10 ساعت پس از تزریق hCG (صبح روز بعد) بعد از کشتن حیوان به روش جابجایی گردن، لوله های رحمی را جدا کرده و در داخل محیط کشت HTF حاویBSA (Sigma, USA)mg/ml 4 و حاوی Hepes، 37 درجه از قبل آماده شده قرار داده شد و با استفاده از روشهای آنزیمی و مکانیکی تخمکها را از سلول‌های گرانولوزا جدا نموده و پس از شستشو تخمکها را به قطرات محیط لقاح در زیر روغن معدنی حاوی محیط کشت HTF حاوی mg/ml BSA4 منتقل کرده و سپس اسپرمها را به تعداد یک میلیون به ازای هر میلی لیتر محیط کشت، اضافه شد. عمل لقاح حدود 6-5 ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم صورت می گیرد و بدین ترتیب زیگوت به دست آمد (16).
گروه‌های آزمایشی: در ادامه تحقیق زیگوت های شستشو داده شده حاصل از لقاح آزمایشگاهی در محیط کشت HTF حاوی mg/ml BSA4 به طور تصادفی در گروه های مختلف آزمایشی تقسیم گردید که بعد از شستشو در دو قطره از محیط کشت گروه مربوطه به تعداد 20 جنین در داخل قطرات l100 در زیر روغن معدنی کشت داده شدند. جهت ایجاد استرس اکسیداتیو در زیگوتها از افزودن غلظت‌های مختلف هیدروژن پراکسید (H2O2) به محیط کشت و انکوباسیون به مدت یک ساعت استفاده شد سپس زیگوتها به قطرات کشت گروه های مختلف منتقل شدند و در مراحل بعدی ارزیابی جنینها صورت گرفت.
گروه های آزمایشی مورد مطالعه
- گروه کنترل که زیگوتها تنها در محیط کشت HTF حاوی mg/ml4 BSA کشت داده شدند.
- گروه هایی که زیگوتها جهت ایجاد تنش اکسیداتیو به مدت یک ساعت در محیط کشت حاوی غلظت های پراکسید هیدروژن M5،10،25 و50 کشت داده شدند.
- گروه هایی که به محیط کشت غلظت‌های M1/0، 2/0، 5/0، 1، 10 تمپول اضافه شد.
- گروه هایی که زیگوتها ابتدا جهت ایجاد تنش اکسیداتیو در آنها به مدت 1 ساعت در محیط کشت حاوی 10 میکرومول پراکسیدهیدروژن کشت داده شده و در مرحله بعدی به محیط کشت های حاوی غلظت‌های M1/0، 2/0، 5/0، 1، 10 تمپول منتقل شدند.
ارزیابی رشد جنینها: برای ارزیابی تاثیر تنش اکسیداتیو و اثر آنتی اکسیدانتی مواد مذکور در زیر میکروسکوپ فاز کنتراست مراحل رشد جنینی مورد ارزیابی قرار گرفت، بررسی میزان تسهیم 36 ساعت بعد از کشت صورت گرفته و در زیگوت های موجود در هر گروه، جنینها از نظر میزان فراگمانتاسیون و میزان طی مراحل رشد جنینی یا تعداد جنین های متوقف شده و مرفولوژی جنین های متوقف شده با توجه به فاکتورهای مختلفی نظیر لیز شدن جنینها و نکروتیک بودن آنها و فراگمانتاسیون و وجود وزیکول‌های سیتوپلاسمی مقایسه گردیدند. درجه بندی جنین های متوقف شده به شرح ذیل می باشد: درجه I جنین های دارای بلاستومرهای لیز، فراگمانته شدن و نکروتیک بودن کامل، درجه II جنین های با لیز و فراگمنته شدن در تعدادی از بلاستومرها، درجه III جنین های با تعداد کمی بلاستومرهای لیز و فراگمانته و ویزیکول سیتوپلاسمی (17).
کیفیت جنینها و تعداد جنین های رشد کرده، درصد جنین‌های دوسلولی، میزان جنین های متوقف شده و درصد بلاستوسیست های ایجاد شده در طی 120 ساعت در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین برای بررسی کیفیت رشد جنینی و میزان تسهیم بلاستوسیست های بدست آمده در گروه های مختلف، شمارش تعداد سلولی به ازای هر جنین با استفاده از روش air dry technique of Tarkowski صورت پذیرفت (18).
لازم به ذکر است آزمایش‌های هر گروه در 5 مرحله تکرار شد و مجموع نتایج حاصل از این 5 مرحله مورد آنالیز آماری قرار گرفت. آنالیز آماری داده ها توسط نرم افزار Minitab (Minitab Co., USA) و روش مقایسه نسبتها با 05/0p< مورد آنالیز قرار گرفت و نتایج به صورت درصد در نمودارها و جدول مربوطه آورده شد و مقایسه تمایز و تعداد سلول‌های موجود به ازای هر جنین بین گروه‌های مختلف توسط نرم افزار SPSS (IBM Co. USA) ویرایش 16 و روش آماری One way ANOVA و تست تعقیبی Tukey با 05/0p< مورد مقایسه قرار گرفته و میانگین و انحراف معیار آنها به‌دست آمده و در نمودار مربوطه آورده شد.
نتایج حاصل از افزودن غلظت های مختلف تمپول به محیط کشت در شرایط عادی و بدون تنش اکسیداتیو و مقایسه کیفیت رشد جنینها با گروه کنترل نشان داد، افزودن تمپول به محیط کشت باعث افزایش کیفیت رشد جنینها و مورفولوژی آنها شد (شکل 1- ب). بررسی اثر تمپول بر درصد جنین های دو سلولی در مقایسه با گروه کنترل نشان داد در حضور تمپول در محیط کشت درصد جنین های دو سلولی در مقایسه با گروه کنترل افزایش داشت که این افزایش از نظر آماری فقط در غلظت 5/0 میکرومول تمپول معنی دار بود (جدول 1). مقایسه درصد بلاستوسیستها نشان داد، افزودن تمپول به محیط کشت جنینها باعث افزایش قابل توجه و کاملا معنی دار درصد بلاستوسیستها در مقایسه با گروه کنترل شده است و این افزایش در غلظت‌های M2/0، 5/0، 1 و 10 تمپول کاملاً قابل توجه بوده و از نظر آماری معنی دار بود (جدول 1). نتایج حاصل از شمارش سلولها به ازای هر جنین نشان داد افزودن تمپول سبب افزایش کاملاً معنی دار تعداد سلولها به ازای هر جنین در مقایسه با گروه کنترل می‌شود که این نشان دهنده تاثیر مثبت افزودن تمپول بعنوان یک آنتی‌اکسیدانت به محیط کشت جنینی روی افزایش کیفیت رشد جنینها و تسهیم بوده است (جدول 1). مقایسه درصد جنین های متوقف شده نشان داد که افزودن غلظت های مختلف تمپول باعث کاهش کاملا معنی‌دار تعداد جنین های متوقف شده در مقایسه با گروه کنترل می شود و جنین‌های متوقف شده در حضور تمپول اکثراً از درجه III با لیز و فراگمانتاسیون کم در مقایسه با گروه کنترل می باشد و این کاهش توقف جنین و درجه توقف جنینی از نظر آماری کاملاً معنی دار بوده که نشان می دهد افزودن تمپول سبب کاهش میزان لیز و فراگمانته شدن شده است (جدول 3).
نتایج حاصل از قرار دادن جنینها در معرض غلظت های مختلف آب اکسیژنه سبب ایجاد توقف در جنینها در مرحله یک سلولی و دو سلولی شد که این توقف در غلظت های پایین (M5 و 10) اکثراً از درجه II یا III با میزان لیز و فراگمانتاسیون کم بود (شکل 1- و). در غلظت های بالای آب اکسیژنه (M25 و50) میزان بالای توقف جنینی مشاهده شد که اکثراً از درجه I و تعدادی از درجه II با میزان لیز و فراگمانتاسیون بالا با رشد بسیار کم بودند، به طوریکه در غلظت M50 درصد زیادی از جنینها در مرحله یک سلولی متوقف، لیز و فراگمانته بودند (جدول 4). تنها درصد خیلی کمی از آنها تا مراحل اولیه تقسیم پیشرفت داشتند و به مراحل بالاتر تقسیم و رشد جنینی پیش نرفته بودند (شکل1- د).
مقایسه درصد جنین های دو سلولی ایجاد شده که نشان دهنده شروع تسهیم است نشان داد در گروه هایی که تنش اکسیداتیو توسط افزودن غلظت های مختلف آب اکسیژنه ایجاد شده بود کاهش کاملاً معنی داری در مقایسه با گروه کنترل وجود دارد و این کاهش در گروه های با غلظت‌های بالای آب اکسیژنه کاملاً محسوس بود به طوری که در غلظت M25 تنها 68/9% و در غلظت M50 تنها 53/2% جنینها تا مرحله دوسلولی و بالاتر پیش رفته بودند (جدول 2). مقایسه درصد بلاستوسیستها با گروه کنترل نشان داد پس از
قرار گرفتن جنینها در معرض استرس اکسیداتیو درصد بلاستوسیستها به میزان قابل توجه و کاملاً معنی‌داری کاهش پیدا کرده بود. به خصوص در غلظت های بالا که این کاهش بسیار بالا بود، به طوری که در غلظت M50 هیچگونه بلاستوسیستی ایجاد نشد (جدول 2) و بلاستوسیست‌های ایجاد شده در غلظت های پایین تر آب اکسیژنه نیز از لحاظ مورفولوژی طبیعی نبودند (تصویر 1- و).
نتایج حاصل از شمارش سلولی نشان داد که میانگین تعداد سلولها به ازای هر جنین در گروه هایی که جنینها در معرض غلظت‌های مختلف آب اکسیژنه قرار گرفته بودند کاهش معنی داری را در مقایسه با گروه کنترل نشان می داد و این کاهش با افزایش غلظت آب اکسیژنه بیشتر می شد (جدول 2).
مطالعه اثر افزودن تمپول به محیط کشت جنینی در شرایط تنش اکسیداتیو با قرار دادن آنها به مدت یک ساعت در معرض M10 آب اکسیژنه در محیط کشت و در ادامه، کشت آنها در محیط کشت حاوی غلظت های مختف تمپول نشان داد که تمپول تا حدودی موجب مهار آسیب های ناشی از تنش اکسیداتیو گردیده و باعث افزایش درصد جنین های دو سلولی، در مقایسه با گروه تنش اکسیداتیو شده است؛ ولی این تفاوت از نظر آماری معنی دار نبود (جدول 2). مقایسه درصد بلاستوسیستها نشان داد افزودن تمپول سبب افزایش درصد بلاستوسیستها در شرایط تنش اکسیداتیو می شود ولی این افزایش از نظر آماری معنی‌دار نمی باشد (جدول 2). مقایسه نتایج حاصل از شمارش سلولی نشان داد، تمپول سبب افزایش تعداد سلولها به ازای هر جنین در شرایط تنش اکسیداتیو شده است (جدول 2) و بیانگر این است که تمپول سبب بهبود کیفیت رشد و میزان تسهیم در جنین های کشت داده شده در شرایط تنش اکسیداتیو شده و تا حدودی توانسته آسیب های ناشی از تنش اکسیداتیو را کاهش دهد. بررسی جنین های متوقف شده نشان داد، تمپول باعث کاهش درصد جنین های متوقف شده گردید؛ ولی این تفاوت از نظر آماری معنی دار نبود. مطالعه درجه جنین های متوقف شده براساس میزان لیز و فرگمانتاسیون آنها نشان داد، میزان لیز و فراگمانتاسیون جنین های متوقف شده در شرایط تنش اکسیداتیو در حضور تمپول کاهش معنی داری را داشت (جدول4). بررسی مورفولوژی بلاستوسیستها نشان داد افزودن تمپول هم در شرایط تنش اکسیداتیو و هم در شرایط بدون تنش اکسیداتیو سبب بهبود مورفولوژی بلاستوسیست های ایجاد شده گردید (شکل 1- هـ).
تنش اکسیداتیو در نتیجه عدم تعادل بین تولید رادیکال‌های آزاد و ظرفیت دفاع آنتی اکسیدانی در یک سلول ایجاد می‌شود. انواع رادیکال های آزاد اکسیژن شامل آنیون‌سوپراکسید (.(O2، رادیکال هیدروکسیل OH.)) و مشتقات غیررادیکالی از اکسیژن مانند پراکسیدهیدروژن (H2O2) بوده که به شدت ناپایدارند و به طور سریع و غیراختصاصی با مولکول های زیستی واکنش نشان داده و منجر به ایجاد و توسعه انواع آسیب های سلولی از جمله پراکسیداسیون غشاء پلاسمایی، اکسیداسیون اسیدهای آمینه و نوکلئیک، آپوپتوزیس و نکروز می شوند که خود در نهایت منجر به کاهش قدرت زیست پذیری و تکوین جنین های آزمایشگاهی می گردد (19،20). رادیکال های آزاد اکسیژن می توانند هم از منابع داخل سلولی نظیر گامتها و یا از منابع خارج سلولی و فاکتورهای محیطی تولید شوند به عنوان مثال در روند انجام روشهای کمک باروری (ART) رادیکال‌های آزاد اکسیژن می توانند در طول آماده کردن اسپرم در محیط کشت تولید شوند و یا ممکن است در داخل جنین افزایش یابند و یا می توانند در کشت داخل آزمایشگاهی ایجاد گردند (7). افزایش در میزان رادیکال های آزاد اکسیژن بر روی غشاء سلول، DNA و میتوکندریها موثر است و به نظر می رسد این تاثیر به عنوان واسطه ای باشد تا آبشار آپوپتوزی را از تنظیم خارج کند (19). شواهد فراوان نشان می دهد که سطوح بالای آب اکسیژنه بسته به غلظت آن سبب مرگ برنامه‌ریزی شده و نکروز در گونه های مختلف سلول‌های سوماتیک می شود (22-20، 7).
نتایج این مطالعه نشان داد که توان رشد جنین در مراحل اولیه پیش از لانه گزینی پس از قرار گرفتن کوتاه مدت در معرض رادیکال های آزاد اکسیژن به شدت کاهش یافته است. نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر با نتایج حاصل از سایر مطالعات صورت گرفته در این زمینه مطابقت دارد. همچنین مشخص شد که دزهای بالای رادیکال های آزاد اکسیژن در محیط کشت تاثیرات بیشتری را سبب می شوند و از یک حد آستانه غلظت به بالا تاثیر کامل بوده و مانع رشد جنین و یا سبب حالت های غیر طبیعی شدید می شود که نشانگر وابسته به غلظت بودن رشد جنین در ارتباط با رادیکال های آزاد می‌باشد. به طوری که در این مطالعه مشاهده شد قرار دادن جنینها به مدت یک ساعت قبل از کشت در محیط حاوی غلظت های مختلف آب اکسیژنه باعث ایجاد آسیب در جنین‌های پیش از لانه گزینی گردیده است به طوری که جنین‌هایی که در معرض غلظت M50 آب اکسیژنه قرار گرفتند اکثر جنینها فاقد قدرت تسهیم و رشد بودند و تنها درصد خیلی کمی از آنها تا مراحل اولیه رشد جنینی پیش رفته و دچار لیز و فراگمانته شدن شده بودند (تصویر1-D). ولی در غلظت‌های پایین آب اکسیژنه (M5 و 10) تاثیرات کمتر بوده و باعث کاهش تسهیم و رشد جنینها و کاهش کیفیت جنینها و مورفولوژی آنها شد؛ هر چند که درصدی از این جنینها تا مرحله بلاستوسیست پیش رفتند؛ ولی در مقایسه با گروه کنترل این درصد خیلی پایین بوده و بلاستوسیست های حاصله از نظر مورفولوژی نیز حالت غیر طبیعی را نشان دادند (تصویر1- و).
اثرات تخریبی رادیکال های آزاد توسط سیستم آنتی‌اکسیدان درون سلولی مانند گلوتاتیون، اسید آسکوربیک و آنزیم هایی مانند سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) کنترل و یا مهار می گردد (13). با این وجود به نظر می رسد که در شرایط کشت آزمایشگاهی جنین های پستانداران، میزان تولید این رادیکال‌های آزاد بیش از ظرفیت آنتی اکسیدانی جنینها می‌باشد. لذا به منظور غلبه بر این عدم تعادل اکسیدانی انواع آنتی اکسیدان های با منشا خارجی پیش بینی و ارائه گردیده‌اند (14). از سوی دیگر به نظر می رسد که توان دفاع آنتی اکسیدانی جنین های آزمایشگاهی در مقاطع مختلف تکوین تا مرحله ی بلاستوسیست متفاوت باشد. گروهی از محققین معتقدند که ظرفیت اصلی آنتی اکسیدانی جنینها در مراحل اولیه تقسیمات زیگوت وابسته به ذخیره mRNA مادری به ارث رسیده درون تخمک است و تدریجاً در مرحله فعالیت ژنوم جنینی است که ژنوم جنین قادر به فعالیت متقابل در مقابل اکسیدان های تولید شده درون سلول و یا محیط کشت می باشد. لذا به نظر می رسد که نیاز خاص جنین به آنتی اکسیدان های خارجی در مقاطع قبل و بعد از ZGA متفاوت باشد (15).
مکانیسم های دفاعی متعددی در جنین و محیط پیرامونی احاطه کننده آن وجود دارد. در بدن به نظر می رسد تخمک و جنین در برابر استرس اکسیداتیو بواسطه پاک‌کننده های اکسیژنی موجود در مایعات فولیکولی و اویدوکت محافظت می شوند. اگرچه علل بسیار مختلفی برای کیفیت پائین روند تولید آزمایشگاه ی جنین گزارش گردیده است به نظر می‌رسد که تولید رادیکال های آزاد اکسیژن (ROS)، به عنوان یکی از علل اصلی توقف رشد جنین های کشت داده شده در آزمایشگاه است. بر اساس گزارش‌های موجود ROS می‌توانند، باعث توقف میوزی در تخمک، مهار تکوین جنین و مرگ سلولی شوند. برای مقابله با اثرات سوء ROS در سیستم کشت جنینی تا کنون از آنتی‌اکسیدان‌های گوناگونی استفاده شده است (13،4). نتایج حاصل از مطالعات اخیر نشان داد که تمپول به عنوان یک نیتروکسید قابل نفوذ از غشاء سلول که عملکردی مشابه SOD دارد (23). در مطالعه‌ای که توسط Garner و همکاران صورت گرفت نشان داد که افزودن تمپول به مایع منی گاو سبب افزایش میزان بقا و قدرت زیست پذیری اسپرم در شرایط نگهداری آن در محیط داخل آزمایشگاه می‌شود (24). در مطالعه دیگری که توسط Lindenmann و همکاران صورت گرفت نشان داد که افزودن تمپول به عنوان یک نیتروکسید قابل نفوذ از غشاء سلول که عملکردی مشابه SOD دارد سبب افزایش بقا تحرک در اسپرم های منجمد شده گاو می شود (25). در مطالعه‌ای که روی نگهداری اسپرم بوقلمون در شرایط محیط ازمایشگاهی صورت گرفت نشان داد که افزودن تمپول بقای اسپرم را افزایش می دهد (26).
در مطالعه‌ای که توسط Mara و همکاران صورت گرفت نشان داد که نمونه های اسپرمی قوچ که به آنها تمپول افزوده شده بود و به مدت 24، 48 و 72 ساعت در دمای C15 نگهداری شده بودند میزان تحرک و کیفیت تحرک بهتری (از نظر نوع تحرک)، در مقایسه با گروه کنترل داشته‌اند و همچنین نشان داد که با اضافه کردن تمپول به محیط کشت اسپرم، میزان باروری و تعداد بلاستوسیستها افزایش یافت (27).
در شرایط کشت آزمایشگاهی جنینها میزان تولید رادیکال‌های آزاد بیش از ظرفیت آنتی اکسیدانی آنها می‌باشد؛ لذا به منظور غلبه بر این عدم تعادل اکسیدانی از انواع آنتی‌اکسیدان‌های با منشاء خارجی استفاده می‌شود که به علت نفوذپذیری کم سلول‌های زنده به اکثر این آنتی اکسیدانها، مانع عملکرد مناسب آنها در از بین بردن رادیکال‌های آزاد تولید شده در درون جنین می‌شود به این منظور در این پژوهش از آنتی اکسیدان سنتتیک تمپول جهت حذف رادیکال‌های آزاد تولید شده در داخل سلول استفاده شد که نفوذ پذیری بیشتری به داخل سلول داشت و نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزودن تمپول به عنوان آنتی اکسیدانتی سینتتیک با قابلیت نفوذپذیری بالا به داخل سلول توانسته در شرایط طبیعی بدون شرایط تنش اکسیداتیو باعث بهبود و افزایش کیفیت جنین، افزایش درصد جنین های دو سلولی که بیانگر شروع تسهیم در جنین است، افزایش درصد بلاستوسیست و افزایش تعداد سلولها در جنینها بعد از کشت در محیط کشت های حاوی غلظت های مختلف تمپول شود که نشان می دهد افزودن تمپول به عنوان یک آنتی اکسیدانت سینتتیک با قدرت نفوذپذیری بالا به محیط کشت جنین می‌تواند بسیار مفید باشد. همچنین نتایج حاصل از افزودن تمپول به محیط در شرایط تنش اکسیداتیو در جنین هایی که قبل از کشت به مدت یک ساعت در داخل محیط کشت حاوی M10 آب اکسیژنه کشت داده شده بودند نشان داد که تمپول تاثیر کمی در بهبود کیفیت و روند رشد جنینها در شرایط تنش اکسیداتیو داشته است.
در مطالعه ای که Li و همکاران بر روی جنین خرگوش در شرایط تنش اکسیداتیو با جنینها در 20% اکسیژن انجام داده بودند نشان دادند که افزودن غلظت های mM001/0 تا 1/0 تمپول تاثیر کمی بر روند رشد جنینها داشته است و تفاوت معنی داری را با گروه کنترل نداشت و نشان دادند که غلظت‌های بالاتر از mM1 تمپول دارای اثرات سمیت سلولی داشته است (28). مطالعه حاضر نیز نشان داد که افزودن غلظت های پایین تمپول (کمتر از mM 01/) دارای تاثیرات کمتری در بهبود روند رشد جنین ها در شرایط تنش اکسیداتیو داشته است که به نظر می رسد ناشی از این باشد که آسیب های جنینی حاصل از قرار دادن جنینها در غلظت mM10 آب اکسیژنه اندازه ای بوده است که اثر آنتی‌اکسیدانتی تمپول نتوانسته است این آسیبها را جبران نماید. تاثیرات آنتی اکسیدانتی تمپول در شرایط عادی و بدون تنش اکسیداتیو مشخص تر و معنی دارتر از شرایط تنش اکسیداتیو بوده است. بنابراین افزودن تمپول جهت بهبود روند رشد جنین و جلوگیری از اثرات مخرب رادیکال های آزاد اکسیژن به محیط کشت های جنینی توصیه می شود.
یافته های این مطالعه نشان می دهد افزودن تمپول به عنوان یک آنتی اکسیدانت سینتیک به محیط کشت جنینی سبب بهبود روند رشد جنینها در شرایط کشت داخل آزمایشگاهی می شود.
بدین وسیله از تمام عزیزانی که در انجام این تحقیق ما را یاری نموده اند به ویژه جناب آقای دکتر آراز رابری و خانمها دکتر سحر غفاری، دکتر سمیرا ابراهیم زاده و دکتر کیانا کارگر کمال تشکر و قدردانی را داریم.
