مقدمه

گزارشات جهانی بیانگر این واقعیت است که از هر پنج زوج یک زوج نابارور می‏باشند و علت یک سوم و گاهی50% موارد مربوط به عوامل مردانه می‏شود(1،2).

نتایج تحقیقات مختلف نشان می‏دهد که بعضی از مکانیسم‏های پاتوفیزیولوژیک در مردان نابارور با عفونت مایع منی (باکتریواسپرمی) ارتباط دارد. عفونت می‏تواند به طور مستقیم موجب کاهش غیرطبیعی تعداد اسپرماتوزوئید مایع منی، کاهش تحرک و تغییرات مورفولوژی در اسپرم شود و نتیجتاً قدرت باروری را کاهش دهد. همچنین تأثیر غیرمستقیم عفونت، آسیب به بیضه، التهاب و بدنبال آن تحریک سیستم ایمنی بر علیه آنتی‏ژنهای خودی همراه با لکوسیتواسپرمی می‏باشد، که همگی عواملی هستند که مرد را دچار معضل ناباروری می‏کنند (6-3).

نیسن و همکاران گزارش کرده‏اند که بعضی از باکتریها در ایجاد ناباروری مردان اثر مستقیم دارند، که در این میان نقش اوروپلاسما اورولتیکم و اشرشیاکلی در تغییر عملکردهای اسپرماتوزوئید بویژه تحرک آن آشکار و مسلم شده است(7).

هر چند مطالعات مختلف نشان می‏دهند که عفونتهای دستگاه ادراری ـ تناسلی از قبیل اورتریت، اپیدیمیت و پروستاتیت به عنوان عامل اصلی ایجاد باکتریواسپرمی ممکن است با گذشت زمان به ناباروری منجر شود (7،8)، اما نتایج برخی دیگر از مطالعات نشان می‏دهد که عفونت‏های مجرای تناسلی نمی‏تواند منشاء باکتریواسپرمی بوده و کیفیت اسپرم را تحت تأثیر قرار دهد(9). بعلاوه گزارشهای دیگری اعلام کرده‏اند، ممکن است عفونت‏های علامت‏دار مجرای تناسلی موجب پیدایش باکتریواسپرمی شود و در نتیجه کیفیت اسپرم را تغییر دهد؛ درحالیکه عفونتهای بدون علامت این دستگاه، قدرت تغییر پارامترهای اسپرم را ندارند(10،4). کاتل و همکاران اعلام می‏دارند که مایع منی به طور طبیعی استریل می‏باشد؛ بنابراین احتمال دارد که باکتریواسپرمی نتیجه اورتریت‏های بدون علامت، وجود فلور طبیعی پیشابراه یا باکتریهای هم سفره پوست باشد که در زمان خروج منی آن را آلوده می‎کنند(18).

وجود لکوسیت در مایع منی (پیواسپرمی) می‏تواند نقش مهمی در کاهش پارامترهای کیفی مایع انزال ایفا کند و از طرفی علامت مناسبی در تعیین عفونت دستگاه تناسلی باشد. آرید و همکاران عنوان می‏دارند که وجود لکوسیت در مایع منی نشان‏دهنده عفونت آن است و افراد دچار اورتریت، دارای لکوسیت بیشتر در مایع منی خود می‏باشند(12). وجود لکوسیت به میزان

106×1 در هر میلی‏لیتر مایع منی نشان دهنده پیواسپرمی است و می‏تواند اخطار دهنده عفونت دستگاه تناسلی باشد(2).

هدف از این مطالعه بررسی پنج گونه باکتریایی عامل عفونت‏های دستگاه ادراری ـ تناسلی (استرپتوکوک پیوژن، آنتروکوک، اشرشیا کلی، استافیلوکوک کوآگولاز مثبت و منفی) در پیشابراه و مایع منی دو گروه از مردان بارور (شاهد) و نابارور(مورد) و تعیین ارتباط بین اورتریت‏های بدون علامت با باکتریواسپرمی می‏باشد. بعلاوه ارتباط گونه باکتریائی جدا شده و پیواسپرمی را مورد سنجش قرار می‏دهد.

مواد و روشها

مردانی که در 6 ماهه اول 1380 به دلیل ناباروری خود (عامل مردانه) و یا همسر (عامل زنانه) به مرکز تحقیقاتی ناباروری دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد مراجعه کرده بودند، مورد بررسی قرار گرفتند. پس از بررسی های اولیه توسط متخصصین درمان ناباروری، افراد به دو گروه تقسیم شدند. تعداد 146 نفر دچار ناباروری با عامل مردانه (مورد) و 148 نفر مردان بارور (با وضعیت اسپرمی طبیعی) اما دارای همسران نابارور (شاهد) بودند. اطلاعات دموگرافیک آنها چون سن، شغل و سابقه بیماریهای مرتبط با ناباروری در پرسشنامة ویژه‏ای جمع‏آوری و سپس دو نمونه، بوسیله سواپ از عمق 2 سانتیمتری مجرای آنها برداشته می‏شد. یکی از نمونه‏ها بر روی محیط‏های EMB و آگار خون دار کشت داده و جهت جداسازی و تشخیص نوع گونه در اتوی 0C37 به مدت 24 ساعت نگهداری و از سواپ دیگر برروی لام یک گسترش تهیه می‏شد و پس از رنگ‏آمیزی به روش گرم مورد بررسی قرار می‏گرفت. در صورتی که در هر میدان دید میکروسکوپی بیش از پنج عدد لوکوسیت وجود داشت، اورتریت غیر گنوککی محسوب و از مطالعه حذف می‏گردید(13). بعد از نمونه‎برداری از مجرا، بیمار راهنمایی می‏شد تا مایع منی خود را به طور استریل جمع‏آوری کند و تحویل آزمایشگاه دهد. کلیه نمونه‏ها پس از قراردادن در دمای 0C37 به مدت 30 دقیقه، براساس معیارهای سازمان بهداشت جهانی (WHO) مورد بررسی قرار می‏گرفت (14،15). شمارش اسپرم پس از بی‏حرکت نمودن آن بر روی لام مخصوص شمارش اسپرم انجام می‏شد. همزمان بوسیله یک قطره مایع منی بر روی لام، گسترش تهیه می‏گردید و پس از رنگ‏آمیزی، مورفولوژی اسپرمها مورد بررسی قرار می‏گرفت. مطابق استاندارد WHO شمارش اسپرم کمتر از 20 میلیون در یک میلی لیتر، مورفولوژی طبیعی کمتر از 30% همراه با تحرک کمتر از 50% به عنوان گروه نابارور و مقادیر بیشتر این پارامترها به عنوان گروه بارور در نظر گرفته می‏شدند(14). جهت کشت و جداسازی گونه باکتریایی، از لوپ استاندارد (ml001/0) استفاده و مایع منی بر روی محیط‏های EMB و آگار خون‏دار کشت داده می‏شد و پس از قراردادن به مدت 24 ساعت در انکوباتور مورد مطالعه قرار می‏گرفت. چنانچه روی محیط کشت بیش از 103 × 1 عدد باکتری در یک میلی لیتر وجود داشت، کشت مثبت تلقی می‏شد. جهت تشخیص نهائی گونه، آزمون مورد نیاز طبق روش استاندارد به ترتیب ذیل دنبال می‏گردید(16).

کلنی‏های مات همراه با همولیز، برروی آگار خون‏دار را روی محیط دیگر در مقابل دیسک باستراسین گسترش داده و پس 24 ساعت کشت در صورت حساسیت به باسیتراسین استرپتوکوک گروه A (پیوژن) گزارش می‏شد. برای تشخیص و تمیز آنتروکوک‏ها، کلنی سفید بدون همولیز رنگ‏آمیزی و در صورت مشاهده استرپتوکوک، تست‏های افتراقی مطابق روش Baron و همکاران انجام و نتیجه یادداشت می‏شد(16).

کلنی‏های طلائی با همولیز و سفید یخچالی بدون همولیز پس از رنگ‏آمیزی گرم مورد مطالعه قرار می‏گرفت. در صورت مشاهده کوکسی‏های خوشه‏ای و گرم مثبت بعنوان دسته یا ژنوس استافیلوکوک تشخیص داده و برای تعیین گونه از تست کوآگولاز استفاده می‏شد. چنانچه گونه استافیلوکوک، سرم موجود در لولـه را منعقد می‏کرد استافیلوکوک کوآگولاز مثبت و در غیر اینصورت استافیلوکوک کوآگولاز منفی گزارش می‏گردید.

در مورد اشرشیا کلی ابتدا نوع کلنی بر روی محیط EMB مطالعه و کلنی‏هایی که دارای جلای فلزی بودند، پس از رنگ‏آمیزی گرم در صورت مشاهده باسیل گرم منفی اشرشیاکلی تشخیص و گزارش می‏شد. لازم به ذکر است که در این مطالعه فقط محیط‏هایی که گونه‏های مورد نظر بر روی آن رشد کرده بودند مورد مطالعه قرار می‏گرفتند و بقیه حذف می‏شدند. علاوه بر این هرگاه باکتری ایزولـه شده از پیشابراه، همسان با گونه ایزولـه شده از مایع منی نبود این نمونه نیز از مطالعه حذف می‏شد. پس از تکمیل نتایج، داده‏ها با استفاده از تست آماری chi-square مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

براساس استانداردهای سازمان بهداشت جهانی از مجموع 294 نمونه منی مورد بررسی، 146 نمونه در گروه نابارور و 148 نمونه در گروه بارور قرار گرفتند.

نتایج حاصل نشان داد که تعداد 73 نمونه مجرا (32/49%) و 43 نمونه مایع منی (05/29%) از جمع 148 نفر مردان بارور و 51 نمونه مجرا (9/34%) و 88 نمونه مایع منی (27/60%) از جمع 146 نمونة مردان نابارور، آلوده به باکتری بودند که تفاوت بین آلودگی منی در هر دو گروه مورد و شاهد با استفاده از تست Chi-square معنی‏دار بود(010/0P<).

شیوع پنج گونه باکتریائی (استرپتوکوک پیوژن، آنتروکوک، اشرشیاکلی، استافیلوکوک کوآگولاز مثبت و منفی) مورد نظر در مجرا و مایع منی مردان بارور در جدول شمارة 1 ارائه شده است. بیشترین آلودگی با گونة آنتروکوک با شیوع 6/35% در مجرا و 6/32% در مایع منی بود. جدول شماره 2 توزیع گونه‏های باکتریایی فوق را در گروه مردان نابارور نشان می‏دهد.

51 نمونه سواپ (9/34%) مجرا و 88 نمونه منی (2/60%) مربوط به 146 مرد نابارور، آلوده بودند. (بیشترین آلودگی مربوط به آنتروکوک با 2/41% در مجرا و 42% در منی بوده است). جدول شماره 3 میزان شیوع لکوسیت در 131 نمونه مایع منی آلوده به باکتری را در هر دو گروه شاهد و مورد نشان می‏دهد. همانطور که در جدول شماره 3 آمده است از جمع 131 نمونه مایع منی آلوده مربوط به هر دو گروه فقط 90 نمونه (7/68%) با لکوسیت همراه بودند، در حالیکه 41 نمونه (3/31%) از نمونه‏های آلوده فاقد لکوسیت بود یا کمتر از میزان استاندارد (106 ×1 در یک میلی‏لیتر) لکوسیت داشتند.

بحث

مسیر عبور اسپرم شامل لولـه‏های سیمنی‏فروس، اپیدیدیم، کانال دفران و مجرای غدة پروستات و پیشابراه می‏باشد که هر کدام از این اندامها به طور طبیعی استریل هستند، اما به دلیل وجود باکتریهای همسفره غیرپاتوژن و گاهی نیز پاتوژن‏های کلونیزه شده در پیشابراه ، کشت مایع منی مثبت گزارش می‏شود(6،7). هر چند عفونت‏های اپیدیدیم و پروستات می‏تواند به باکتریواسپرمی ختم شده و باعث ناباروری مردان شود، اما ارتباط عفونت‏های بدون علامت پیشابراه و مایع منی با ناباروری مردان هنوز مورد تردید است(4،5). مک گان و همکاران (5) گزارش نموده‏اند که در 36% مردان نابارور مایع منی دارای غلظت بالاتر باکتری می‏باشد. در مطالعات دیگر به اثبات رسیده است که عفونت مجاری تناسلی موجب باکتریواسپرمی می‏شود و در نهایت ممکن است به ناباروری ختم شود(19،18،8،7،3).

هولمس و همکاران (19) گزارش کردند که عامل عفونی شایع دستگاه ادراری ـ تناسلی آنتروکوک‏ها و باسیل‏های گرم منفی روده‏ای می‏باشند. آنها ثابت کرده‏اند که اشرشیاکلی یکی از مهمترین عفونت‏های علامت‏دار و یا بدون علامت دستگاه ادراری ـ تناسلی بوده و قادر است تا شاخص‏های اسپرماتوزوئید از جملـه تحرک و متابولیسم آن را تغییر دهد. بعلاوه محققین مذکور نشان دادند که وجود اشرشیاکلی موجب مرگ 80% اسپرم‏ها در شرایط خارج از بدن شود. مطالعه حاضر این واقعیت را آشکار کرده است که شیوع پنج گونه باکتریائی ایجاد کنندة عفونت دستگاه ادراری ـ تناسلی، در مایع منی مردان نابارور (مورد) 27/60% و در نمونه منی مردان بارور (شاهد) 05/29% می‏باشد که معرف شیوع بیشتر و معنی‏دار عفونت باکتریایی در مردان نابارور است. بنابراین همسو با یافته‏های دیگران به نظر می‏رسد که باکتریواسپرمی با ناباروری مردان ارتباط دارد(26، 19،18،8،7،3).

در بررسی حاضر، گونه غالب در مایع انزال افراد نابارور و بارور با شیوع 42% و 6/32% آنتروکوک و سپس اشرشیاکلی با شیوع 2/18% در بین نمونه‏های نابارور بود(جداول شماره 1 و2). یک بررسی که قبلاً توسط خلیلی و همکاران (2) برروی 90 نمونه مایع منی مردان نابارور مراجعه‏کننده به مرکز IVF یزد انجام شده بود، نشان داد که 3/63% آنها دچار باکتریواسپرمی بودند. گونه‏های ایزولـه شده به ترتیب فراوانی شامل استافیلوکوک و اشرشیاکلی بودند که در مقایسه با مطالعه حاضر نتیجه تفاوت داشته است؛ اما ویدنر و همکاران (21) نشان داده‏اند که از بین 190 نمونه مایع منی، 64% آنها آلوده به باکتری بودند و گونه‏های غالب آنتروکوک، اشرشیاکلی و استافیلوکک بوده است. بعلاوه شالیکا و همکاران (4) با بررسی بر روی 342 مایع منی افراد نابارور اعلام کردند که 32% آنها دچار باکتریواسپرمی بودند و 73% گونه‏های ایزولـه شده آنتروکوک بود و به دنبال آن با تجویز آنتی‏بیوتیک انتخابی و درمان آنتروکوک در مایع منی، سرنوشت بیمار را در فرآیند IVF تغییر نداد. اما درمان استافیلوکوک و اشرشیاکلی به میزان60% موفقیت IVF را افزایش داد. در مطالعه‏ای مشابه توسط مک گان(5) نشان داد که منی 15% از مردان بارور و 36% افراد نابارور دارای عفونت باکتریائی بود. همگام با نتایج فوق گری گریوز (22) اعلام کرد که از 225 مایع منی دارای پارامترهای غیرطبیعی اسپرم، 4/72% آلوده به باکتری بودند. با توجه به نتایج حاصلـه از این بررسی و مطالعات گستردة دیگران می‏توان نتیجه گرفت که عفونت مایع منی بویژه با عوامل میکروبی سیستم ادراری، در مردان نابارور بطور معنی‏داری بیشتر از عفونت مایع منی مردان بارور می‏باشد. بنابراین باکتریواسپرمی می‏تواند با ناباروری ارتباط داشته باشد. هرچند مطالعات فوق نقش باکتریواسپرمی را در ایجاد ناباروری نشان می‏دهد، اما ارتباط ناباروری با اورتریت هنوز مورد تردید است (4،5). برخی از محققین معتقدند که اورتریت‏های بدون علامت خطری را متوجه باروری انسان نمی‏کند (23،10،4) در حالیکه عده‏ای دیگر اعلام می‏دارند که اینگونه اورتریت‏ها ممکن است به باکتریواسپرمی ختم و سپس با گذشت زمان موجب تخریب پارامترهای اسپرم شوند(8-6). همانطور که نتایج این مطالعه نشان می‏دهد مجرای 73 مرد بارور

(32/49%) دچار اورتریت بدون علامت و 43 مرد بارور (05/29%) دارای نمونه منی آلوده به گونه‏های باکتریائی ذکر شده بودند، در حالیکه در بین افراد نابارور 51 نفر (90/34%) دچار اورتریت بدون علامت و 88 نمونه (27/60%) دارای منی آلوده بودند. بیشترین آلودگی در منی مردان نابارور (37 نمونه‌) آنتروکوک بود در حالیکه فقط از مجرای 21 نمونه، باکتری ایزولـه شده است. این میزان، آلودگی مجرا در 26 نمونه و آلودگی منی در 14 نمونه بوده است. فراوانی استرپتوکوک پیوژن و اشرشیاکلی که نقش آنها در ایجاد ناباروری مردان تأیید شده است در مجرا و مایع منی مردان بارور تقریباً یکسان است، در حالیکه این نسبت در گروه نابارور به این صورت می‏باشد: استرپتوکوک 2 نمونه آلودگی مجرا و 10 نمونه آلودگی مایع منی و اشرشیاکلی 5 نمونه آلودگی مجرا و 16 نمونه آلودگی مایع منی استافیلوکوک کوآگولازمثبت ایزولـه شده از مجرا و مایع منی در هر دو مورد تقریباً‌ یکسان است؛ در حالیکه فراوانی استافیلوکوک کوآگولاز منفی در مجرای مردان بارور تقریباً شش برابر مایع منی آنها می‏باشد. کاتل و همکاران (18) اعتقاد دارند که مایع منی در زمان عبور از مجرا آلوده می‏شود، اما از آنجا که کشت مایع منی در این بررسی بر اساس روش استاندارد پیشنهاد شده از طرف WHO انجام گرفته است (103× 1 باکتری در یک میلی لیتر) بنابراین می‏توان نتیجه گرفت که نتایج حاصل از کشت مایع منی عاری از هرگونه خطا بوده و افراد دچار باکتریواسپرمی واقعی می‏باشند‏ و از آنجا که پیشابراه آنها آلوده به گونه‏ای از باکتری است که از مایع منی آنها نیز ایزولـه شده است، بنابراین به نظر می‏رسد که اورتریت‏های بدون علامت می‏تواند به باکتریواسپرمی منجر شود. بطور کلی فراوانی باکتری در مجرای مردان بارور بیشتر از آ‎لودگی منی است و در حالیکه این نسبت در مردان نابارور کمتر می‏باشد. دلایل زیر شاید بتواند تضاد در این یافته‏ها را توجیه نماید:

1- زمان استقرار میکرب در مجرا و سپس تکثیر و انتشار به اندام جنسی قابل محاسبه نیست.

2- شاید سیستم تناسلی مردان نابارور استعداد بیشتری در کسب عفونت دارد.

3- ممکن است با گذشت زمان باکتری به طرف بیضه سوق داده شود، اما بدلیل وجود فاکتورهای کشندة باکتری آثار آن در پیشابراه محو شده باشد.

نتیجه اینکه اورتریت غیر علامت‏دار ممکن است منجر به باکتریواسپرمی شود اما برای تشخیص باکتریواسپرمی باید کشت مایع منی صورت گیرد و کشت مجرا نمی‏تواند نمایانگر عفونت دستگاه تناسلی باشد. اما این نکته حائز اهمیت است که باید از استریل بودن مجرای بیمارانی که جهت درمان مشکل ناباروری به مراکز IVF مراجعه می‏کنند اطمینان حاصل شود، زیرا عبور اسپرم از کانال پیشابراه ممکن است موجب آلودگی شود و در نهایت فرآیند IVF را مختل و منجر به مرگ جنین قبل یا بعد از انتقال به رحم شود. همانطور که جدول شماره 4 نشان می‏دهد 131 نمونه از هر دو گروه مورد و شاهد آلوده به باکتری و فقط 90 نمونه (7/68%) حاوی لکوسیت بودند. از آنجا که طیف وسیعی از گونه‏های باکتریائی قادر به آلوده‏کردن مایع منی می‏باشند و از طرفی کشت بسیاری از آنها مشکل است و نیاز به امکانات ویژه آزمایشگاهی دارد، لذا بعضی از محققین وجود لکوسیت در مایع منی (پیواسپرمی) را بعنوان یک شاهد قابل اعتماد عفونت دستگاه ادراری ـ تناسلی می‎دانند و توجه پزشکان را به درمان عفونت جلب می‏کنند(25،10). فولر و همکاران (25) معتقدند که مشاهده لکوسیت نه تنها هشدار یک عفونت را بهمراه دارد بلکه وجود آن در مایع منی موجب تضعیف شاخص‏های کیفی اسپرم می‏شود. بر خلاف عقیده فوق فولروکسلر(13) اعلام می‏دارند که اتکا به پیواسپرمی برای تشخیص و درمان عفونت منی قابل اعتماد نیست، زیرا ممکن است در منی مردانی که دچار اورتریت بدون علامت هستند، بطور کاذب لکوسیت مشاهده شود. لکوسیت موجود در منی ممکن است از طریق پیشابراه به مایع منی وارد شده باشد. همچنین مشاهده شد که 3/31% از نمونه‏های آلوده به باکتری فاقد لکوسیت بودند یا لکوسیت آنها از میزان استاندارد کمتر بود. بنابراین مطالعه حاضر همانند تحقیق مذکور از تشخیص عفونت به طریق کشت مایع منی و نه از طریق شمارش لکوسیت حمایت می‏کند.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از کلیه همکاران مرکز تحقیقاتی باروری و ناباروری یزد و کارشناسان میکروبیولوژی آزمایشگاه مرکزی، خانمها کریمی، ماندگاری و آقای کنعانی و همچنین خانم لبافیان کارشناس دانشکده پیراپزشکی که در آنالیز داده‏ها ما را یاری داده‏اند تشکر و قدردانی می‏شود.