مقدمه

سلولهای دندریتیک(DC) برای اولین بار در سال 1973 توسط Steinman و همکارانش در ارگانهای لنفاوی موش شناسایی شدند(1). سلولهای DC، سلولهای عرضه کنندة حرفه‌ای آنتی ژن(pAPC) هستند و دارای توانایی منحصر به فرد در القای پاسخ‌های ایمنی اولیه می‌باشند. پیش سازهای سلولهای DC از مغزاستخوان منشأ گرفته و پس از عبور از خون محیطی در بافت‌های مختلف مستقر می‌شوند(2). بدنبال عفونت، سلولهای DC آنتی‌ژن‌های عوامل بیماریزا را برداشت کرده و از طریق عروق لنفاوی آوران به نواحی سلولهای T ارگانهای لنفاوی ثانویه مهاجرت می‌کنند(2،3،4). در ارگانهای مذکور، سلولهای DC آنتی‌ژن را به لنفوسیت‌هایTCD4+ اختصاصی آنتی‌ژن عرضه می‌نمایند و موجب فعال‌شدن سلولهای مذکور و القای پاسخهای ایمنی اولیه می‌شوند. سلولهای TCD4+ نیز به نوبة خود پاسخ سایر سلولهای سیستم ایمنی نظیر لنفوسیت‌های B، لنفوسیت‌های TCD8+، سلولهای NK و ماکروفاژها را تنظیم می‌کنند(2). بنابراین سلولهای DC در تنظیم پاسخهای ایمنی سلولی و هومورال نقش محوری دارند.

سلولهای دندریتیک علاوه بر اعضا لنفاوی نظیر طحال، غده لنفاوی و تیموس در اعضای غیر لنفاوی نیز حضور دارند. این سلولها در مناطقی نظیر پوست، مجرای تنفسی، دستگاه گوارش، کبد، کلیه، پانکراس، سیستم عصبی مرکزی، چشم، و دستگاه تولید مثل یافت می‌شوند(5).

سلولهای DC در ارگانهای مذکور، علاوه بر عرضة آنتی‌ژن و کمک به دفاع بر علیه عوامل بیماریزا، در تنظیم پاسخهای ایمنی نیز نقش مهمی ایفاء می‌کنند(2). با توجه به اینکه تنظیم دقیق سیستم ایمنی در ارگانهای تولید مثل نظیر رحم، برای حفظ بقاء جنین، به عنوان یک پیوند نیمه بیگانه، ضرورت تام دارد، سلولهای DC می‌توانند به عنوان سلول اصلی و کلیدی تنظیم ایمنی در بقاء جنین نقش موثری ایفاء نمایند.

در مطالعات مختلف حضور سلولهای دندریتیک در دسیدوآی سه ماهة اول انسان(6)، دسیدوآی ترم انسان (7و8)، واژن و سرویکس موش(9و10) و اگزوسرویکس انسان(11) گزارش شده است.

یکی از مشکلات اساسی مطالعة سلولهای DC، فراوانی بسیار کم آنها در بافت‌های مختلف است. به عنوان مثال در سوسپانسیون تک سلولی طحال موش، این سلولها کمتر از5/0% کل جمعیت سلولهای هسته‌دار را به خود اختصاص می‌دهند(1و12). مطالعة ویژگی‌های مختلف سلولهای DC، نظیر قدرت القاء تولید سیتوکین‌ها توسط سلولهای T، توانایی عرضه آنتی‌ژن، تحریک سلولهای T و بررسی فراساختار این سلولها نیاز به دسترسی به جمعیت خالص سلولی دارد.

برای تخلیص سلولهای DC بافت‌های مختلف موش از روش‌های مختلفی نظیر سانتریفوژ گرادیان غلظتی به همراه انتخاب منفی با آنتی بادیهای منوکلونال(13،14)، سانتریفوژ گرادیان غلظتی به همراه انتخاب مثبت با آنتی‌بادیهای منوکلونال(15،16،17)، آمیزه‌ای از انتخاب مثبت و منفی(14،18)، انتخاب مثبت به تنهایی (19)،‌ سانتریفوژ گرادیان غلظتی به تنهایی(20) و سانتریفوژ گرادیان غلظتی به همراه کشت سلول(24-21) بکار گرفته شده است.

در این مقاله روش بهینة تخلیص سلولهای DC طحال موش با خلوص و بازده بسیار بالا با استفاده از روش سانتریفوژ گرادیان غلظتی و کشت سلول شرح داده می‌شود. از این روش می‌توان در تخلیص سلولهای DC از بافت‌های اعضای تولید مثل بهره جست.

مواد و روش‌ها

الف) حیوانات مورد استفاده:

موش و خرگوش: موشهای Balb/c و NMRI و خرگوش نیوزلندی از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند. موشهای DBA/2 و BCD2 F1 (DBA/2×(Balb/c از مرکز نگه‌داری حیوانات انستیتوکارولینسکا (سوئد) تأمین شد. موش‌ها در شرایط مناسب از نظر بهداشت، دما، رطوبت و روشنایی (سیکل 12 ساعته تاریکی ـ روشنایی) نگه داری شدند. تمام روش‌های تجربی مورد استفاده در این کار پژوهشی توسط کمیتة اخلاق پزشکی پژوهشکدة ابن سینا مورد بررسی و تصویب قرار گرفت.

ب) مواد: آنتی‌بادی ضد MHC II (IA/IE) کونژوگه با بیوتین، آنتی‌بادی ضد DC11c موش با منشأ همستر، آنتی‌بادی ضد ایمونوگلوبولین همستر با منشأ موش کونژوگه با بیوتین از شرکت pharmingen pharmingen, SanDiego, CA, USA))، استرپت اویدین کونژوگه با بیوتین از شرکت Biosource

(Biosource International Camarillo, CA,USA)، ABC کمپلکس با آلکالن فسفاتاز از شرکت DAKO (DAKO A/S, Productionsvej, Glostrup, Denmark) سوبسترای آبی الکالن فسفاتاز از شرکت Vector (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) اپـــتی‌پرپ از شـــــرکـــــت Axis- Shield

(Axis- SHIELD PoC AS, Oslo, Norway)،کلاژنازD، DNase و DAB از شــرکـــــــت Roche

(Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim Germany) RPMI-1640 از شرکت Sigma (Sigma, St. Louis, Mo) و سرم جنین گاوی (FCS) ، اسید آمینه‌های غیرضروری و سدیم پیروات از شرکت Gibco

(Gibco, Eggenstein, Germany) خریداری شد.

ج) تهیة سرم خرگوشی ضد گلبولهای قرمز گوسفند : تعداد 109 گلبول قرمز گوسفند (SRBC) ، پس از شستشو با PBS، در ml1 از بافر مزبور از بافر مزبور به صورت سوسپانسیون درآمد و به صورت داخل صفاتی (IP) به خرگوش تزریق شد. تزریق گلبول قرمز گوسفند 4 بار و به فواصل زمانی 2 هفته تکرار شد. یک هفته پس از آخرین دوز تزریق، از خرگوش خونگیری به عمل آمد و عیار آنتی‌بادی ضد SRBC به روش آزمون میکروآگلوتیناسیون تعیین گردید.

د) حساس کردن گلبولهای قرمز گوسفند با آنتی بادی (EA) : ml5/2 گلبولهای قرمز گوسفند سه بار با PBS شسته شد و هر بار بمدت 10 دقیقه در g ×280 و oc4 سانتریفوژ گردید. رسوب سلولی با PBS تازه به نسبت 5% رقیق شد و سرم خرگوشی ضد گلبولهای قرمز گوسفند به نسبت 1:70 به آن اضافه گردید. سوسپانسیون سلولی بمدت 2 ساعت در درجه حرارت آزمایشگاه انکوبه و در فاصله زمانی مذکور هر 15 دقیقه یکبار بآرامی مخلوط شد. گلبولهای قرمز حساس شده 3 بار با RPMI-1640 شسته شد و با همان محیط به نسبت 5% رقیق گردید(12).

ه) تخلیص سلولهای دندریتیک طحال: سلولهای کم چگال (LD) با روش Ruedl(17) و با اعمال تغییراتی از طحال 5-2 موش 12-10 هفته‌ای تهیه شد.

طحال موش‌ها پس از نخاعی کردن حیوان به صورت استریل خارج و در PBS قرار داده شد. به هر طحال

ml1 از محلول کلاژناز D mg/ml5/0 حاوی سرم جنین گاوی 2% و (type II ) DNase I μg/m130 تزریق و سوسپانسیون سلولی حاصله جمع‌آوری و در مجاورت یخ قرار داده شد.

سپس طحالها با قیچی به قطعات ریز3mm 1 تقسیم شدند و به آنها محلول کلاژناز D mg/ml 2/1 در محلول HBSS حاوی سرم جنین گاوی 2% و DNase

μg/m130 اضافه شد. قطعات بافتی به همراه کلاژناز بمدت 45-35 دقیقه در انکوباتور oc37 حاوی 2 CO5% انکوبه شد.

پس از پایان انکوباسیون به قطعات بافتی، EDTA با غلظت نهایی mM5 اضافه و مخلوط بافتی چندین بار پیپت شد. سوسپانسیون سلولی بدست‌آمده از غربال فلزی عبور داده شد و سوسپانسیون حاصله با سوسپانسیون سلولی حاصل از تزریق کلاژناز مخلوط گردید. مخلوط سلولی 2 بار با PBS حاوی EDTA

mM 5 به مدت 10 دقیقه در oc4 و g×280 شسته شد.

رسوب سلولی حاصل بلافاصله با محلول اپتی‌پرپ 15% (g/ml 085/1 d= ) مخلوط گردید.

برای رقیق‌کردن اپتی‌پرپ غلیظ (60%) از محلول CMF HBSS استفاده شد.

روی سوسپانسیون سلولی حاصل، محلول اپتی‌پرپ

12% رقیق‌شده با (w/v)NaCl 88/0%، HEPES

mM10، EDTA mM 1 و BSA 5/0%، 4/7=pH و بر روی آن محلولCMF HBSS به آرامی اضافه شد و لولـه‌ها بمدت 15 دقیقه در دور g×600، در oc20 و بدون ترمز، سانتریفوژ گردید. سلولهای کم چگال ((LD از حد فاصل محلول CMF HBSS و اپتی‌پرپ 12% جمع‌آوری و 2 بار با (mM5) PBS-EDTA سرد در oc4 و g×280 شسته شد. سپس مطابق با روش Steinman

(24) و با اعمال تغییراتی رسوب سلولی با RPMI-1640 کامل حاوی سرم جنین گاوی 5%، پنی‌سیلین IU/ml100، استرپتومایسین μg/ml100، ال‌ـ گلوماتین mm2، HEPES mm2، اسیدهای آمینه غیرضروری و سدیم پیروات با غلظت mm1 و 2ME mM50 مخلوط و در پلیت‌های کشت mm15×60 کشت و به مدت 2 ساعت درoc 37 و CO2 5% انکوبه گردید. پس از پایان مدت انکوباسیون، سلولهای غیرچسبان با RPMI-1640 گرم (oc37) حاوی سرم جنین گاوی 5% چندین بار شسته و دور ریخته شدند. به سلولهای باقیمانده در کف پلیت محیط کامل RPMI گرم اضافه گردید و پلیت‌ها بمدت 20-14 ساعت در انکوباتور oc37 و CO25% قرار داده شدند. پس از پایان مدت انکوباسیون، سلولهای DC که به صورت شناور درآمده بودند جمع آوری و 2 بار با PBS سرد در oc4 شسته شدند. برای مطالعات مرفولوژیک و نیز انجام آزمایشهای ایمونوسیتوشیمی، سلولها بر روی لامهای پوشش داده شده با پلی ال-لیزین سیتواسپین شدند.

در برخی از موارد برای افزایش خلوص سلولهای DC از روش رزت با EA استفاده شد. برای اینکار، پس از کشت شبانه و جمع آوری سلولهای دندریتیک، 50 عدد گلبول قرمز حساس شده گوسفند بازای هر لکوسیت اضافه و بآرامی مخلوط و سوسپانسیون سلولی حاصل بمدت 10 دقیقه در دور آرام (oc4 و g×70) سانتریفوژ گردید. بدون خارج ساختن محلول رویی، لولـه حاوی سلول بمدت 30 دقیقه در یخ قرار داده شد. پس از مدت مذکور تمام مایع رویی بجز ml2 دور ریخته شد و سلولها با پیپت پاستور به آرامی مخلوط گردید. سوسپانسون سلولی به آرامی بر روی ml5 از محیط اپتی‌پرپ با چگالی g/ml077/1 اضافه و سانتریفوژ گردید. سلولهای ناحیة حد واسط، که سلولهای DC خالص بود، جمع‌آوری و 2 بار با PBS سرد در oc4 شسته شد.

و) مطالعه ایمونوسیتوشیمیایی سلولهای تخلیص شده:

برای رنگ‌آمیزی با آنتی‌بادی ضد MHC II ، سلولهای سیتواسپین شده بمدت 2 دقیقه در استون سرد ثابت و سپس 3 بار با PBS شسته شدند. جهت خنثی کردن پراکسیداز اندوژن از محلول H2O23/0% در PBS بمدت 10 دقیقه استفاده شد. پس از شستشوی مجدد با PBS، سلولها با آنتی‌بادی ضد IA/IE کونژگه با بیوتین با غلظت μg/ml1 بمدت یک ساعت در درجه حرارت آزمایشگاه انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS استرپت اویدین کونژگه با HRP بمدت 30 دقیقه اضافه و پس از 3 بار شستشو با PBS، محلول DAB بر روی لامها اضافه شد. بعد از 15-5 دقیقه، لامها با آب شسته شده و پس از انجام مراحل آب‌گیری با الکل و رنگ‌‌آمیزی افتراقی با هماتوکسیلن، مانته شدند.

برای رنگ‌آمیزی با آنتی‌بادی ضد CD11c، پس از انجام مراحل مقدماتی فوق‌الذکر، لامها با آنتی‌بادی ضد CD11c با غلظت μg/m12 در طول شب در oc4 انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، آنتی‌بادی ضد ایمونوگلوبولین موش کونژوگه با بیوتین (μg/ml1) حاوی 1% سرم موش بر روی لامها اضافه شد. پس از یکساعت انکوباسیون در درجه حرارت آزمایشگاه و شستشو با PBS سایر مراحل مطابق با روش فوق (رنگ‌آمیزی با آنتی‌بادی ضد MHC II) انجام گرفت.

در برخی از موارد برای افزایش حساسیت واکنش، بجای استرپت اویدین کونژگه با HRP، از کمپکس ABCکونژگه با الکالن فسفاتاز و به عنوان سوبسترا از سوبسترای آبی الکالن فسفاتاز استفاده شد. در مرحلة آخر از متیل گرین به عنوان رنگ زمینه استفاده گردید.

نتایج

الف: جداسازی و تخلیص سلولهای DC طحال:

پس از هضم آنزیمی طحال موشهای همخون با آنزیمهای کلاژناز و DNase، تعداد 106× 300-200 و بطور متوسط 106×255 لکوسیت به ازای هر طحال بدست آمد. با استفاده از روش‌های مکانیکی هضم و بدون استفاده از آنزیم تعداد کل لکوسیت‌های طحالی به ازاء هر موش حدود 106×100 سلول بود.

برای هضم طحال از آمیزه آنزیمی کلاژناز D

(mg/m12/1) و DNase (μg/m130) بمدت 45-35 دقیقه در oc37 استفاده شد. افزایش زمان انکوباسیون و یا غلظت آنزیمهای مذکور سبب تجمع سلولی و کاهش میزان حیات شد.

در این مطالعه از محیط گرادیان اپتی‌پرپ با چگالی‌های مختلف 077/1-065/1 برای غنی‌سازی اولیه سلولهای DC طحال استفاده شد.

میزان بازیافت سلولهای LD در 077/1= d، 15%-10% کل لکوسیت‌های طحال بود. کاهش چگالی محیط گرادیان سبب کاهش تعداد سلولهای LD می‌گردید. بطوریکه تعداد سلولهای LD در 068/1d= ، 6%-3% و در 065/1=d تنها 4/2% سلولهای اولیه بود. درجه حرارت سانتریفوژ نیز تعداد سلولهای LD را تحت تأثیر قرار می‌داد بطوریکه کاهش دما از oc20 ‌سبب افزایش جمعیت سلولی مذکور می‌شد.

مطالعه با میکروسکوپ فاز کنتراست(Olympus-Japan) نشان داد که تنها، 15 دقیقه پس از کشت سلولهای LD، سلولهای دندریتیک به کف پلیت متصل شده و به آرامی در سطح آن گسترش می‌یابند(شکل 1). ولی بدلیل بالابودن تعداد سلول‌های کشت‌داده به ازای واحد سطح (حدود 2cm/106×2/1) و مخفی‌ماندن زوائد سلولهای DC در زیر سایر سلولهای همراه، مشخصات دقیق این سلولها از جمله زوائد سیتوپلاسمی بخوبی قابل رویت نبود. پس از حدود 2-5/1 ساعت، سلولهای DC کاملاً به سطح پلیت چسبیده و زواید ‌سیتوپلاسمی خود را در کف پلیت انتشار می‌دادند. سایر سلولها از جمله اکثر لنفوسیت‌ها، برخی از ماکروفاژها و تعداد قلیلی از سلولهای DC پس از این مدت به صورت غیر چسبان باقی می‌ماندند. شستشوی پلیت پس از مدت مذکور سبب حذف سلولهای غیر چسبان شده و مرفولوژی دقیق سلولهای DC نمایان می‌گردید(شکل 2). پس از شستشو، تنها حدود 3/0% کل سلولهای اولیه طحال در کف پلیت باقی می‌ماند.

مطالعه با میکروسکپ فازکنتراست نشان داد که این سلولها دارای شکل غیر منظم بوده و در اطراف خود دارای زوائد متعددی می‌باشند. جسم سلول غالباً به صورت کشیده و زوائد اطراف سلولی به صورت شعاعی از آن خارج شده بود. برخی از این زواید به صورت برجستگی‌های کوچک، برخی بزرگ و انگشتی شکل و برخی دیگر نازک و بلند بود. تعداد این زواید، از یک زائده تا بیش از 7 زائده متغیر بود. برخی از این زواید در طول مسیر خود دارای تقسیمات جانبی نیز بودند(شکل 2و3). در مطالعه با میکروسکپ فاز کنتراست، این سلولها کاملاً تیره دیده می‌شدند. علت این امر وجود تعداد زیادی میتوکندری در سیتوپلاسم سلول است(23).

پس از حدود 16-12 ساعت سلولهای DC بالغ شدند و به صورت شناور درآمدند؛ در حالیکه اکثر سلولهای غیر DC، شامل لنفوسیت‌های B و ماکروفاژها به صورت چسبیده باقی ماندند. تعدادی از سلولهای DC پس از شناور شدن بهم متصل شده و تجمعات کوچک تا بزرگ سلولی را تشکیل می‌دادند. این تجمعات سلولی براحتی با پیپت کردن محیط کشت حاوی سلول، شکسته می‌شد. پس از کشت شبانه و بلوغ سلولی ناشی از آن، تعداد زواید سیتوپلاسمی اطراف سلولهای DC افزایش و قطر آنها کاهش و طولشان افزایش می‌یافت(شکل 4).

کشت سلولهای LD با تعداد مختلف بازای واحد سطح نشان داد که تعداد بهینة سلول بازای واحد سطح 2cm/106× (7/1-1) و بطور متوسط 2cm/106 × 2/1 می‌باشد. افزایش و یا کاهش نسبت مذکور سبب کاهش بازده و یا کاهش میزان حیات سلولهای DC می‌گردید.

پس از بلوغ و شناور شدن در محیط کشت، سلولهای DC غالباً به سمت کناره‌های پلیت کشیده شده و در آنجا تجمع می‌یافتند.

مرحلة نهایی تخلیص سلولهای DC، تست EA rosett بود. سلولهای DC بالغ با گلبولهای قرمز حساس شده گوسفند، رزت تشکیل نمی‌دادند؛ در حالیکه ماکروفاژها با 30-20 گلبول قرمز و لنفوسیت‌های کوچک، که احتمالاً از نوع لنفوسیت B بودند، با 2-1 گلبول رزت تشکیل می‌دادند(شکل 5).

پس از سانتریفوژ در محیط گرادیان غلظتی، گلبولهای قرمز آزاد به همراه رزتهای تشکیل شده رسوب می‌کردند؛ در حالیکه سلولهای DC خالص در لایه میانی باقی می‌ماندند. به هنگام استفاده از چگالی 077/1 در جداسازی ‌سلولهای LD، انجام تست رزت خلوص را به میزان 10-5% افزایش می‌داد؛ در حالیکه افزایش خلوص با رزت به هنگام استفاده از چگالی 068/1 تنها 2-1% بود.

مطالعه میکروسکپی سلولهای DC پس از رنگ آمیزی گیمسا نشان داد که این سلولها غالباً هسته لوبیایی ‌یا دو لبه دارند(شکل 6). در این رنگ‌آمیزی زوائد برخی از سلولهای DC دیده می‌شد. در مجموع، کل سلولهای DC تخلیص شده از هر موش همخون، 105× 7-5 عدد بود. در مقایسه با موشهای همخون، میزان سلولهای DC طحال نژادهای غیرهمخون و یا موشهای F1 و F2 حاصل از لقاح موشهای همخون (Balb/c×DBA/2) حدود 40%-20% بیشتر بود.

ب: ایمونوسیتوشیمی:

سلولهای DC پس از خالص‌سازی نهایی بر روی لامهای پوشش داده شده با پلی‌ال ـ لیزین سیتواسپین شدند.

پس از جداسازی سلولهای LD با اپتی‌پرپ (068/1=d) و انجام مراحل بعدی تخلیص (بدون رزت)، مطالعه بیان مارکر CD11c نشان داد که خلوص نهایی سلولهای DC بیش از 97% است(7). تمام سلولهایی که ظاهر دندریتیک داشتند، CD11c و MHC II را بیان می‌کردند. بیان MHC II بر روی سلولهای DC بمراتب بیش از بیان CD11c بود. از طرف دیگر در مقایسه با CD11c، رنگ آمیزی با MHC II، زوائد سیتوپلاسمی اطراف سلولی را بهتر نمایان می‌کرد(شکل 8). میزان بیان MHC II یا CD11c در برخی از سلولها بیش از سایرین بود.

بحث

در این مقاله، روش بهینة تخلیص سلولهای دندریتیک طحال موش ارائه شده است. از آنجا که هیچ ردة سلولی وابسته به سلولهای DC وجود ندارد، این سلولها را برای هر آزمایش باید به صورت تازه از بافت مورد نظر تخلیص نمود.

یکی از مشکلات اساسی جداسازی سلولهای DC از بافت‌های مختلف، فراوانی بسیار کم این سلولها می‌باشد. در طحال موش فراوانی این سلولها کمتر از 5/0% کل لکوسیت‌های طحال است(12). بنابراین بعید به نظر می‌رسد که بتوان تنها با استفاده از روش تخلیص یک مرحله‌ای این سلولها را با خلوص و بازده بالا تخلیص نمود. چنانچه خلوص سلولهای DC غدد لنفاوی موش پس از تخلیص با روش سانتریفوژ گرادیان غلظتی به تنهایی، حدود 60% گزارش شده است(25). همچنین استفاده از روش انتخاب مثبت با آنتی‌بادی ضد CD11c برای تخلیص سلولهای DC مغز استخوان موش، خلوص 70% را بدست خواهد داد(26). از این رو با تلفیق روشهای مختلف تخلیص، خلوص بالاتری بدست خواهد آمد. در مطالعات مختلف از روش‌های مختلفی نظیر انتخاب منفی لنفوسیت‌های B،T، ماکروفاژها، گرانولوسیت‌ها و سلولهای NK با استفاده از آنتی‌بادی‌های منوکلونال(13و14)، انتخاب مثبت با آنتی‌بادی ضد CD11c (19) و یا تلفیقی از این دو روش (14،18) برای تخلیص سلولهای DC استفاده شده است. یکی از مزایای اینگونه روش‌ها در این است که می‌توان سلولهای DC نابالغ و تازه را تخلیص کرد. ولی برخی از آزمونها نظیر بررسی قدرت القای تولید سیتوکین در سلولهای T، یا عرضة آنتی ژن، مستلزم بلوغ سلولهای DC در شرایط in vitro است. به همین سبب القاء بلوغ سلولهای DC برای آزمونهای مذکور ضروری است. القاء بلوغ سلولهای DC با استفاده از محرک‌های مختلفی مانند پاتوژن‌ها، LPS ، TNF ، IL-1 (27)، DNA باکتریایی(28)، پروستاگلاندین‌ها(2) و کشت کوتاه مدت در شرایط آزمایشگاهی امکان پذیر است(32-29). به همین دلیل لحاظ کردن یک دورة شبانة کشت در تخلیص سلولهای DC نه تنها موجب بلوغ سلولهای DC می‌گردد، بلکه بدلیل شناور شدن سلولهای DC پس از بلوغ، امکان جداسازی آنها را از سایر سلولهای چسبان نظیر ماکروفاژها فراهم می‌آورد.

یکی از رایج‌ترین روشهایی که در تخلیص سلولهای DC بکار برده می‌شود، مبتنی بر برخی خصوصیات سلولهای دندریتیک از جمله چگالی پائین، توان اتصال سریع به پلاستیک و سطوح شیشه‌ای و شناورشدن پس از کشت شبانه است. در این مطالعه نیز از همین روش برای تخلیص سلولهای DC طحال موش استفاده شده است. در اولین فاز تخلیص، سلولهای DC از سایر سلولهای دارای چگالی بالا جدا می‌شوند(24،33). سلولهای مختلف دارای چگالی مختلف می‌باشند. به عنوان مثال، چگالی گلبولهای قرمز، گرانولوسیت‌ها، لنفوسیت‌ها و منوسیت‌ها به ترتیب 1/1، 085/1 ، 072/1 و 065/1 است(34).

سلولهای DC دارای چگالی پائین‌تری می‌باشند؛ از این رو می‌توان با استفاده از محیط‌های گرادیان غلظتی، این سلولها را به میزان زیادی غنی‌سازی کرد. تعداد سلولهای LD با چگالی محیط گرادیان رابطة مستقیم دارد. کاهش چگالی محیط از 077/1 به 065/1 سبب می‌شود که تعداد سلولهای LD از 15-10% به 4/2% کل سلولهای هسته‌دار طحال تقلیل یابد. افزایش تعداد سلولهای LD اگرچه امکان بازیافت تعداد بیشتری از سلولهای DC را در ناحیة حد واسط فراهم می‌کند، ولی بدلیل افزایش تعداد سلولهای همراه از جمله لنفوسیت‌های B و ماکروفاژها، شرایط انتخاب سلولهای DC را مشکل‌تر می‌سازد. بطوریکه تعداد سلولهای چسبان مرحلة اول کشت بطور قابل توجهی افزایش می‌یابد و شستشوی بیشتر پلیت به منظور دسترسی به خلوص بالاتر سبب کنده‌شدن برخی از سلولهای DC و کاهش بازده می‌گردد. از طرف دیگر این امر سبب می‌شود که در نهایت خلوص نهایی سلولهای DC کاهش یابد. استفاده از محیط‌های گرادیان با چگالی پائین تر از 065/1 احتمال از دست رفتن تعدادی از سلولهای DC را به همراه خواهد داشت. با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه به نظر می‌رسد که چگالی 068/1، چگالی بهینه محیط‌های گرادیان برای تخلیص اولیه سلولهای DC طحال موش باشد. در مطالعات مختلف از محیط‌‌های مختلفی مانند نیکودنز (21)، BSA (24و16)، متریزامید(26و25و13)، اپتی‌پرپ (20و17) و پرکل (35) استفاده شده است در این مطالعه از اپتی‌پرپ برای تخلیص اولیه سلولهای DC استفاده شد.

اپتی‌پرپ نام تجاری یدوکسانول (یک دی مر نیکودنز) است(36). نیکودنز و مشتقات آن بر روی مرفولوژی سلول تأثیر نداشته و برای سلول، غیرسمی است. از طرف دیگر توسط سلولها متابولیزه نمی‌شود. ولی آلبومین و متریزامید سبب تغییراتی در عملکرد سلول می‌شوند(37). با توجه به اینکه تنها 6-3% کل سلولهای طحالی پس از سانتریفوژ با اپتی‌پرپ 068/1=d در ناحیة حد واسط باقی می‌مانند، می‌توان دریافت که این مرحله از تخلیص سبب غنی‌سازی سلولهای DC به میزان 30-20 برابر می‌شود. دومین فاز برای تخلیص سلولهای DC طحال، استفاده از توانایی بالای این سلولها در اتصال به سطوح پلاستیکی یا شیشه‌ای می‌باشد.

سلولهای دندریتیک طحال انسان و موش در ابتدای جداسازی، زمانی که نابالغ هستند، به سطوح شیشه‌ای، پلاستیکی، Nylon wool و سفادکس متصل می‌شوند (33و24). با این خصوصیت می‌توان سلولهای DC را از سلولهای غیر چسبان که قسمت اعظم آلودگی سلولی را در جمعیت LD تشکیل می‌دهند، جدا کرد.

فاز سوم تخلیص بهره‌گیری از عدم توانایی سلولهای DC بالغ در اتصال به کف پلیت است. کشت کوتاه مدت در شرایط آزمایشگاهی سبب بلوغ و شناورشدن سلولهای DC شود. این فرآیند، خاص سلولهای DC است و در سایر سلولهای چسبان نظیر ماکروفاژها دیده نمی‌شود. ماکروفاژها 1 ساعت پس از کشت به سطح پلیت متصل شده و این اتصال تا چندین روز پایدار است و لذا با کشت شبانه می‌توان سلولهای DC را از سایر سلولهای چسبان جدا نمود(24).

همانطور که در بخش نتایج اشاره شد، یکی از مشخصات سلولهای DC وجود تعداد زیادی میتوکندری است که سبب می‌شود، این سلولها در زیر میکروسکپ فاز کنتراست سیاه رنگ دیده شوند. در این مطالعه نشان داده شد که این خصوصیت در سلولهای DC تازه جدا شده وجود دارد؛ ولی پس از گذشت مدتی احتمالاً بدلیل بلوغ سلولی و افزایش اندازه و کاهش چگالی سلول، تراکم میتوکندری‌ها کاهش یافته و منظرة سیاه سلولهای DC بتدریج در طول کشت شبانه کاهش می‌یابد. بدنبال بلوغ ناشی از کشت شبانه تعدادی از این سلولها به یکدیگر چسبیده و تشکیل تجمعات سلولی می‌دهند. همچنین تعداد زواید سلولی اطراف سلول به نحو قابل توجهی افزایش می‌یابد.

سلولهای DC بالغ فاقد گیرندة ناحیة FC مولکولهای IgG (FCγR) هستند و این خصوصیت اساس مرحله چهارم تخلیص سلولهای دندریتیک است. ماکروفاژها و لنفوسیت‌های B دارای این گیرنده هستند و لذا با گلبولهای قرمز حساس‌شده گوسفند با آنتی‌بادی ضد SRBC، رزت تشکیل می‌دهند، در حالیکه سلولهای DC به این گلبولها وصل نمی‌شوند(24).

براساس این مطالعه در صورتی که از محیط‌ گرادیان غلظتی با 077/1=d برای غنی‌سازی اولیه سلولهای DC استفاده شود. تست رزت می‌تواند میزان خلوص را حدود 10-5% افزایش دهد. در حالیکه در روش بهینه پیشنهادی و با استفاده از اپتی‌پرپ 068/1=d، تست رزت تنها 2-1% خلوص را افزایش می‌دهد.

بنابراین با روش پیشنهادی مذکور دیگر نیازی به انجام تست رزت نیست.

از طرف دیگر مراحل رزت نسبتاً طولانی است و نیاز به چندین بار شستشو و انجام سانتریفوژ دارد و طی مراحل این تست امکان کاهش میزان حیات و از دست رفتن تعدادی از سلولهای DC وجود دارد.

در مجموع با استفاده از این روش، از هر طحال موش‌های همخون، 105× 7-5 سلول DC با میزان حیات بیشتر از 95% بدست آمد. میزان جداسازی سلولهای DC با استفاده از محیط گرادیان غلظتی آلبومین 105× 5-3 گزارش شده است(33). همچنین علیرغم حساسیت بالای سلولهای DC و کاهش میزان حیات آنها در محیط کشت(32)، میزان حیات بدست آمده در این مقاله قابل توجه است.

حداقل دو مسیر تکاملی مختلف و متمایز در سلولهای DC موش شناخته شده است که عبارتند از مسیر تکاملی لنفوئیدی و مسیر تکاملی میلوئیدی. سلولهای DC میلوئید و لنفوئید در فنوتیپ، لوکالیزاسیون و نوع فعالیت با یکدیگر فرق دارند. هر دو زیر گروه مقادیر بالایی از CD86, MHC II, CDllc و CD40 را بیان می‌کنند. سلولهای دندریتیک میلوئید علاوه بر مارکرهای فوق DCllb را نیز بیان می‌کنند؛ در حالیکه سلولهای دندریتیک لنفوئید CDllb- می‌باشند و مارکرهای دیگری نظیر DEC-205 و CD8α را بیان می‌کنند.

در این مطالعه از آنتی بادی منوکلونال ضد MHC II و DC11c برای بررسی ایمونوفنوتیپ سلولهای DC تخلیص شده استفاده شد. بیان DC11c به همراه نمای دندریتیک خاص سلولهای DC بوده و از این دو خصیصه می‌توان برای تعیین خلوص سلولهای DC موش استفاده کرد(38). سلولهای DC تعداد بالایی از مولکولهای MHC II را بیان می‌کنند(13). در این مطالعه نیز بیان سطح بالایی از مولکولهای MHC II بر روی سلولهای DC طحال موش نشان داده شد. مطالعه ایمونوسیتوشیمی با DC11c، خلوص بالای 97% را نشان داد که با توجه به عدم استفاده از آنتی بادیهای منوکلونال در روند تخلیص سلولهای DC قابل توجه است. از طرف دیگر با توجه به مرفولوژی کاملاً مشخص سلولهای DC بدنبال بلوغ به نظر می‌رسد که علیرغم بیان MHC II توسط سایر سلولهای عرضه کنندة آنتی‌ژن نظیر ماکروفاژها و لنفوسیت‌های B، بتوان از تلفیق بیان بالای این مارکر به همراه مرفولوژی در تعیین خلوص سلولهای DC بهره جست.

حضور سلولهای دندریتیک در دسیدوآی سه ماهة اول انسان، دسیدوآی ترم انسان، واژن و سرویکس موش و اگزوسرویکس انسان گزارش شده است. با توجه به گزارشهای موجود در مورد حضور سلولهای DC در بافت‌های مرتبط با حاملگی و نیز با توجه به نقش سلولهای DC لنفوئید در القاء تحمل ایمونولوژیک،‌به نظر می‌رسد این سلولها در بقاء پیوند نیمه بیگانه جنین نقش مهمی داشته باشند و لذا مطالعة این سلولها در ارگانهای تولید مثل می‌تواند جوابگوی بسیاری از مسائل ناشناخته در این مورد باشد. در تنها مطالعة انجام شده برای تخلیص سلولهای DC دسیدوای سه ماهة اول انسان خلوص نهایی سلولهای DC 30% بوده است(6). با توجه به نیاز به دسترسی به خلوص بالای سلولهای DC جهت مطالعه خصوصیات عملکردی آنها و نیز نقش مهم این سلولها در تنظیم ایمنی بافت‌های مختلف از جمله بافت‌های مرتبط با حاملگی، از روش ارائه شده در این مقاله می‌توان در تخلیص سلولهای دندریتیک ارگانهای تولید مثل استفاده نمود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از زحمات و همکاری سرکار خانم پروانه احمدی که در تایپ این مقاله ما را یاری کردند، تشکر و قدردانی می‌شود.