Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

The effect of sperm chromatin anomalies on pronucleus different size after IVF and ICSI

Authors
Mohammad Hossein Nasr-Esfahani 1
Shahnaz Razavi 2
Mohammad Mardani 2
Afsaneh Mafi 2
Abbas Moghaddam 2
Safoura Tofigh 2
1 Embryology Department, Royan Institute, Iranian Academic Center for Education, Culture & Research (ACECR), Isfahan, Iran; Andrology Department, Royan Research Center, Isfahan, Iran; Embryology Laboratory, Isfahan Fertility & Infer
2 Department of Embryology, Faculty of Medicine, Isfahan Medical Science University, Isfahan, Iran
Abstract
Pronucleus size, morphology and orientation are known to affect embryo quality, implantation and pregnancy success. The present study was aimed at evaluation of the possible relationship between sperm chromatin maturity tests (CMA3, aniline blue, SDS, SDS+EDTA) and semen parameters with percentage of zygotes with pronucleus size asynchrony. Semen of 115 men from IVF and ICSI couples were analyzed for sperm concentration, motility, morphology and the said tests. At least 17-19 hours after sperm insemination or ICSI, oocytes were scored for presence and relative size of their pronuclei and then the relationship between percentage of zygotes with pronucleus size asynchrony and semen parameters and the above tests was evaluated. A positive significant relationship was obtained between percentage of zygotes with unequal pronucleus size with protamine deficiency, excessive histones and ability of sperm to undergo decongestion in ICSI cases. However, no correlation was observed between this phenomenon and any of semen parameters and aforementioned tests in IVF cases. The result of this study and other studies show that evaluation of chromatin status is of paramount importance, since protamine deficiency not only directly affects fertilization rate, but also affects pronuclear morphology which influences embryo development, implantation and pregnancy success in IVF and ICSI. The effect of abnormal chromatin status on development of zygote might be mediated via abnormal pronucleus formation since sperms with abnormal chromatin are injected into oocytes during ICSI.
Keywords
ICSI
IVF
Pronucleus size asynchrony
Protamine deficiency
Sperm chromatin

مقدمه

لقاح یک فرایند چند فاکتوری است که در طی آن اسپرم به داخل تخمک نفوذ می‌کند و ژنوم پدری را به داخل اووسیت منتقل می‏نماید. اما یکی از ویژگی‏های لقاح، جلوگیری از داخل‏شدن اسپرم غیرطبیعی به داخل اووسیت می‏باشد. در طی لقاح طبیعی در بدن، احتمال رسیدن اسپرم غیرطبیعی به محل لقاح به حداقل ممکن می‏رسد؛ در حالیکه درIVF همراه اسپرم طبیعی، اسپرمهای غیرطبیعی نیز با اووسیت مجاور می‏شوند و در نتیجه چنین اسپرمهایی ممکن است توانایی بارورکردن اووسیت را پیدا نمایند؛ اما روش ICSI برخلاف IVF، به عنوان یک روش مؤثر در درمان ناباروری مردان با اسپرمهای غیرطبیعی در نظر گرفته می‏شود و با این وجود درصد بالایی از باروری وحاملگی قابل قبول در روش ICSI گزارش شده است(1،2) آنومالیهای متعددی در اسپرم گزارش شده که از جمله مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم و آنالومی کروماتین را می‌توان نام برد. ارتباط بین آنومالیهای ذکر شده با میزان لقاح بطور وسیع در IVF و تا حدی در ICSI مطالعه شده است (3،4). از میان شاخصهای اسپرمی و تست‏های عملکرد اسپرم، مرفولوژی اسپرم و آنومالیهای کروماتین بالاترین ارتباط مستقل را با میزان باروری نشان می‏دهند(5). تحقیقات دیگر حاکی از آن است که در روش ICSI میزان لقاح اسپرم با مرفولوژی و کروماتین غیرطبیعی، کمتراست(6).

مرفولوژی و موقعیت قرارگرفتن پیش‌هسته‏ها در زیگوت نیز برروی روند تکامل بعد از لقاح، شامل تشکیل بلاستوسیست و میزان حاملگی تأثیر دارد. سیستم‏های امتیازدهی و راهنماهای مختلفی برای انتخاب جنینی با بیشترین توانایی برای تشکیل بلاستوسیست و لانه‏گزینی وجود دارد(7-10).

هدف این سیستم‏های امتیازدهی، کاهش تعداد انتقال رویان به رحم و به دنبال آن کاهش میزان حاملگی چندقلویی می‏باشد. اساس امتیازدهی این سیستم‏ها ترکیبی از اندازه پیش‌هسته‏ها، تعداد هستک‏ها و توزیع آنها می‏باشد. هر چند در میان این دسته‏بندی‏ها اندازه پیش‌هسته‏ها کمترین امتیاز را دارد. این بدین معنا است که رویان‏های دارای پیش‌هسته‏های نامساوی کمترین توانایی را برای تشکیل بلاستوسیست و به دنبال آن لانه‏گزینی و در نتیجه حاملگی دارند(7-9).

مطالعات محققین بیانگر این است که غیر مساوی بودن پیش‏هسته‏ها می‏تواند مربوط به تغییرات بعد از بلوغ اووسیت‏های مسن باشد، که نتیجه آن یک پیش‏هسته مادة بزرگ و واضح و سر اسپرم متراکم یا با تورم جزئی است(11).

اسپرمهای دچار آنومالیهای کروماتین مانند هیستون اضافی یا کمبود پروتامین هنگامی که وارد اووسیت بالغ می‏شوند مستعد تراکم زودرس کروماتین (PCC) می‌گردند که علت آن عملکرد فاکتور پیشبرنده تقسیم MPF فعال بر روی ساختار هیستونی غیرطبیعی موجود در اسپرم می‌باشد(12،13) و مدت زمانیکه هسته اسپرم برای خروج از تراکم زودرس کروماتین به طور نسبی (PPCC) و تبدیل شدن به پیش‏هسته نیاز دارد موجب نامساوی‏شدن اندازه پیش‏هسته‏ها می‏شود. لذا رویانی که از سلولهای تخم دارای پیش‌هسته‏های نامساوی تشکیل شده باشد، استعداد کمتری برای تشکیل بلاستوسیست، لانه‏گزینی و در نتیجه حاملگی دارد(7، 9).

در نتیجه مطالعة شاخصهای مؤثر در نامساوی بودن پیش‌هسته، ضروری بنظر می‏رسد. هدف این مطالعه بررسی تأثیر آنومالیهای کروماتین اسپرم مانند اختلالات کمبود پروتامین، هیستون اضافی، ناپایداری کروماتین، توانایی اسپرم برای خروج از تراکم به ترتیب به روشهای رنگ‌آمیزی CMA3 ، AB ، SDS ، SDS+EDTA و مرفولوژی اسپرم بر تفاوت اندازه پیش‌هسته‏ها بعد از IVF و ICSI است.

مواد و روشها

- آماده‏سازی اسپرم : نمونه‏ها از 115 زوج نابارور مراجعه‌کننده به مرکز باروری و ناباروری اصفهان بدست آمد. 55 نفر از این تعداد کاندید عمل ICSI و 60 نفر کاندید عمل IVF بودند. نمونه‏های منی بعد از 4-3 روز پرهیز از نزدیکی، جمع‏آوری و جهت استفادة از اسپرم برای IVF و ICSI قسمت عمده نمونه با پرکل (Seromed-Germany) (50-70-90) آماده‏سازی شد و بعد از تلقیح اووسیت و اسپرم، بخش باقیمانده نمونه اسپرم برای آنالیز و بررسی آنومالیهای مرفولوژی اسپرم و بررسی کروماتین به روش آنیلین‌بلو(AB) و CMA3، SDS، EDTA+SDS مورد استفاده قرار گرفت و 200 اسپرم برای هر شاخص شمارش شد.

- ارزیابی هیستون اضافی در روش رنگ‏آمیزی آنیلین‌بلو:

با قراردادن یک قطره از مایع سیمن به روی یک لام تمیز و کشیدن این قطره توسط لام دیگری که با زاویة 045 روی آن قرار دارد از نمونه اسمیر تهیه شد. اسمیرها برای مدت 30 دقیقه در گلوتار آلدئید

(Sigma-USA) 3% در بافر فسفات 2/0 مولار:

(14ml NaH2PO40.2 M + 36ml Na2HPO4 0.2 M pH=7.2) ثابت و سپس اسمیرها با رنگ آنیلین‌بلو 5% در اسید استیک 4%، با5/3 = pH به مدت 5 دقیقه رنگ‏آمیزی شدند(14).

- ارزیابی کمبود پروتامین توسط رنگ‏آمیزی کرومومایسین A3: نمونه‏ها در محلول کارنوی (متانول با اسید استیک گلاسیال به نسبت 3:1) در درجه حرارت 0C4 برای مدت 5 دقیقه ثابت شدند. سپس از نمونه‏های ثابت شده اسمیر تهیه شد. برای رنگ‏آمیزی کرومومایسین، هر اسلاید به مدت 20 دقیقه در ml100 از محلول CMA3 با غلظت mg/ml 25/0 که در بافر مک‏الوین حل شده بود (ml 7 اسید سیتریک 1/0 مولار+ ml9/32 Na2HPO47H2o 7=pH حاوی کلرید منیزیم mM10) قرار گرفت. سپس اسلایدها با بافر شستشو داده شد و با بافر گلسیرول به نسبت (1:1) مونت گردید. آنالیز میکروسکوپی با میکروسکوپ فلورسنت (Japan-Nikon-Eclipse600) با فیلتر مناسب

nm 600-470 صورت گرفت. با تعیین درصد اسپرمهای با رنگ زرد درخشان (CMA3 مثبت) و اسپرمهای با رنگ زرد کمرنگ (CMA3 منفی) ارزیابی میزان کمبود پروتامین انجام شد(5).

- تست پایداری کروماتین اسپرم SDS و میزان خروج از تراکم :SDS+EDTA ml50 از اسپرمی که با روش پرکل آماده شده بود، با ml350 محلول 1% SDS در بافر بورات M05/0 (9=pH) ml400 ~ تترابورات سدیم ml2/4+ M1/0 NaOH ml88) مخلوط و بعد از انکوباسیون به مدت 60 دقیقه در دمای C037، واکنش بوسیله حجم معادل از گلوتارآلدئید 5/2% در بورات بافر M5/0 متوقف شد و وضعیت تورم هسته بعد از رنگ‏آمیزی با گیمسا مورد بررسی قرار گرفت. سپس درصد ناپایداری یا تراکم اسپرم تعیین شد.

جهت انجام روش SDS+EDTA، به محلولSDS 1%، mM6، EDTA اضافه شد و بقیه مراحل مطابق روش SDS انجام گرفت(15).

بررسی اسپرم: برای شمارش اسپرمها از شمارش‏گر Chamber Makler استفاده و بعد از بی‏حرکت‏کردن اسپرمها با یک محلول ثابت‏کننده تعداد بصورت میلیون در میلی‏لیتر بیان شد. درصد حرکت با بررسی مستقیم میکروسکوپی ارزیابی و مرفولوژی بوسیله رنگ‏آمیزی پاپانیکولا مطابق با تکنیک Strict Criteria بررسی گردید(16).

روش IVF : تخمکها تحت هدایت سونوگرافی جمع‏آوری و سپس در محیط IVF-20 در زیر روغن کشت و پس از آن در محیط IVF-20 تلقیح شدند. وقوع لقاح بوسیله میکروسکوپ معکوس ، 19-17 ساعت بعد از تلقیح بررسی شد.

روش ICSI: بعد از جمع‏آوری تخمک‌ها، در محیط

IVF-20 حاوی هیالورونیداز IU/ml80 (Sigma-USA) به مدت کمتر از یک دقیقه انکوبه شدند. سپس تخمکها شستشو داده شد تا هیالورونیداز از محیط حذف و سلولهای اطراف اووسیت نیز جدا شود. سرانجام تخمک‏های برهنه شده به محیط کشت HEPES+HAM’S زیر روغن در ظرف کشت فالکون مخصوص میکرواینجکشن انتقال داده شدند. اسپرمهای آماده شده در قطرات PVP قرار گرفتند. در زیر میکروسکوپ معکوس بهترین اسپرم از لحاظ مرفولوژی از میان اسپرمها انتخاب و بوسیله سوزن میکرواینجکشن به داخل تخمک تزریق شد. تخمک‏های تزریق شده درمحیط G1.2 انکوبه و تخمک‏های مسن و نارس از این مطالعه حذف شدند.

بررسی اندازه پیش‌هسته‏ها: در طی بررسی لقاح، وجود و تعداد پیش‌هسته‏ها زیر میکروسکوپ معکوس ثبت و برای بررسی اندازه پیش هستة غیرمساوی از صفحة نمایش متصل به میکروسکوپ استفاده شد. دو پیش‏هسته که اختلاف بین آن دو بیش از 15% مطابق فرمول زیر باشد غیرمساوی در نظر گرفته شدند.

تفاوت بین قطر دو پیش‌هسته به قطر بزرگترین پیش‌هسته ضربدر100. درصورتیکه اختلاف دو پیش‌هسته کمتر از 15% باشد بعنوان مساوی در نظر گرفته شد.

استانداردکردن نتایج: استانداردکردن طبق روش ارائه شده در مقالة قبلی مؤلف انجام شد(5). بدین ترتیب که ارزیابی 100 سلول در 10 میدان دید متفاوت میکروسکوپی (جمعاً 1000 سلول) از همان نمونه منی جهت تعیین ضریب خطای بیرونی و جهت تعیین ضریب خطای درونی انجام تست‏های ارزیابی بلوغ هسته اسپرم و شمارش 200 سلول در 5 نمونه مختلف از همان بیمار استفاده شد. برای محاسبه ضریب واریانس از فرمول انحراف معیار تقسیم بر میانگین ضربدر 100 استفاده و ضریب واریانس در نتایج کمتر از 11% برای تمامی تستهای بلوغ هسته تعیین شد.

- آنالیز آماری: آنالیز آماری با استفاده از نرم‏افزار SPSS-10 انجام گرفت. با استفاده از این نرم‏افزار ضریب همبستگی تمامی شاخصها بررسی و همچنین با استفاده از آزمون t-test اختلاف میانگین درصد لقاح، درصد زیگوت‏های با پرونوکلئوس نامساوی و امتیاز کیفیت جنین در دو گروه CMA3 مثبت کمتر از 30% و بیشتر از 30% تعیین شد.

نتایج

جدول شماره 1 ارتباط بین درصد اووسیت‌های با پیش هسته‌های نامساوی یا آنومالیهای کروماتیس اسپرم را نشان می‌دهد در مورد روش ICSI یک ارتباط معنی‌دار بین درصد پیش هسته‌های نامساوی با کمبود پروتامین و هیستون اضافی موجود در اسپرم شستشو داده شده مشاهده شد؛ همچنین یک ارتباط منفی بین درصد اووسیت‌های با پیش هسته‌های نامساوی و توانایی خروج از تراکم اسپرم که بوسیله SDS+EDTA اندازه‌گیری شده بود بدست آمد. بین هیچ یک از پارامترهای فوق‌الذکر با درصد زیگوت‌های با پرونوکلئوس نامساوی قبل از شستشو در نمونه سیمن رابطه‌ای دیده نشد. همچنین با پارامترهای اسپرمی نیز ارتباطی در روشهای IVF و ICSI مشاهده نشد. اگرچه در این بررسی مطالعه پایداری کروماتین (تست SDS) ارتباط مهمی مشاهده نشد. این نتایج بیانگر آن است که هر چه درصد اسپرمهای با کمبود پروتامین با اسپرمهای دارای هیستون اضافی و همچنین قدرت خروج از تراکم اسپرم کمتر باشد، شانس تشکیل زیگوت با پرونوکلئوس نامساوی افزایش می‌یابد(جدول شماره 1). با توجه به اینکه عده‌ای از محققین CMA3 مثبت کمتر از 30% واحد طبیعی در نمونه سیمن می‌دانند؛ لذا در جدول شماره 2 بیماران به دو گروه براساس درصد CMA3 مثبت آنها گروه‌بندی شدند و نتایج بیانگر است که در بیماران IVF و ICSI میانگین اختلاف درصد زیگوت‌ها با پرونوکلئوس نامساوی و میزان لقاح در دو گروه کمتر و بیشتر از 30% متفاوت می‌باشند.

بحث

لقاح پدیده‏ای است که در طی آن گامت نر و ماده با الگوی متفاوت کروماتین به پیش‌هسته‏ها تبدیل می‏شوند. اگرچه پذیرفته شده است که پدیده‏های مرتبط با لقاح باید ترجیحاً بصورت هماهنگ عمل کرده تا تکامل بطور طبیعی ادامه پیدا نماید؛ ولیکن هیچگونه اطلاعاتی در مورد تأثیر پیش‌هسته‏های غیرمساوی بر روی تکامل جنین وجود ندارد. هدف این مطالعه ارزیابی آنومالیهایی است که ممکن است در روند طبیعی تشکیل پیش‌هسته‏ها تأثیر داشته باشد. گزارشهای اخیر بیانگر این است که آنومالیهای مرفولوژیک پیش‌هسته‏ها شامل اندازه، موقعیت قرارگیری و توزیع محتویات آنها، بر رشد تخم، لانه‏گزینی و حاملگی تأثیر می‏گذارد(10-7). از میان مشخصات مرفولوژیک پیش‌هسته‏ها، نامساوی بودن پیش‌هسته تأثیر بیشتری بر تکامل جنین دارد. فاکتورهایی که روی اندازه پیش‌هسته تأثیر دارد چندان مشخص نشده‏اند، فقط یک گزارش در مورد اندازه نامساوی پیش‌هسته در انسان وجود دارد که حاکی از آن است که اندازه نامساوی پیش‌هسته‏ها مربوط به تغییرات بعد از بلوغ در اووسیت می‏باشد.

در این مطالعه Goud و همکارانش در سال 1999 به بررسی وضعیت پیش‌هسته اووسیت‏های خواهری در ICSI بلافاصله بعد از بلوغ یا 6 ساعت پس از بلوغ پرداختند و نتیجه گرفتند که درصد پیش‌هسته‏های نامساوی هنگامی که ICSI با تأخیر انجام می‏گیرد

(6 ساعت) افزایش می‏یابد. آنها پیشنهاد کردند که این پدیده می‌تواند مربوط به فاکتورهای زیر باشد؛ عدم خروج از تراکم کروماتین بطور کامل می‏تواند ناشی از کاهش فعالیت فاکتورهای لازم جهت خروج از تراکم مانند کاهش سطح گلوتاتیون باشد(17، 18).

افزایش حساسیت اووسیت‏های مسن به تحریکات فعال‏کننده منجر به فعال‏شدن خودبه‏خودی مانند بکرزائی می‏گردد. این تحریکات می‏تواند ناشی از فرآیند تزریق باشد که در نهایت منجر به پیش‌هسته ماده کاملاً مشخص و یک هسته اسپرم متراکم و یا نسبتاً نامتراکم می‏گردد(19).

مطالعه دیگری که توسط Fulka و همکارانش انجام شد، نشان داد که نتیجه تزریق اسپرم با تأخیر بیش از 2 ساعت به داخل تخمک‏های فعال‏شده موش، تشکیل غیرطبیعی پیش‌هسته‏ها و همچنین تکامل و لانه‏گزینی غیرطبیعی جنین می‏باشد. این محققین چنین نتیجه گرفته‏اند که فاکتورهای سیتوپلاسمی که امکان تبدیل هسته اسپرم را به پیش‌هسته پدری می‏دهد در طی

2-5/1 ساعت پس از لقاح یا با فعال‏شدن تخمک کاهش می‏یابد و بنابراین ژن پدری که در اولین سیکل سلولی تخم شرکت نکند و یا با سیکل سلولی همگام نشود، نمی‏تواند بعنوان یک بخش فعال در ژنوم جنینی شرکت کند(20).

هماهنگی تشکیل پیش‌هسته‏ها و سیکل سلولی بین گامت مرد و زن به شدت به ساختمان کروماتین اسپرم وابسته است(13). در طی مراحل ساخت اسپرم ، پروتامین جایگزین هیستون می‏شود و پل‏های دی‏سولفیدی مطلوب در طی مراحل ساخت اسپرم و عبور از اپی‏دیدیم تشکیل می‏شوند. این ساختار بعداً با تشکیل پیوندهای غیرکوالانسی بین گروههای سولفیدریل و Zn²+ بعد از انزال پایدارتر می‏گردند(21). پس از لقاح و برداشت Zn²+، باندهای دی سولفیدی با فعالیت گلوتاتیون اووسیت کاهش پیدا می‏کند. به دنبال این پدیده پروتامینها با هیستون‏ها جایگزین می‏شوند(22) و بعد از اینکه پروتامین در ساختمان اسپرم سازماندهی شد، MPF فعال نمی‏تواند روی این نوع کروماتین عمل کند؛ بنابراین اسپرم از PCC محافظت می‏شود(13). بدنبال غیرفعال شدن MPF در پی فعال شدن اووسیت و جایگزینی هیستون بجای پروتامین پیش‌هسته نر تشکیل می‏شود که نتیجة آن هماهنگی سیکل سلولی است.

اسپرمهایی که آنومالی کروماتین منجمله کمبود پروتامین یا هیستون اضافی دارند احتمالاً در طی لقاح مستعد PCC هستند. نوع PCC مشاهده شده با انواع آنومالیهای اسپرم ممکن است با نوع PCC در اثر کمبود کامل پروتامین فرق داشته باشد. چنین موقعیتی در تزریق اسپرماتید نابالغ به داخل اووسیت هم دیده می‏شود که در واقع این یکی از دلایل اصلی کم‏بودن میزان موفقیت تزریق اسپرماتیدهای گرد

(ROSI) است(13). بنابراین وقتی اسپرمی با کمبود نسبی پروتامین یا هیستون اضافی، وارد اووسیت در مرحله متافاز II می‏شود ممکن است پدیده PPCC به وقوع پیوندد. در نتیجه ممکن است مدت زمانی که جهت خروج از PPCC طول می‏کشد باعث اندازه غیریکسان پیش‌هسته‏ها شود. امکان دارد این فرضیه تفسیری برای ارتباط مثبت مشاهده شده بین کمبود پروتامین

(CMA3 مثبت)، هیستون اضافی (آنیلین بلو) و درصد زیگوت‏ها با اندازه پیش‏هسته نامساوی باشد(جدول1).

از آنجا که این رابطه تنها با نمونه‏ها پس از شستشو مشاهده شد این تفاوت را چنین می‏توان تفسیر کرد که اختلاف، ناشی از این حقیقت است که تعداد زیادی از اسپرمهایی که کروماتین غیرطبیعی دارند در طی روشهای آماده‏سازی حذف می‏شوند(23،24) و نمونه‏هایی که از ابتدا سطح بالایی از آنومالی‏های کروماتین دارند، پس از شستشوی نمونه، احتمالاً هنوز دارای اسپرم‏هایی با کروماتین غیرطبیعی هستند، که احتمال ورود این اسپرمهای غیرطبیعی در طی ICSI به داخل اووسیت وجود دارد(2،5).

در روش IVF برخلاف روش ICSI هیچ ارتباطی بین درصد پیش‌هسته‏های غیرمساوی با کمبود پروتامین مشاهده نشد و این ممکن است ناشی از این حقیقت باشد که زوناپلاسیدا مانند یک سد در مقابل اسپرمهای با کمبود پروتامین یا هیستون اضافی عمل می‏کند؛ بنابراین این اسپرم‏ها توانایی نفوذکردن به داخل اووسیت را ندارند. چون تحقیقات قبلی نشان داده است که تست CMA3 نسبت به آنیلین‏بلو برای تشخیص کمبود پروتامین تست حساس‏تری می‏باشد(5) به همین دلیل بین این تست و درصد زیگوت‏های با پیش‌هسته‏های نامساوی رابطه معنی‏دار با ضریب همبستگی بیشتری بدست آمده است. همچنین یک رابطه منفی بین توانایی خروج از تراکم به روش SDS+EDTA با درصد زیگوت‏های محتوی پیش‌هسته نامساوی در نمونه‏های ICSI مشاهده شد. این موضوع می‏تواند ناشی از این حقیقت باشد که کروماتین چنین اسپرمهایی وقتی وارد اووسیت می‏شوند تمایل بیشتری برای خروج از تراکم دارند و بنابراین MPF دسترسی بیشتری به کروماتین دارد و سریعتر روی کروماتین اسپرم عمل می‏کند که منجر بهPPCC می‏گردد، یک تفسیر دیگر این است که اسپرمهایی که سطح هیستون آنها بالاتر است، نسبت به اسپرمهایی که سطح هیستون پایین‏تری دارند، ممکن است برای خروج از تراکم توانایی بیشتری داشته باشند(25).

سعی می‏شود در طی ICSI اسپرمهای با مرفولوژی طبیعی انتخاب و به تخمکها تزریق شوند که این امر موجب کاهش درصد زیگوتهای با پیش‌هسته‏های نامساوی می‏شود. در صورتیکه برای ICSI اسپرمها بصورت تصادفی انتخاب شود احتمالاً درصد زیگوت‏ها با پیش‌هسته نامساوی افزایش می‏یابد.

مطالعات دیگر دانشمندان نشان می‏دهد که در نمونه‏هایی که درصد CMA3 مثبت آنها بیش از 30% می‌باشد میزان لقاح پایین‏تر است(3). بنابراین در این مطالعه بیماران نسبت به سطح CMA3 مثبت گروه‏بندی شدند و نتایج جدول 2 نشان داد که درصد زیگوتها با پیش‌هسته‏های نامساوی، میزان لقاح، ضریب کیفیت و میزان تقسیمات جنین در بیمارانی که CMA3 مثبت آنها بیش از 30% است در مقایسه گروه دارای CMA3 مثبت کمتر از 30% متفاوت می‏باشد.

در نتیجه، این مطالعه بیانگر آن است که بررسی وضعیت کروماتین در نمونه‏های منی از اهمیت خاصی برخوردار است. از آنجایی که کمبود پروتامین نه تنها مستقیماً روی میزان لقاح درIVF مؤثر است بلکه روی مرفولوژی پیش‌هسته‏ها بعد از ICSI و در نتیجه روی رشد اولیه رویان و احتمالاً روی لانه‏گزینی نیز مؤثر است(6،26). بنابراین برای ICSI باید از تکنیک‏هایی استفاده شود که اسپرمهای با کروماتین طبیعی را از نمونه جدا کند(23،24).

بعلاوه بهتر است روشها یا مداخلاتی همچون واریکوسلکتومی که ممکن است روی کیفیت اسپرم تأثیر گذارد و باعث بهبود وضعیت کروماتین اسپرم شود قبل از انجام ICSI انجام گردد(27).

تشکر و قدردانی

این مطالعه بخشی از طرح تحقیقاتی مصوب شماره80079-80078/80/P پژوهشکده رویان می‏باشد. نویسندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از مسئولین مؤسسه رویان، متخصصین و کارشناسان مرکز باروری و ناباروری اصفهان و همچنین مدیریت گروه علوم تشریح دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان ابراز می‏دارند.

  1. Palermo G.، Joris H.، Devrory P.، Van Steirteghem A.C. Pregnancy after intracytoplasmic injection of single spermatozoa into an oocyte. Lancet. 1992; 340:17-18.
  2. Van Steirteghem A.C., Liu J., Joris H., Nagy Z., Janssenwillen C., Tournay H., Deroey P.C. Higher success rate by intracytoplasmic sperm injection by sub zonal insemination: Report of a second series of 300 consecutive treatment. Hum Reprod. 1993;8: 1055-60.
  3. Iranpour F.G., Nasr-Esfahani M.H., Valojerdi M.R., al-Taraihi T.M. Chromomycin A3 staining as a useful tool for evaluation of male fertility. J Assist Reprod Genet. 2000;17(1):60-6.
  4. Sakkas D., Urner F., Bianchi P.G., BizzaroD., Wagnar I., Jaquenoud N., Manicardi G., Campana I. Sperm chromatin anomalies can influence decongestion after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod.1996;11:837-43.
  5. Nasr-Esfahani M.H., Razavi S., Mardani M. Relation between different human sperm nuclear maturity tests and in vitro fertilization. J Assist Reprod Genet. 2001;18 (4):199-205.
  6. Esterhuizen A.D., Franken D.R., Lourens J.G.H., Van Zyl C., Muller I.I., Van Rooyen L.H. Chromatin packaging as an indicator of human sperm dysfunction. J Assist Reprod Genet. 2000;17(9):508-14.
  7. Ludwig M., Schopper B., Katalinic A., Sturm R., Al-Hasani S., Diedrich K. Experience with the elective transfer of two embryos under the conditions of the German embryo protection law: results of retrospective data analysis of 2573 transfer cycles. Hum Reprod. 2000;15(2):319-24.
  8. Scott L., Alvero R., Lenodires M., Miller B. The morphology of human pronuclear embryo is positively related to blastocyst development and implantation. Hum Reprod. 2000; 15(11): 2394-403.
  9. Wittemer C., Bettahar-Lebugle K., Ohl J., Rongieres C., Nisand I., Gerlinger P. Zygote evaluation: an efficient tool for embryo selection. Hum Reprod. 2000;15(12):2591-7.
  10. Garello C., Barker H., Rai J., Montgomery S., Wilson P., Kennedy C.R., Hartshorne G.M. Pronuclear orientation, polar body placement, and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection and in-vitro fertilization: further evidence for polarity in human oocytes? Hum Reprod. 1999;14(10):2588-95.
  11. Goud P., Goud A., Van Oostveldt P., Van der Elst J., Dhont M. Fertilization abnormalities and pronucleus size asynchrony after intracytoplasmic sperm injection are related to oocyte post maturity. Fertil Steril.1999;72(2):245-52.
  12. Ma S., Yuen H. Intracytoplasmic sperm injection could minimize the incidence of prematurely condensed human sperm chromosomes. Fertil Steril. 2001;75(6):1095-101.
  13. Fishel S., Aslam I., Tesarik J. Spermatid conception: A stage too early, or a time too soon? Hum Reprod. 1996;11(3):1371-5.
  14. Terquem A., Dadoune J.P. Aniline blue staining of human spermatozoa chromatin: Evaluation of nuclear maturation.1983; In Andr J (editor), The sperm cell, J andr (ed), London, Martinus Nijhoff publishers, pp 696-701.
  15. Gonzales G.F., Salirrosas A., Dicina-Torres L.N., Sanchez A., Villena A. Use of clomiphene citrate in the treatment of men with high sperm chromatin stability. Fertil Steril. 1998;69:1109-114.
  16. Kruger T.F., Acosta A.A., Simmons K.F., Swanson R.J., Matta J.F., Oehninger S. Predictive value of abnormal sperm morphology in vitro fertilization. Fertil Steril. 1988;49:112-7.
  17. Perrault S.D., Barbee R.R., Slott V.L. Importance of glutathione in the activity and maintenance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes. Dev Biol. 1988;125:181-6.
  18. Yoshida M., Ishigaki K., Nagai T., Chikyu M., Purset V.G. Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig oocytes: relevance of the ability of the oocytes to form male pronucleus. Biol Reprod. 1993;49: 89-94.
  19. Flaherty S.P., Payne D., Matthews C.D. Fertilization failures and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1998;13(Suppl 1): 155-64.
  20. Bedford J.M., Bent M.J., Calvin H. Variation in the structural character and stability of the nuclear chromatin in morphology normal human spermatozoa. J Repod Fertil. 1973;33:19-29.
  21. Perrault S.D. Chromatin remodeling in mammalian zygotes. Mutat Res. 1992;296:43-55
  22. Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M., Mandrioli M., Bizzaro D., Bianchi P.G., Bianchi U. The use of two density gradient centrifugation techniques and swim up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum Reprod. 2000; 15: 1112- 1116.
  23. Hammadeh M.E., Kuhnen A., Amer A.S., Rosenbaum P., Schmidth W. Comparison of sperm preparation methods: effect on chromatin and morphology recovery rates and their consequences on the clinical outcome after in vitro fertilization embryo transfer. Int J Androl. 2001;24(6):360-8.
  24. Foresta C., Zorzi M., Rossato M., Varotto I. Sperm nuclear instability and staining with aniline blue:Abnormal persistence of histones in spermatozoa in infertile men. Int J Androl. 1992;15:330-7.
  25. Sakkas D., Urner F., Bizzaro D., Manicardi G., Bianchi U., Shoukir Y., Campana A. Sperm nuclear DNA damage and altered chromatin structure :Effect on fertilization and embryo development. Hum Reprod.1998;13:11-19.
  26. Nasr-Esfahani M.H., Behdadi Pour Z., Abbasi H., Zaman Soltani F., Mardani M., Abuhamzeh B. The effect of varicocelectomy on sperm parameters, membrane integrity and chromatin condensation. Yakhteh (cell) 2000;5:7-11.
  27. Fulka J., Horska M., Moor R.M., Fulka J. and Kanaka J. Oocyte-Specific modulation of female pronuclear development in mice. Dev Biol. 1996;178:1-12.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 4, Issue 2
Spring 2003
Pages 137-145