مقدمه

اسپرماتوژنز فرآیند تکاملی پیچیده‌ای است که به گونادوتروپین‌‌های هیپوفیز و تستوسترون وابسته است. این هورمون‌ها به‌طورغیرمستقیم و از طریق تولید موضعی تنظیم کننده‌ها، بر روی این مسیر اثر تنظیمی دارند. عقیده بر این است که مولکول‌هایی مانند فاکتور رشد شبه انسولین نوعI (IGF-I) در تکامل سلول‌های زایا نقش دارند. این فاکتور دارای اثرات مستقیم وغیرمستقیم برروی استروئیدوژنز، متابولیسم، تکثیر سلولی و تمایز سلولی است که عمل آن به‌واسطة اثر هورمون رشد تعدیل‌می‌گردد (2،1). ارتباط پاراکرین بین سلول‌های سرتولی و سلول‌های زایا به ‌‌واسطه IGF-I بسیار محتمل است. IGF-I درمایعات خارج سلولی به پروتئین‌هایی موسوم به پروتئین متصل شونده به IGF-I (IGFBPs) متصل می‌گردد که پروتئین اصلی این دسته IGFBP-3 است (5-3).

نقش فیزیولوژیک PSA در پلاسمای سمینال به‌طورکامل شناخته نشده است. این آنزیم، پروتئیناز اصلی این مایع بوده و باعث تجزیه سمینوژلین‌های I و II به پپتیدهایی با وزن مولکولی پایین می‌شود. پیشنهاد شده‌است که این عملکرد PSA به‌طورقابل‌توجهی از اثر مهارکنندگی سمینوژلین‌ها برروی قدرت تحرک اسپرم می‌کاهد(6). PSA همچنین به‌عنوان یک IGFBP-3 پروتئنیاز مطرح می‌باشد؛ بنابراین احتمالاً در تعدیل عملکرد IGF-I نیز نقش دارد(7).

بنـابــرایـن IGF-I فاکتــوری مهـم در تـکامـل اسپــرم می‌باشد(1)..نقـش PSA به‌عنـوانIGFBP-3 پـروتئینـاز، باعث‌می‌شود که ‌میزان IGF-I آزاد پلاسمای سمینال افزایش یابد. بنابراین PSA به‌طور غیرمستقیم و ازطریق افزایش سطح IGF-I در‌دسترس، در تکامل اسپرم‌ها نقش دارد(7).

Lee و همکاران اختلاف معنی‌داری را در سطح IGF-I مایع سمینال بین افراد طبیعی و بیماران وازکتومی شده و یا دچار آزواسپرمی ایدیوپاتیک مشاهده‌نکردند(8). Glander و همکاران همبستگی مثبت معنی‌داری بین غلظت IGF-Iمایع سمینال با غلظت اسپرم و درصد اسپرم‌های دارای مورفولوژی طبیعی مشاهده‌نمودند؛ اما این همبستگی با غلظت PSA معکوس‌بود (1). Macpherson و همکاران همبستگی معنی‌داری بین سطح IGF-I پلاسمای سمینال و تحرک و مورفولوژی اسپرم بدست‌آوردند(3).

با توجه به نتایج متفاوتی که در زمینه بررسی سطوح IGF-I و PSA در پلاسمای سمینال و نیز ارتباط این دو با یکدیگر و با پارامترهای کیفیت اسپرم به خصوص درشرایط in vivo گزارش شده‌است، مطالعة مورد- شاهدی حاضر به روش نمونه‌گیری تصادفی ساده انجام‌شد تا تغییرات سطوح IGF-I و PSA به‌طورتوأم در پلاسمای سمینال و سرم مردان نابارور ایدیوپاتیک بررسی‌گردد. به علت اینکه عمدة مطالعات در این زمینه محدود به پلاسمای سمینال می‌باشد تغییرات سرمی این فاکتور‌ها نیز در مطالعة حاضر بررسی شد. همچنین به‌جای استفاده از افراد بارور نرمواسپرم به‌عنوان شاهد، مردان نابارور نرمواسپرم انتخاب‌ گردیدند.

مواد و روشها

نمونه‌های مورد مطالعه، مردان مبتلا به ناباروری ایدیوپاتیک مراجعه‌کننده به بخش IVF بیمارستان الزهراء دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تبریز از مهرماه تا اسفند ماه 1381 بودند که به‌طورتصادفی و براساس شمارش کامل اسپرم و قدرت تحرک آن طبق معیار سازمان جهانی بهداشت (WHO) انتخاب‌گردیدند(9). براساس داده‌های حاصل از مطالعات قبلی و بااستفاده از α برابر 05/0 و β برابر 1/0 (توان 90%) حداقل حجم نمونه موردنیاز در‌هر گروه 20 نمونه محاسبه‌گردید. گروه مورد و شاهد به‌ترتیب شامل 29 و 23 مرد مبتلا به ناباروری ایدیوپاتیک بود. براساس معیار سازمان بهداشت جهانی (WHO) مردان با شمارش کامل اسپرم کمتر از 20 میلیون به‌عنوان الیگواسپرم و بالاتر از این‌حد به‌عنوان نرمواسپرم درنظر گرفته‌شدند. ازنظر قدرت تحرک اسپرم نیز نمونه‌های با قدرت تحرک بالاتر از 50% طبیعی درنظر گرفته‌شدند. مردان با شمارش کامل اسپرم کمتر از 5 میلیون و نیز مردان آزواسپرم از مطالعه خارج‌شدند. نمونة سیمن بعد از 72-48 ساعت پرهیز از تماس جنسی و به‌وسیله استمناء از هر دو گروه مورد مطالعه جمع‌آوری‌گردید. همچنین به‌طورهمزمان نمونه‌های خون از هردو گروه گرفته‌شد. نمونه‌ سیمن دردمایºC 37 وبه‌ مدت 30 دقیقه قرارداده‌شد تا به‌طور کامل به ‌مایع تبدیل‌شوند. سپس بااستفاده‌‌ از دستگاه Sperm Quality Analyzer (SQAIIC,USA) پارامتر‌های کیفیت اسپرم یعنی تحرک، تعداد و مورفولوژی ارزیابی‌ گردید. نمونة سیمن مایع‌شده به مدت 5 دقیقه در 4000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد و سپس مایع رویی که پلاسمای سمینال است جدا ‌گردید و جهت انجام آزمایش‌های مورد نظر در دمایºc20 منجمدشد. سرم نیز پس از سانتریفوژ 3000 دور و به مدت 5 دقیقه، از نمونة خون جدا و در همین دما نگهداری‌گردید. IGF-I وPSA با استفاده از کیت‌های تجاری ایمنورادیومتریک‌اسی(IRMA) در دسترس، اندازه گیری‌شدند.اندازه گیری IGF-I با استفاده از کیت DSL (Texas, USA) انجام شد. ابتدا دو لوله میکروسانتریفوژ به ازای هرنمونه انتخاب گردید (یکی جهت استخراج و دیگری برای خنثی‌سازی). سپسµl 50 از نمونه در لولة اول ریخته‌شد و به‌دنبال آن µl 200 از محلول استخراج به آن اضافه‌گردید که پس از هم‌زدن، به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه‌شد. زمان انکوبه‌کردن نباید بیش از 60 دقیقه طول‌بکشد. سپس عمل میکروسانتریفوژ بادور rpm10000 و به مدت سه دقیقه در درجه حرارت اتاق انجام‌گرفت. µl 100 از محلول رویی را به لوله دوم (لوله خنثی سازی) منتقل کرده وµl 500 از محلول خنثی‌کننده به آن افزوده‌شد. از این نمونة خنثی‌شده، پس از استخراج جهت تست استفاده‌گردید. سپسµl 50 از هریک از استانداردها، کنترل‌ها و نمونه‌های استخراج‌شده را به لوله‌های پوشیده شده از آنتی‌بادی ضد IGF-I منتقل‌کرده و بلا‌فاصله µl 200 از آنتی‌بادی دوم نشاندارشده با ٌیدرادیواکتیو(125Ι) به لوله‌ها اضافه‌گردید و پس از هم‌زدن روی شیکر با سرعت rpm180 به‌مدت 3 ساعت، مایع رویی را تخلیه‌کرده و بعد از شستشو با بافر آنها را خشک و در دستگاه گاما کانتر( Kontron II, Switzerland) به مدت یک دقیقه میزان رادیواکتیویته بر حسب CPM اندازه‌گیری شد، سپس با تعیین میزان CPM برای نمونه‌های استاندارد و رسم منحنی استاندارد، میزان غلظت IGF-1 در نمونه‌های بیماران تعیین‌گردید. برای اندازه‌گیری PSA با استفاده از کیت شرکت Immunotech (Montreal, Canada) به این طریق عمل‌شد که µl 100 از استانداردها، کنترل‌ها و نمونه‌ها به لوله‌های مربوطه اضافه و سپس به هر یک از لوله‌ها µl 100 از نشانگر اضافه‌گردید. همه لوله‌ها در درجه حرارت اتاق و روی شیکر به مدت 2 ساعت انکوبه‌شدند. سپس مایع رویی تخلیه و لوله‌ها با آب دیونیزه شستشو داده‌شد. میزان رادیواکتیویته به مدت یک دقیقه در گاماکانتر برحسب CPM تعیین گردید که با رسم منحنی استاندارد میزان غلظت PSA در نمونه‌های بیماران مشخص شد. به‌منظور آنالیز داده‌ها از آزمون t-test جهت مقایسة میانگین پارامترهای کیفیت اسپرم (مورفولوژی و تعداد اسپرم) و سطح سرمی و پلاسمای سمینال IGF-I و PSA بین افراد مورد و شاهد استفاده ‌گردید. مقایسه تحرک اسپرم بین دو گروه با استفاده از آزمون آماری غیرپارامتریMann- whitney انجام‌شد. کلیه آزمون‌های آماری به صورت دو دنباله‌ای با 05/0= α درنظرگرفته‌‌شد. میزان سطح IGF-I و PSA و نیز پارامترهای کیفیت اسپرم به صورت میانگین، گزارش شده‌است. آنالیزهای آماری با استفاده از نرم افزار 10 SPSS انجام ‌گرفت.

نتایج

میانگین و انحراف معیار از میانگین (SEM) پارامترهای کمی و کیفی اسپرم شامل تعداد اسپرم، تحرک و مورفولوژی آن که در مردان نابارور ایدیوپاتیک اندازه‌گیری شده‌است در جدول شماره 1 گزارش شده‌است.

این مردان فقط بر اساس تعداد کامل اسپرم، طبق معیار سازمان جهانی بهداشت، به دو گروه الیگواسپرم و نرمواسپرم تقسیم‌بندی‌شدند. در واقع گروه شاهد (نرمواسپرم) مردان نابارور ایدیوپاتیک آستنواسپرم وگروه نمونه (الیگواسپرم) مردان نابارور ایدیوپاتیک الیگوآستنواسپرم بودند. سپس میزان سطح کامل IGF-I و PSA در سرم و پلاسمای سمینال این دو گروه ارزیابی‌گردید که میانگین و انحراف معیار از آن در جدول شماره 2 آورده‌ شده‌است. میانگین سنی هر دو گروه نیز 2±32 سال بود. با توجه به جدول شماره 1 تعداد کامل و قدرت تحرک اسپرم‌ها در گروه الیگواسپرم به‌طورمعنی‌داری کمتر از گروه نرمواسپرم بود (05/0 p<). قدرت تحرک اسپرم در هر دو گروه کمتر از حد طبیعی (طبق معیار WHO) بود؛ ولی در گروه الیگواسپرم این مقدار بسیار کمتر از حد طبیعی (طبق معیار WHO) مشاهده‌گردید. مورفولوژی اسپرم‌ها در هر دو‌گروه در حد طبیعی‌بود و بین این دو گروه تفاوت معنی‌داری مشاهده‌ نگردید.

از نظر مقایسة میزان سطح کامل IGF-I و PSA در سرم و پلاسمای سمینال بین دو گروه مورد مطالعه نتایج مشاهده‌ شده به این ترتیب گزارش‌گردید:

میانگین سطح کاملIGF-I پلاسمای سمینال در مردان الیگواسپرم (ng/ml 06/24±39/142) به‌طورمعنـی‌داری کمتـر از گروه نرمواسپرم ( ng/ml62/33±86/247) بود (05/0 p<). میانگیــن سطـح سـرمی IGF-I در مـردان نابارور الیگواسپرم (ng/ml 07/17±06/235)تفاوت معنی‌داری را با مردان نابارور نرمواسپرم (ng/ml 50/15±89/193) نشان‌نداد. ازنظر مقایسة میانگین سطح کامل IGF-I پلاسمای سمینال و سرم در هر کدام از گروههای مورد مطالعه مشاهده‌ شد که در گروه نرمواسپرمIGF-I پلاسمای سمینال در حدود 5/1 برابر آن در سرم بود. اما در گروه الیگواسپرم این حالت برعکس مشاهده‌شد، به طوری که میانگین سطح کامل IGF-I سرم در این گروه در حدود 7/1 برابر پلاسمای سمینال بود. میانگین سطح کامل PSA پلاسمای سمینال بین دو گروه نرمواسپرم(µg/ml07/247±34/1282)والیگواسپرم (µg/ml 36/259±69/1630) تفاوت معنی‌داری را بین دو گروه نشان‌نداد (05/0p>). اختلاف میانگین سطح کاملPSA سرم بین دو گروه الیگواسپرم (ng/ml 33/0±43/2) و نرمواسپرم ( ng/ml15/0±94/1) نیز از نظر آماری معنی‌دارنبود.

در مقایسه میانگین سطوح کاملPSA پلاسمای سمینال و سرم در هر کدام از گروه‌های مورد مطالعه مشاهده‌شد که در هر دو گروه میزان آن در پلاسمای سمینال بسیار بیشتر از سرم‌ بود.

بحث

این مطالعه جهت بررسی سطح کاملIGF-I و PSA در سرم و پلاسمای سمینال افراد نابارور ایدیوپاتیک انجام‌‌پذیرفت. در این تحقیق مشاهده ‌شد که میانگین سطح کاملIGF-I پلاسمای سمینال در گروه الیگواسپرمی به میزان معنی‌داری پایین‌تر از گروه نرمواسپرم بود.IGF-I به‌عنوان یک فاکتور مهم در عملکرد دستگاه تناسلی مطرح‌است. این فاکتور یک پلی‌پپتید میتوتیک است که علاوه بر نقش متابولیکی، اثر تحریکی بر تکثیر و تمایز سلولی دارد. ترشح IGF-I به وسیله سلول‌های لیدیگ، سرتولی و پری توبولار نشان ‌داده ‌شده‌ است. الگوهای سلولی بیان ژن این پلی‌پپتید، اشاره بر این موضوع‌دارد که ممکن است IGF-I نقش مهمی را در عملکرد بیضه‌ها و تکامل سلول‌های زایا داشته‌باشد (3-1). Glander و همکاران نشان ‌دادند که در مردان نابارور وازکتومی شده میزان سطح IGF-I پلاسمای سمینال به‌طورمعنی‌داری پایین‌تر از مردان بارور است و نتیجه ‌گرفتند که این پلی‌پپتید ممکن‌است به‌عنوان مشخصه در تمایز سلول‌های زایای مردان عمل‌ نماید(1). همچنین آنها نتیجه ‌گرفتند که این یافته می‌تواند تأییدکننده این فرض‌ باشد که منشا IGF-I پلاسمای سمینال، اپیدیدیم و یا بیضه‌ها هستند.

در مطالعة حاضر نیز میزان سطح IGF-I پلاسمای سمینال در گروه الیگواسپرم به‌طــورمعنـی‌داری پایین‌تر از مردان نرمواسپرم بود با این تفاوت که در مطالعه ما هر دو گروه نابارور ایدیوپاتیک بودند. در برخی مطالعات نشان داده شده‌است که هورمون رشد در پلاسمای سمینال نیز وجود دارد. با توجه به اینکه IGF-I به‌عنوان میانجی اصلی در عملکرد هورمون رشد مطرح‌است، بنابراین احتمال ‌می‌رود که عمدة IGF-I موجود در پلاسمای سمینال ناشی از اثر هورمون رشد باشد. در افراد نابارور وازکتومی شده، نشان داده ‌شده ‌است که میزان هورمون رشد موجود در پلاسمای سمینال به طورمعنی‌داری کمتر از افراد طبیعی است، بنابراین احتمال می‌رود که حداقل بخشی از آن از بیضه‌ها و یا اپیدیدیم ترشح ‌شود(1). در مطالعة حاضر سطح کاملIGF-I پلاسمای سمینال و سرم به‌طورتوأم بررسی شد که تفاوت معنی‌داری در سطح سرمی IGF-I بین دو گروه مورد بررسی، علیرغم تفاوت معنی‌دار در پلاسمای سمینال، مشاهده‌‌نشد. این یافته می‌تواند تأییدی بر این امر باشد که بخشی از این فاکتور رشد از بیضه‌ها و یا اپیدیدیم ترشح‌ می‌گردد.

با توجه به اینکه پروتئین اصلی متصل شونده به IGF-I در مایعات خارج سلولی IGFBP-3 است، بنابراین انتظار می‌رود که بین سطح این دو پلی‌پپتید همبستگی معنی‌داری وجود‌ داشته ‌باشد(10،‌8 ،1). این همبستگی در سرم نشان ‌داده ‌شده ‌است، اما در پلاسمای سمینال این امر مشاهده نشده‌است(1). این امر ناشی از عمل پروتئینازی PSA در پلاسمای سمینال است که بر روی پـروتئیـن IGFBP-3، مهمتـریـن ناقل IGF-I، اثر کرده و مقدار قابل توجهی از آن را تجزیه ‌می‌کند(7،1).

از طرف دیگر PSA با تاثیر بر روی سمینوژلین‌ها باعث افزایش قدرت تحرک اسپرم‌ها می‌گردد(6). این امر در بـررسـی که Elzanaty و همــکاران در مـردان بــارور انجام‌دادند نشان داده‌شد. در مطالعة ذکر شده همبستگی مثبت معنی‌داری بین میزان سطوح PSA پلاسمای سمینال و قدرت تحرک اسپرم‌ها مشاهده‌گردید(7). در مطالعه حاضر نیز PSA پلاسمای سمینال تفاوت معنی‌داری را بین دو گروه مورد بررسی نشان‌نداد. با توجه به اینکه در این مطالعه به‌جای استفاده از افراد طبیعی به‌عنوان گروه شاهد، از افراد ناباروری استفاده‌گردید که قدرت تحرک اسپرم در آنها نظیر گروه مورد پایین‌تر از حدطبیعی بود، بنابراین این نتیجه به‌طورغیرمستقیم می‌تواند دلیلی بر نقش احتمالی PSA در تحرک اسپرم‌ها باشد. در واقع علت اینکه از مردان نابارور ایدیوپاتیک آستنوآزواسپرمیک به‌عنوان گروه شاهد و از مردان نابارور ایدیوپاتیک الیگوآستنوآزواسپرمیک به‌عنوان گروه مورد استفاده‌شد نیز به همین منظور بود. با توجه به نتایج حاصل از سایر تحقیقات و این مطالعه، به علت اینکه موارد مجهول زیادی در رابطه با نقش و عملکرد فاکتورهای رشد شبه انسولین در اسپرمیوژنز و اسپرماتوژنز وجوددارد پیشنهاد می‌گردد که هر دو فاکتور IGF-I و IGF-II به همراه انواع IGFBP هم از نظر تغییرات غلظت آنها و هم از جنبه بیان ژن‌های مربوطه در بیضه مورد بررسی قرارگیرد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از همکاری همکاران محترم بخش IVF بیمارستان الزهراء دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تبریز تشکر و قدردانی می‌گردد.