Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Effect of vapor phase cryopreservation on acrosome of spermatozoa in fertile and subfertile men

Authors
Tahmineh Peirouvi 1
Maerefat Ghaffari 2
Jafar Soleimanirad 3
Laeya Farzadi 4
1 Department of Histology, Faculty of Medicine, Urmia University of Medical Sciences, Urmia, Iran
2 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
3 Anatomy Department, Faculty of Medicine, Tabriz Medical Sciences University, Tabriz, Iran
4 Department of Obstet . and Gynecol . of Tabriz University of Medical Science, Tabriz, Iran
Abstract
Introduction: Acrosome is a cap-like structure which contains several hydrolytic enzymes necessary for acrosome reaction. Generally, acrosome reaction would be important if it occured on the zona pellueida, other wise; the spermatozoa could not penetrate through this layer. On the other hand, freezing- thawing process can damage acrosome membrane and reduce the sperm fertilizing potential. There is little information about the effects of vapor phase cryopreservation on acrosome. The aim of the persent study is to evaluate the effect of vapor phase cryopreservation on acrosome of spermatozoa of subfertile and fertile men. Materials and Methods: In this study, semen samples were collected from subfertile (n=20) and fertile men (n=10) after 48 h abstinence of intercourse. After semen analysis by Semen Analyzer Quality according to WHO criteria, each semen sample was divided into two portions (100 µl each). The first portion was stained with triple staining to show the quality of acrosome and the second portion was stained after vapor phase cryopreservation and thawing. Results were analyzed by paired t-test. Results: Before vapor phase cryopreservation, mean percentage of live spermatozoa with intact acrosome in subfertile men and fertile men were 26±3.64 and 33.37±4.07, respectively, but it decreased following vapor phase cryopreservation-thawing to 11.6±1.82 in subfertile and 9.87±2.97 in fertile men. Conclusion: It is concluded that vapor phase cryopreservation, impairs acrosome structure and causes destruction of acrosome and extrudes acrosomal enzymes in absence of oocyte. Therefore cause reduction of fertility of spermatozoa in fertile and subfertile men.
Keywords
Acrosome
Assisted Reproductive Techniques
Fertility
Infertility
Sperm
Vapor phase cryopreservation

مقدمه

آکروزوم اسپرم ساختمانی مشتق از دستگاه گلژی است که مانند یک کلاهک ناحیه قدامی هسته را می‌پوشاند و محتوی آنزیم‌های هیدرولیتیک متعددی است(1).

آکروزوم از دو بخش قدامی و خلفی به نام سگمان استوایی تشکیل شده است(2). پس از ظرفیت‌گیری ، اسپرم توانایی اتصال به زوناپلوسیدا را به دست می‌آورد و به گیرنده‌های زوناپلوسیدا متصل می‌گردد (2). اتصال اسپرم به گیرنده‌های زوناپلوسیدا باعث آغاز واکنش آکروزومی می‌شود که گام مهمی در عمل لقاح است (3،2). واکنش آکروزومی شامل فیوژن ، وزیکوله شدن ، از دست دادن غشای آکروزومی خارجی و غشای پلاسمایی اسپرم روی آکروزوم، آزادسازی آنزیم‌های آکروزومی است(2،4،5).

واکنش آکروزومی روند اگزوسیتوزی وابسته به کلسیم است که با فیوژن غشای آکروزومی و غشای پلاسمایی اسپرم و آزادسازی محتویات آکروزوم مشخص می‌گردد و در این روند وزیکول‌های غشایی هیبرید تشکیل می‌شوند(6). فیوژن غشا و وزیکوله‌شدن برای نفوذ به زوناپلوسیدای اطراف تخمک لازم است(7). روند اگزوسیتوز، ناحیه قدامی سراسپرم را درگیر می‌کند و به طرف سگمان استوایی گسترش می‌یابد(8). در طی سرد نمودن اسپرم از دمای ˚C4 به صفر درجه سانتیگراد، غلظت یون کلسیم در داخل سلول افزایش می‌یابد. ازطرف دیگر فسفولیپیدهای غشایی در غشا اسپرم منجمدشده افزایش می‌یابد. افزایش فسفولیپید می‌تواند باعث شروع واکنش آکروزومی در اسپرم شود(29).

اعتقاد بر این است که فرآیند انجماد- ذوب به غشای پلاسمایی روی قسمت قدامی سر اسپرم و غشای آکروزومی زیرین آسیب می‌رساند و منجر به پارگی آکروزوم و کاهش ماتریکس آکروزومی می‌شود و در نتیجه باعث کاهش تعداد اسپرم‌های عملکردی در دسترس برای تکنیک‌های باروری کمک شده (ART) -به استثنای روش میکرواینجکشن (ICSI) - می‌گردد (10،9). هدف این مطالعه، بررسی میزان آسیب آکروزومی در خلال انجماد در فاز بخار می‌باشد.

مواد و روشها

در این بررسی تجربی- مداخله‌ای، از 20 مرد نابارور الیگواسپرم با تراکم اسپرم کمتر از 20 میلیون در میلی‌لیتر و 10 مرد بارور با تراکم اسپرم بیش از 100میلیون در میلی‌لیتر بعد از 48 ساعت‌ خودداری از مقاربت، نمونه منی دریافت شد. نمونه‌ها به طریق استمنا در داخل ظرف پلاستیکی دهان گشاد در بیمارستان الزهرا دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز جمع‌آوری گردید. نمونه‌گیری از مهرماه تا دی ماه سال 1382 انجام شد. افراد الیگواسپرم برای درمان و افراد بارور ( افراد دارای حداقل یک فرزند و دارای اسپرموگرام طبیعی براساس معیارهای WHO) به‌صورت داوطلبانه (پیرو درخواست محققین، با اعلام رضایت جهت همکاری در طرح) به آن مرکز مراجعه ‌نمودند. به منظور مایع شدن ، نمونه‌ها به مدت30-20 دقیقه در انکوباتور (˚C37) (Memmert, Germany) نگهداری شدند. پس از تبدیل مایع سیمن به حالت مایع، نمونه‌ها براساس معیارهای سازمان بهداشت جهانی (1999) از نظر حجم، تعداد اسپرم، تحرک و مورفولوژی توسط دستگاه سیمن آنالیزر (Medical Electronics System, USA) (11) آنالیز و باقیماندة هر نمونه به دو قسمت با حجم l100 تقسیم شدند.

قسمت اول نمونه‌های افراد الیگواسپرم و بارور از نظر وضعیت آکروزوم به کمک رنگ‌آمیزی سه گانه (12) بررسی‌شدند و قسمت دوم نمونه‌ها در هر دو گروه جهت انجام انجماد در فار بخار (13) در محیط نگهداری اسپرم انسان HSPM)) (Fertipro, Belgium) آماده و منجمد گردید. پس از طی دو هفته نمونه‌ها مجدداً ذوب و از نظر وضعیت آکروزوم مورد بررسی قرار گرفتند.

برای انجام رنگ‌آمیزی سه گانه µl 100 از مایع سیمن مایع شده برداشت و سپس µl100 محلول تریپان بلو 1% (Merck,Germany ) به آن افزوده شد.

پس از مخلوط نمودن، نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در انکوباتور ˚C37 حاوی CO2 ((LEEC, UK قرار داده شد. بعد از طی این مدت لوله از انکوباتور خارج و ml5/0 محیط کشت (Seromed, Germany)Ham’s F10 به محلول داخل لوله اضافه شد و دو بار با دور2500 و هر بار به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ (Hettich EBA 3S, Germany) گردید. بعد از سانتریفوژ، مایع رویی دور ریخته شد و از رسوب ته لوله نمونه برداشته شد و روی دو لام اسمیر تهیه گردید. لامها بعداز خشک شدن در مجاورت هوا، با گلوتارآلدیید 3% به‌مدت 30 دقیقه ثابت شدند. سپس لامها به‌مدت 10 دقیقه در دمای ˚C40 با رنگ بیسمارک براون 2/0% (Merck, Germany) انکوبه و بعد از شستشوی کامل با آب دیونیزه مجدداً خشک شدند. در مرحله بعد لامها به مدت 25 دقیقه با محلول رز بنگال 1% (Sigma-Aldrich,Germany) رنگ‌آمیزی و سپس با آب دیونیزه کاملاً شستشو شدند تا مانع از رسوب رنگ اضافی روی لام گردد. بعد از خشک شدن در مجاورت هوا، در هر لام توسط میکروسکوپ نوری(Olympus BH2,Japan) با بزرگنمایی 1000 تعداد 100 اسپرم شمارش شد.

اسپرم‌های مشاهده شده بر اساس رنگ آکروزوم و سیتوپلاسم به چهار گروه دسته‌بندی شدند: زنده با آکروزوم دست نخورده، زنده بدون آکروزوم، مرده با آکروزوم دست‌نخورده، مرده بدون آکروزوم. در اسپرم‌های مرده، نیمه تحتانی سر اسپرم با تریپان بلو رنگ گرفت و به رنگ آبی تیره دیده شد ( شکل 1، الف و ج). درصورتیکه در اسپرم‌های زنده، ناحیه فوق با بیسمارک براون رنگ گرفت و به رنگ زرد دیده می‌‌شد ( شکل 1، ب و د). اگر آکروزوم دست نخورده باقیمانده بود ناحیه آکروزومی در اسپرم‌های مرده یا زنده به رنگ صورتی روشن (شکل 1، ج ود) و اگر آکروزوم پاره شده بود ناحیه قدامی اسپرم بی‌رنگ دیده ‌شد (شکل 1، الف و ب). نتایج حاصل از شمارش اسپرم‌ها قبل و بعد از انجماد در هر گروه با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 11.5 تحت محیط Windows با آزمون t-test Paired آنالیز گردید. سطح معنی‌داری 95% و درصد خطا 05/0 در نظر گرفته شد. برای انجماد سریعµl 500 مایع سیمن مایع شده در داخل کرایوتیوب با حجم µl 8/1 ریخته شد که در پشت آن مشخصات مریض نوشته شده بود. سپس µl 350 محیط نگهداری اسپرم انسان (HSPM) با ترکیب گلیسرول، 4/0% HSA و Hepes به آرامی اضافه و مخلوط شد. سپس کرایوتیوب به مدت 30 دقیقه در فاصله cm20 بخار ازت مایع قرار داده شد. در مرحله آخر کرایوتیوب به داخل تانک ازت مایع منتقل شد.

بعد از گذشت دو هفته نمونه‌ها ذوب گردیدند.

برای ذوب نمودن نمونه‌ها، کرایوتیوب‌ها از داخل تانک ازت مایع خارج و به داخل ظرف حاوی نیتروژن مایع منتقل ‌گردید و بعد از 30 ثانیه از ظرف ازت مایع خارج شد و به مدت 5 دقیقه در ظرف آب گرم با دمای ˚C37 قرار گرفت تا نمونه‌ها به صورت مایع درآیند. سپس تمامی مراحل رنگ‌آمیزی مشابه مرحلة قبل از انجماد برای تمامی نمونه‌های دو گروه انجام شد.

نتایج

در ایـن مطالعـه اثـرات انجماد در فاز بخار- ذوب بر حیات و وضعیت آکروزوم در اسپرم افراد بارور و نابارور الیگواسپرم مورد بررسی قرار گرفت که نتایج به‌دست آمده به شرح زیر می‌باشد.

نتایج حاصل از آنالیز سیمن در مردان الیگواسپرم و بارور و ارزیابی آکروزوم در جداول شمارة 1و2 خلاصه شده است. براساس این نتایج در شـرایط قبـل از انجمـاد در فاز بخار، میانگین درصد اسپرم‌های زنده با آکروزوم دست نخورده در افراد الیگواسپرم 64/3±26 و در افراد بارور 07/4 ±37/33 بود که پس از انجماد- ذوب در افراد الیگواسپرم به 82/1±6/11 و در افراد بارور به 97/2± 87/9 کاهش یافت. کاهش درصد اسپرم‌های زنده با آکروزوم دست نخورده در افراد الیگواسپرم و بارور قبل و بعد از انجماد در فاز بخار از نظر آماری معنی‌دار می‌باشد(05/0< P). ضمناً میانگین درصد اسپرم‌های زنده بدون آکروزوم درافراد الیگواسپرم قبل از انجماد در فاز بخار 56/3±94/24 و در افراد بارور 59/4 ± 12/42 بود که پس از انجماد و نگهداری به مدت دو هفته به 16/2±33/17 و در افراد الیگواسپرم و به 43/2±75/14 در افراد بارور کاهش یافت. کاهش درصد اسپرم‌های زنده بدون آکروزوم در افراد الیگواسپرم و بارور قبل و بعد از انجماد در فاز بخار از نظر آماری معنی‌دار می‌باشد(05/0< p).

از ‌طرفـی در شـرایط قبل از انجمـاد در فـاز بخار، میانگین درصد اسپرم‌های مرده با آکروزوم دست نخورده در افراد الیگواسپرم 24/4±83/26 و در افراد بارور 87/1±62/13 بود که پس از انجماد و ذوب مجدد آن، به 32/4±38/37 در افراد الیگواسپرم و به 34/2±5/28 در افراد بارور افزایش یافت. افزایش درصد اسپرم‌های مرده با آکروزوم دست‌نخورده در افراد الیگواسپرم و بارور قبل و بعد از انجماد از نظر آماری معنی‌دار بود(05/0< P). همچنین میانگین درصد اسپرم‌های مرده بدون آکروزوم در افراد الیگواسپرم قبل از انجماد در فاز بخار94/2±6/22 و در افراد بارور 34/2± 87/10 بود که پس از انجماد و ذوب مجدد آن، آنالیز مایع سیمن نشان داد که در افراد الیگواسپرم به 98/3 ± 16/34 و در افراد بارور به 49/3 ± 87/46 افزایش یافت. افزایش درصد اسپرم‌های مرده بدون آکروزوم در افراد الیگواسپرم و بارور قبل و بعد از انجماد از نظر آماری معنی‌دار بود(05/0< p). میانگین درصد اسپرم‌های زنده با آکروزوم دست نخورده قبل از انجماد در افراد الیگواسپرم 64/3 ± 26 و در افراد بارور 07/4±37/33 بود که از نظر آماری اختلاف میانگین بین دو گروه افراد الیگواسپرم و بارور معنی‌دار نبود. بعد از انجماد نمونه‌ها و نگهداری به مدت دو هفته و ذوب آنها، میانگین درصد اسپرم‌های زنده با آکروزوم دست نخورده در افراد الیگواسپرم به 82/1±16/11% و در افراد بارور به 97/2±87/9% تقلیل یافت. اختلاف میانگین بین دو گروه افراد الیگواسپرم و بارور از نظر آماری معنی‌دار نیست. ضمناً میانگین درصد اسپرم‌های زنده بدون آکروزوم قبل از انجماد در افراد الیگواسپرم 56/3±94/24 و در افراد بارور 59/4±12/42 بود که از نظر آماری اختلاف میانگین بین دو گروه معنی‌دار نبود. بعد از انجماد و ذوب مجدد آنها، میانگین درصد اسپرم‌های زنده بدون آکروزوم در افراد الیگواسپرم به 16/2±33/17 و در افراد بارور به 34/2±75/14 تقلیل یافت که اختلاف میانگین بین دو گروه از نظر آماری معنی‌دار نبود. میانگین درصد اسپرم‌های مرده با آکروزوم دست نخورده قبل از انجماد در افراد الیگواسپرم 24/4±83/26 و در افراد بارور 87/1±62/13 بود که از نظر آماری اختلاف میانگین بین دو گروه معنی‌دار می‌باشد (05/0< P). بعد از انجماد و ذوب مجدد آنها، میانگین درصد اسپرم‌های مرده با آکروزوم دست نخورده در افراد الیگواسپرم به 32/4 ± 38/37 و در افراد بارور به 34/2±5/28 افزایش یافت. اختلاف میانگین بین دو گروه از نظر آماری معنی‌دار بود (05/0< P). همچنین میانگین درصد اسپرم های مرده بدون آکروزوم قبل از انجماد در افراد الیگواسپرم 94/2 ± 16/22 و در افراد بارور 34/2± 87/10 بود که از نظر آماری اختلاف میانگین بین دو گروه معنی دار نبود. بعد از انجماد در فاز بخار به مدت دو هفته و ذوب آنها، میانگین درصد اسپرم های مرده بدون آکروزوم در افراد الیگواسپرم به 98/3 ±16/34 و در افراد بارور به 49/3±87/46 افزایش یافت. بین میانگین دو گروه از نظر آماری اختلاف معنی‌دار مشاهده نشد.

بحث

امروزه علیـرغـم استفاده از پـروتکل‌های مـدرن بـرای انجمـاد مایع منی انسان بعد از ذوب، پارامترهای کمی و کیفی اسپرم‌های زنده در مقایسه با نمونه قبل از انجماد رضایت بخش نیست و میزان باروری حاصل از اسپرم‌های نمونه منجمد شده در مقایسه با نمونه تازه کمتر است (16-14). بنابراین بررسی پروتکل‌های مختلف انجماد و اثرات و عوارض جانبی آنها برای پی‌بردن به علل کاهش باروری پس از انجماد از اهمیت فراوانی برخوردار می‌باشد. مطالعه حاضر در همین راستا و برای بررسی اثرات انجماد بر آکروزوم و به تبع آن واکنش آکروزومی انجام گرفت.

از آنجا که تعداد زیادی از افراد ناباروری که از روش‌های کمک باروری (ART) استفاده می‌کنند الیگواسپرم می‌باشند در بررسی حاضر وضعیت مایع منی در افراد بارور و الیگواسپرم و اثرات انجماد بر پارامترهای فوق در افراد بارور و الیگواسپرم مطالعه و با یکدیگر مقایسه گردید.

این یافته‌ها بیانگر اثرات تخریبی انجماد بر کیفیت و کمیت اسپرم‌ها می‌باشد و نشان می‌دهد که اسپرم‌های زنده با آکروزوم دست نخورده و بدون آکروزوم هردو به اثرات انجماد در فاز بخار، آسیب‌پذیر می‌باشند. از این نظر افراد بارور و الیگواسپرم مشابه هم می‌باشند و بنابراین می‌توان گفت اسپرم‌های افراد الیگواسپرم نسبت به انجماد حساس‌تر از افراد گروه بارور نمی‌باشد. از طرف دیگر، افزایش تعداد اسپرم‌های مرده با آکروزوم دست نخورده و بدون آکروزوم پس از انجماد و ذوب دقیقاً با کاهش تعداد اسپرم‌های زنده مطابقت می‌نماید و بیانگر این واقعیت است که انجماد در فاز بخارو ذوب نه تنها باعث مرگ اسپرم بلکه باعث آسیب آکروزوم نیز می‌گردد. اثرات انجماد در فاز بخارو ذوب بر اسپرم‌ها از این لحاظ نیز در افراد بارور و الیگواسپرم کاملاً مشابه می‌باشد. بر این اساس می‌توان گفت کیفیت اسپرم‌ها در افراد الیگواسپرم در مقایسه با افراد بارور متفاوت نمی‌باشد. این نتایج با یافته‌های Cross و همکاران (17) و Hammadeh و همکاران (13) مطابقت دارد. آنها نیز نشان دادند که روند انجماد- ذوب باعث کاهش معنی‌دار در اسپرم‌های با آکروزوم دست نخورده می‌گردد و درصد اسپرم‌های با آکروزوم آسیب دیده نیز بعد از انجماد افزایش‌می‌یابد. همچنین در تأیید یافته‌های مطالعه حاضر نشان داده شده است که انجماد اسپرم به ساختمان آکروزوم آسیب می‌رساند(18).

Hammerstedt و همکاران (19) وAlvarez & Storey (20) نشان دادند که روند انجماد و ذوب باعث کاهش متابولیسم اسپرم می‌گردد و به غشای پلاسمایی اسپرم صدمه می‌زند که منجر به کاهش اسپرم‌های عملکردی مورد نیاز برای ART می‌شود. Drobnis و همکاران (21) نشان دادند که انجماد باعث افزایش ناپایداری آکروزوم اسپرم در دستگاه تولید مثل ماده می‌گردد. محققان دیگر بیشتر روی تغییرات مورفولوژی اسپرم همانند دم پیچ خورده، غشاهای صدمه دیده و آکروزوم‌های آسیب دیده تاکید دارند(22). فرض آنها بر این است که اســپرم‌های صــدمه دیده طــی انجماد باعث افزایش تولید ROS می‌گردد که می‌تواند به اسپرم‌های نرمال موجود در همان نمونه آسیب بزند(22).

براساس نتایـج این مطالعه می‌توان نتیجه‌گیری نمود که وجـود مواد محافظ در محیط انجمادی به علت اختلاف فشار اسموتیک به غشای پلاسمایی اسپرم آسیب می‌رساند و از طرفی سرد نمودن شدید اسپرم در هنگام انجماد، آسیب زیادی به غشای پلاسمایی روی قسمت قدامی سر اسپرم و غشای آکروزومی زیرین ایجاد می‌نماید که منجر به پارگی آکروزوم و کاهش ماتریکس آکروزومی می‌گردد. آکروزوم برای قابلیت لقاح اسپرم ضروری است. چون‌که آنزیم‌های آکروزومی برای رسیدن اسپرم‌ها به غشای پلاسمایی اووسیت ضروری است و آسیب آکروزوم با کاهش قدرت لقاح همراه است، بنابراین باید درصد مواد تشکیل‌دهنده محیط انجماد اسپرم به نحوی اصلاح گردد که اسپرم حداقل آسیب را متحمل شود. این امر به خصـوص در افـراد الیگواسپرم که تعداد اسپرم‌های زنده و متحرک آنها محدود است اهمیت زیادی دارد.

در ارتبـاط با اثـرات انجماد و ذوب بر اسپرم عقیده کلی بر این است که روند انجماد – ذوب اسپرم انسان منجر به کاهش سرعت حرکت اسپرم، تغییر الگوی نفوذ در موکوس سرویکس، تغییر ساختمان آکروزوم و غشای پلاسمایی در کنار کاهـش فعـــالیت پروتئــاز آکــروزومی (آکـروزین) می‌گردد(16، 15).

فاکتور عمده در تغییر ساختمان غشاء پلاسما، اثرات اسموتیک روند انجماد- ذوب بوده که به تغییر قابلیت نفوذ غشاء و در نهایت به مرگ سلولی منتهی می‌گردد. علاوه بر کاهش فعالیت آنزیمی، سایر آسیب‌های کشنده مانند دهیدراتاسیون و رهیدراتاسیون سلولی فعالیت آبشار پراکسیداسیون لیپیدی، تولید ROS و آسیب اکسیداتیو ناشی از آن باعث کاهش کیفیت اسپرم طی روند انجماد می‌گردد(23، 16). آسیب سلولی در هنگام انجماد معمولاً از پارگی غشا به علت تشکیل کریستال‌های یخ داخل سلولی طی انجماد آهسته و یا به علت تغییر فاز مایع و افزایش پـراکسیداسیون لیپید ناشی می‌گردد (26-24،15). در طی انجماد سیالیت غشا کاهش و هنگام ذوب افزایش می‌یابد. این کاهش و افزایش با تغییر ترکیب فسفولیپیدهای غشایی همراه است(27). ناپایداری غشا یک گام ضروری در روند فیوژن دو غشاء طی روند انجام واکنش اکروزومی است(28).

در مطالعه حاضر اثرات انجماد در فاز بخاربر روی آکروزوم در اسپرم‌های افراد بارور و نابارور (الیگواسپرم) بررسی شده است. نتایح بدست آمده از بررسی حاضر نشان می‌دهد که انجماد بدون توجه به کیفیت اسپرم‌ها (در افراد بارور و نابارور) موجب افزایش پارگی آکروزوم و واکنش آکروزومی خودبه خودی (در غیاب اووسیت) می‌گردد. این امر می‌تواند در میزان انجام لقاح در IUI و IVF و در نتیجه میزان باروری موثر باشد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تبریز که بدون حمایت مالی آن معاونت انجام این بررسی امکان‌پذیر نمی‌گردید، همچنین از پژوهشکده ابن‌سینا به لحاظ همکاری در اجرای این پروژه تشکر و قدردانی می‌گردد.

  1. Baldi E., Luconi M., Bonaccorsi L., et al. Human sperm activation during capacitation and Acrosome Reaction. Bioscience.1996;1:189-205.
  2. Purohit B.S., Laloraya M., Kumar P.G. Role of ions and ion channels in capacition and acrosome reaction of spermatozoa. Asian J Androl.1999;3:95-107.
  3. Fenichel P., Donzeau M., Farahifar D. Dynam- ics of human sperm acrosome reaction, relation with in vitro fertilization. Fertil Steril.1991;55: 994-9.
  4. Michaut M., Tomes C.N., De Blas G., Yunes R., Mayorga L.S. Calciumtriggered acrosomal exocytosis in human spermatozoa requires the coordinated activation of Rab3A and N ethylmal- eimidesensitive factor. Natl Acad Sci.2000;97: 9996-10001.
  5. Rossato M., Virgilio F., Rizzuto R., Galeazzi C., Foresta C. Intracellular calcium store depletion and acrosome reaction inhuman spermatozoa: role of calcium and plasma membrane potential. Mol Hum Reprod.2001;7:119-28.
  6. Michaut M., De Blas G., Tomes C.N., Yunes R., Fukuda M., Mayorgal S: Synaptotagmin VI participates in the acrosome reaction of human spermatozoa. Dev Biol.2001;235:521-9.
  7. De Jonge C.J., Rawlins R.G., Zaneveld L.J. Induction of the human sperm acrosome reac- tion by human oocytes. Fertil Steril.1988;50: 949-951.
  8. Milligan S.R. Mammalian sperm interacttion with extracellular matrices of the egg. In Oxford Review of Reproduction Biology. Oxford Univer- sity Press, Oxford.1989;pp:339-88.
  9. Foresta C., Rossato M., Virgilio F. Extracellul-ar ATP is a trigger for the acrosome reaction in human spermatozoa. J Biol Chem.1992;267: 19443-7.
  10. Tomiyama T., Ohashi K., Tsutsui T., Saji F., Tanizawa O. Acrosome reaction induced in a limited population of human spermatozoa by progesterone (Ca2+-dependent) and ATP (CA2+-independent). Hum Reprod.1995;10:2052-5.
  11. World Health Organization (WHO) laboratory manual for the examination of human semen and semenservical mucus interaction, 4th Edition, Cambridge University Press, Cambridge.1999; pp:6-23.
  12. Talbot P., Chacon R.S. A triple stain techni- que for evaluating normal acrosome reactions of human sperm. J Exp Zoll.1981;215:20-8.
  13. Hammadeh M., George T., Baum R. Schmidt W. Association between freezing agent and acro-some damage of human spermatozoa from sub-normal and normal semen. Andrology.2001;33: 331-6.
  14. Vayena E., Rowe P., Griffin P. Current practices and controversies in Assisted Rep- roduction. WHO, Geneva.2002;152-65.
  15. Donnelly E.T., Steele E.K., McClure N., Lewis S.E. Assessment of DNA integrity and morphology of ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men before and after cryo-preservation. Hum Reprod.2001;16:1191-9.
  16. Esteves S.C., Spaine D.M., Cedenho A.P., Srougi M. Effects of the technique of cryopre-servation and dilution/centrifugation after that-hawing on the motility and vitality of spermato-zoa of oligoasthenozoospermic men. Int Braz J Urol.2003;29:133-40.
  17. Cross N.L., Hanks S.E. Effects of cryopr-eservation on human sperm acrosomes. Hum Reprod.1991;6:1279-83.
  18. Check M.L., Check J.H., Long R. Detrimental effects of cryopreservation on structural and func-tional integrity of the sperm membrane. Arch Androl.1991;27:155-60.
  19. Hammerstedt R.H., Graham J.K., Nolan J.P. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl.1990;11(1):73-88.
  20. Alvarez J.G., Storey B.T. Evidence of increa-sed lipid peroxidase damage and loss of super- oxide dismutase activity as a mode of sublethal cryodamage to human sperm during cryopreser-vation. J Androl.1992;13(3):232-41.
  21. Drobnis E.Z., Clisham P.R., Brazil C.K., Wisner L.W., Zhong C.Q., Overstreet J.W. Detection of altered acrosomal physiology of cryopreserved human spermatozoa after sperm residence in the female reproductive tract. J Reprod Fertil.1993;99(1):159-65.
  22. Hammadeh M., Askari A., Georg T., Rosen-baum P., Schmidt W. Effect of freezethawing procedure on chromatin stability, morphological alteration and membrane integrity of human sper-matozoa in fertile and subfertile men. J Androl. 1999;22(3):155-62.
  23. Kotwicka M., Jendraszak M., Warchol J. Changes in actin localization after acrosome reaction in human spermatozoa. Cell Mol Biol. 2002;7:290.
  24. Stanic P., Tandare M., Sonicki Z., Simunic V., Radakovic B., Suchanek E., Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of human semen. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.2000;91(1):65-70.
  25. Hammadeh M., Greiner S., Rosenbaum P., Schmidt W. Comparison between human sperm preservation medium and TESEYolk buffer on protecting chromatin and morphology integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men after freezethawing procedure. J Androl. 2001; 22(6):1012-8.
  26. Donnelly E.T., McClure N., Lewis S.E. Cryo-preservation of human semen and prepared sperm: effects on motility parameters and DNA integrity. Fertil Steril.2001;76(5):892-900.
  27. Buhr M.M., Curtis E.F., Somnpan Kakuda N. Composition and behavior of head membrane lipids of fresh and cryopreserved boar sperm. Cryobiol.1994;31(3):224-38.
  28. Nolan J.P., Hammerstedt R.H. Regulation of membrane stability and the acrosome reaction in mammalian sperm. FASEB J.1997;11(8):670-83.
  29. Okada A., Igarashi H., Kuroda M., Terao K., Yoshikawa Y., Sankai T. Cryopreservation indu-ced acrosomal vesiculation in live spermatozoa from cynomolgus monkeys(Macaca Fascicularis), Hum Reprod.2001;16(10):2139-47.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 5, Issue 3
Summer 2004
Pages 208-216