اسپرم پستانداران سلول تمایز یافته‌ای است که می‌توان سطح آن را از نظر شکل و نوع عملکرد، به مناطق مختلفی تقسیم‌بندی کرد. اسپرم انسان به سه قسمت مجزای سر، گردن و دم تقسیم می‌شود. سر اسپرم به طور عمده حاوی مواد ژنتیکی اسپرم و کیسة آکروزومی می‌باشد. در گردن اسپرم تعداد زیادی میتوکندری وجود دارد که تأمین کنندة انرژی تحرک دم اسپرم است. دم اسپرم نیز با ساختار تاژکی خود عامل اصلی تحرک اسپرم می‌باشد(1).
سطح سلول‌های تمایز یافته مانند اسپرم، توانایی انجام عملکردهای منحصر به فردی را دارد که ایفای هر یک از این اعمال، وابسته به حضور و نحوة قرارگیری مولکول‌های ویژة سطحی این سلولها می‌باشد. نوع ترکیب مولکولی در سطح بسیاری از سلولها از جمله اسپرم مورد مطالعه قرار گرفته و واژة آنتی‌ژن تمایزی برای مولکول‌های ایمونوژن مختص به بافت‌های مختلف، ابداع گردیده است(2). با توجه به دخالت آنتی‌ژن‌های سطحی سلول در عملکردهای اختصاصی یک بافت، شناسایی این نوع آنتیژنها در مطالعه فعالیت انواع سلولها، بسیار حایز اهمیت است. تفاوت در محل قرارگیری یک آنتی‌ژن خاص نیز می‌تواند شاخص مهم دیگری در فعالیت‌های خاص سطح سلولها باشد. جذابیت زیادی که در این نوع تحقیقات وجود دارد، مطالعات انتوژنی یعنی مطالعه تکاملی دو یا چند گونه متفاوت در مقایسه با یکدیگر و مطالعات فیلوژنی یعنی مطالعه تکاملی یک گونه خاص به خودی خود می‌باشد که براساس نتایج تحقیقات می‌توان پروتئین خاصی را به عنوان یک پروتئین مختص به یک گونه و یا مشترک بین چند گونه، شناسایی کرد و نیز می‌توان عملکرد منحصر به فرد یا مشترک آن در گونه‌های مختلف را مطالعه و به نتایج جالب توجهی رسید(3). با این تفاسیر، به دلیل آنکه آنتی‌ژن‌های سطحی اسپرم اهمیت بسیار زیادی در لقاح اسپرم- تخمک و نیز سایر عملکردهای اسپرم دارند، مطالعه آنها راه‌گشای بسیاری از ناشناخته‌ها در فرآیند لقاح خواهد بود. همچنین می‌توان علت بسیاری از ناباروری‌های ناشی از نقص‌های مولکولی را ردیابی و درمان نمود. به همین دلیل در حال حاضر، تحقیقات زیادی روی واکسن‌های جلوگیری از بارداری ، در حال انجام است. برای مثال چند آنتی‌ژن اسپرمی از جمله،FA-1 وSP-10 کاندید استفاده در اینگونه واکسن‌ها هستند که می‌توان افراد را به صورت فعال یا غیرفعال با آنها ایمونیزه کرد و با توجه به عملکرد آنتیژنها مزبور، در یکی از مراحل عملکردی اسپرم مانع از انجام علمکرد آن شد (4).
با توجه به نکات فوق، ضرورت مطالعه روی آنتی‌ژن‌های اسپرم بسیار واضح است. این مطالعات از سال 1965 میلادی شروع و هم‌اکنون طیف وسیعی از محققین روی این موضوع متمرکز هستند. یکی از ابزارهای بسیار کارآمد برای شناسایی بسیاری از آنتیژنها، آنتیبادی منوکلونال است که با توجه به کاربردهای بسیار زیاد آن در مطالعات ایمونوشیمی، هیستوشیمی، سیتوشیمی و ...، بسیار مورد توجه می‌باشد(3).
تا کنون آنتی‌ژن‌های زیادی در سطح اسپرم مورد شناسائی قرار گرفته‌اند. به عنوان مثال پروتئین P34H با وزن مولکولی kDa 34 که در اتصال و نفوذ اسپرم به تخمک نقش دارد(6و5). پروتئین HE4 با وزن مولکولیkDa10 که دارای خاصیت آنتی‌پروتئازی است (8و7). پروتئین‌هایHSP-70 و HSP-70.2 که در باروری و عملکردهای اسپرم مؤثراند(9) و بسیاری پروتئین‌های دیگر که شناخته شده و یا مطالعه بر روی آنها ادامه دارد. در مطالعه حاضر نیز از آنتیبادی منوکلونال برای شناسایی یکی از آنتی‌ژن‌های سطحی اسپرم انسان استفاده شده است.
الف) حیوانات مورد استفاده: رت‌های نر بالغ (نژاد ویستار) با سن 10-8 هفته و موش‌های نر(نژادBalb/c ) با سن 8-6 هفته بودند که از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند. موشها و رت‌ها در شرایط مناسب از نظر بهداشت، دما، رطوبت و روشنایی (سیکل 12 ساعته تاریکی-روشنایی) بدون محدودیت غذائی نگهداری شدند. تمام روش‌های تجربی مورد استفاده در این مطالعه توسط کمیته اخلاق پزشکی پژوهشکدة ابن‌سینا مورد بررسی و تصویب قرار گرفت.
ب) مواد و دستگاه‌ها: لیتیوم دی‌یدوسالیسیلات (LIS)، Tris، Pristane، HSA ، رنگ بیسمارک براون، یونوفور کلسیمA23187، دی‌متیل سولفوکساید (DMSO)، گلوتارآلدئید وGoat Anti-Mouse Isotype (Sigma,USA)، اسید کلریدریک، استن، رنگ رزبنگال، اتانول(Merck, Germany)، کاغذPVDF (Roche, Germany)، فنیل متان سولفونیل فلوراید (Fluka, USA)(PMSF)، کیسه دیالیز(Biogene, Iran)، ستون افینیتی کروماتوگرافی پروتئینG (Pharmacia, Sweden)، محیط کشتBWW ، (Gibco, USA)، رنگ تریپان‌بلو(CARLO ERBA Italy)، آنتیبادی منوکلونال ضد اسپرم انسانHS56، کنژوگه‌های آنزیمی و فلورسانس HRP-Sheep Anti-Mouse Ig، FITC-Sheep Anti-Mouse Ig (مرکز تحقیقات‌آنتی‌بادی منوکلونال)، دستگاه Shandon Cytospin 4 (Shandon, Uk)، تانک الکتروفورز، تانک بلاتینگ (اختریان، ایران).
ج) تولید و تخلیص آنتیبادی منوکلونال: به منظور تولید آنتیبادی منوکلونال در مقادیر زیاد، از روش القاء آسیت استفاده شد. بدین صورت که به 5 موش نرBalb/c با سن 8-6 هفته، l500 Pristane به صورت درون صفاقی تزریق شد. ده روز پس از تزریق Pristane، به تعداد 106×5 سلول هیبریدومای مولد آنتیبادی منوکلونالHS56، به صورت درون صفاقی به هر یک از موش‌های فوق تزریق گردید. پس از آن موشها به صورت روزانه و چندین بار در هر روز، بررسی شدند و هنگامی که شکم موش متورم و در نتیجه قدرت و میزان حرکت حیوان بسیار محدود شد، آسیت از حفرة صفاقی موشها خارج گردید. سپس ml 2/3 آسیت حاصل، به نسبت 1:3 با PBS، رقیق و با توجه به نوع ایزوتیپ آنتیبادی منوکلونال، برای تخلیص آنتیبادی از ستون افینیتی کروماتوگرافی پروتئینG، عبور داده شد. برای شستشوی ستون، از بافر PBS، M15/0، 2/7=pH و به عنوان بافر جدا کننده از بافر Gly-HCl، M2/0، 5/2= pH، استفاده شد. محلول‌های خروجی از ستون به حجم‌های ml 3-2 جمع‌آوری و تعیین غلظت شدند و بخش‌های حاوی آنتیبادی با هم مخلوط و در برابرPBS، دیالیز گردیدند. به منظور تعیین ایزوتیپ آنتیبادی منوکلونال، تست الایزا به صورت زیر طراحی شد. لایه اول: آنتی‌ایزوتیپ‌هایGoat Anti-Mouse Isotype، لایه دوم: سوپرناتانت حاصل از کشت سلول‌های هیبریدومای مولد آنتیبادی منوکلونال HS56 و لایه سوم: کنژوگه HRP-Sheep Anti-Mouse ریخته شد. هدف از تعیین ایزوتیپ آنتیبادی منوکلونال، طراحی روش مناسبی به منظور تخلیص آنتیبادی منوکلونال از مایع آسیتی بود که پس از این مرحله انجام گرفت.
د) استخراج آنتی‌ژن‌های سطح اسپرم: نمک LIS ترکیبی کائوتروپ است که باعث تضعیف پیوندهای هیدروفوبی می‌شود و می‌تواند پروتئین و گلیکوپروتئین‌های غشایی اسپرم را جدا کند. برای انجام کار، ابتدا اسپرم‌های اضافی از آنالیز اسپرم افراد طبیعی (با توجه به معیارهایWHO) (10) مراجعه کننده به مرکز تخصصی ابن‌سینا (درمان ناباروری و سقط مکرر)، جمع آوری و سه مرتبه به وسیلة بافر PBS شستشوداده شد (هر مرتبه به مدت 10 دقیقه و با نیروی g600 سانتریفوژ انجام شد). به منظور استخراج آنتیژنها از سطح اسپرم، ml2 از رسوب اسپرمی فوق با ml5 از محلول M 3/0 نمک LIS، در بافر Tris-HCl، mM10، 4/7=pH، حاوی mM PMSF 2، به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس مخلوط فوق به مدت 30 دقیقه در دمای C 4 با قدرت g15000 سانتریفوژ شد. مایع رویی جدا و در برابر بافر Tris-HCl دیالیز گردید(11). پس از استخراج، برای مشاهدة نتیجه استخراج و تنوع آنتی‌ژن‌های استخراجیSDS-PAGE روی ژل پلی‌آکریلامید 10% انجام شد(12).
هـ) تعیین محل قرارگیری آنتی‌ژن مورد نظر روی اسپرم انسان : ابتدا اسپرم‌های حاصل از افراد طبیعی، در محیطBWW، Swim up شدند. سپس اسپرم‌های زنده و کاملاً متحرک حاصل از این تکنیک با PBSتا غلظت sperm/ml 106 1 رقیق شدند. از l100 مخلوط اسپرمی توسط دستگاه Cytospin، روی لام، اسمیر مناسب تهیه شد. لامها در استون (Ice cold) فیکس شدند. سپس لامها 3 بار با بافرTBS، M 1/0، 4/7=pH شستشو و لایه دوم آنتیبادی منوکلونال با غلظت µg/ml10 و لایه سوم کونژوگه FITC-Sheep Anti- Mouse Ig اضافه گردید. پس از اتمام کار، لامها با بزرگنمایی 1000 برابر و بوسیلة میکروسکوپ فلورسانس دارای فیلتر مخصوص FITC مشاهده گردیدند(13).
و) بررسی واکنش آنتیبادی منو کلونال HS56 با آنتی‌ژن‌های استخراج شده به کمک LIS : به منظور بررسی جداسازی آنتی‌ژن مربوط به آنتیبادی منوکلونال HS56 به کمک نمک LIS از اسپرم، تست الایزایی طراحی شد. لایه اول: آنتی‌ژن‌های استخراجی به روش LIS با غلظت µg/ml10، لایة دوم: آنتیبادی منوکلونال HS56 با غلظت µg/ml 10 و لایه سوم: کونژوگه HRP-Sheep Anti-Mouse Ig.
ز) بررسی وزن مولکولی و خصوصیات بیوشیمیایی آنتی‌ژن مورد شناسائی توسط آنتیبادی منوکلونال HS56 : برای تعیین وزن مولکولی آنتی‌ژن، از تکنیک وسترن بلات(14) استفاده شد. بدین منظور SDS-PAGE بر روی آنتی‌ژن‌های استخراجی توسط نمک LIS به دو روش احیاء و غیر احیاء انجام شد. برای شناسایی آنتی‌ژن، از آنتیبادی منوکلونال HS56 با غلظت µg/ml 10و کونژوگةHRP-Sheep Anti- Mouse Ig استفاده شد. در نهایت با توجه به مارکرهای وزن مولکولی، منحنی Rf رسم و حدود وزن مولکولی آنتی‌ژن مورد شناسایی توسط آنتیبادی منوکلونال HS56 ، تعیین گردید.
ح) بررسی وجود اپی‌توپ مورد شناسایی توسط آنتیبادی منوکلونال HS56 در اسپرم رت و موش: به این منظور ابتدا اسپرم رت و موش بالغ (10-8 هفته‌ای) از ناحیة اپی‌دیدیم استخراج و تست الایزای طراحی شد. به تعداد sperm/well 1061 به عنوان لایه اول، آنتیبادی منوکلونال HS56 با غلظتµg/ml10 به عنوان لایه دوم و کونژوگة HRP-Sheep Anti-Mouse Ig به عنوان لایة سوم ریخته شد.
ط) بررسی نقش اپی‌توپ اختصاصی آنتیبادی منوکلونال HS56 در واکنش آکروزومی: به منظور بررسی نقش اپی‌توپ مورد مطالعه در واکنش آکروزومی، ابتدا اسپرم‌های متحرک و سالم حاصل از افراد طبیعی به روش Swim up جدا شد. سپس اسپرم‌های زنده و متحرک در سه لوله تقسیم شدند. اسپرم‌های هر سه لوله مراحل ظرفیت‌پذیری را در محیط BWW و به مدت 3 ساعت پشت‌سر گذاشتند. در مرحله بعد به لوله تست، آنتیبادی منوکلونال HS56 به غلظت µg/ml20 و به لولة دیگر ایمونوگلوبولین موش غیرایمن با غلظت µg/ml20 اضافه گردید و به لولة کنترل مثبت نیز هیچ ماده‌ای اضافه نشد. این مرحله به مدت یک ساعت در انکوباتور C37 سپری گردید. پس از آن، مرحلة القاء واکنش آکروزومی با استفاده از کلسیم یونوفورA23187 با غلظتmM10 درDMSO، در هر سه لوله به مدت یک ساعت انجام گرفت. به منظور تعیین درصد اسپرم‌هایی که واکنش آکروزومی انجام داده‌اند، رنگ‌آمیزی سه گانه روی اسپرم‌ها انجام گرفت. به این صورت که ابتدا اسپرم‌های هر لوله با بافرPBS، سه مرتبه شسته شدند. سپس سوسپانسیون اسپرمی هر لوله، به نسبت مساوی (1:1) با رنگ تریپان بلو 2%، در دمای C37، به مدت 15 دقیقه انکوبه گردید. پس از آن سه بار شستشو با بافر PBS انجام گرفت. به منظور فیکس کردن، اسپرم‌ها به مدت 30 دقیقه در گلوتار آلدئید 5/2% (در بافر فسفات M 1/0، 4/7=pH) در دمای C4 انکوبه شدند. پس از سه بار شستشوی اسپرم‌ها با بافر PBS به رسوب هر لوله l500 آب مقطر دیونیزه اضافه شد و رسوب اسپرمی مجدداً به حالت سوسپانسیون درآمد. پس از آن یک قطره از هر سوسپانسیون اسپرمی برداشته و روی لام قرار گرفت تا در مدت 12 ساعت در دمای اتاق خشک شوند. سپس روی هر لام رنگ بیسمارک براون 8/0% (در آب مقطر) به مدت 15 دقیقه در دمای C37 ریخته و نگهداری شد. سپس لام‌های رنگ شده، با آب مقطر دیونیزه شستشو شدند. در مرحله بعد لامها با رنگ رزبنگال 8/0% (تهیه شده در بافر Tris-HCl، M1/0، 4/7=pH) در دمای اتاق به مدت 40 دقیقه رنگ‌آمیزی شد. سپس لامها با آب مقطر دیونیزه شستشو و با 10 مرتبه فرو بردن هر لام در اتانول 90%، عمل دهیدراتاسیون انجام گرفت. پس از آماده شدن لامها، با بزرگنمایی 1000 برابر، حداقل 1200 اسپرم در هر لام به صورت تصادفی مشاهده و شمارش شد. اسپرم‌هایی با رنگ صورتی در جلوی سر اسپرم به عنوان واکنش آکروزومی منفی و اسپرم‌های فاقد این بخش به عنوان اسپرم‌هایی با واکنش آکروزومی مثبت شناسایی شدند. اسپرم‌های مرده نیز به دلیل جذب رنگ تریپان بلو، به رنگ آبی پررنگ درآمدند (14). پس از شمارش نمونه‌ها، به منظور آنالیز و مقایسه داده‌ها، از نرم‌افزار SPSS(ver.10.0) و تست آماری ناپارامتری Wilcoxon Signed Ranks Test استفاده و سطح معنی‌داری، 05/0 در نظر گرفته شد.
1) تولید و تخلیص آنتیبادی منوکلونال: به منظور تولید انبوه آنتیبادی منوکلونال به طریقه تولید آسیت، از تزریق سلول‌های هیبریدوما به 5 سر موشBalb/c، 3موش تولید آسیت کرده و 2 موش تومور جامد تولید کردند. آنتیبادی موجود در آسیت، از طریق کروماتوگرافی جذبی (ستون پروتئین G) تخلیص گردید. از ml2/3 آسیت، mg53/7 آنتیبادی منوکلونال به‌دست آمد. یعنی در هر میلی‌لیتر آسیت، mg 35/2 آنتیبادی تولید شده بود. تعیین زیرکلاس آنتیبادی منوکلونال با استفاده از آزمون الایزا نشان داد که زیرکلاس آنتیبادی مذکور از زیرکلاس IgG1 می‌باشد.
2) تعیین محل قرارگیری آنتی‌ژن در سطح اسپرم انسان: براساس نتایج رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس اسپرم انسان با آنتیبادی منوکلونال HS56 و کنژوگه FITC همانطور که در شکل 3 آمده است کاملاً مشخص است که ناحیة آکروزومی و گردن اسپرم توسط آنتیبادی منوکلونال شناسایی و در نتیجه رنگ فلورسانس از خود نشان می‌دهند. بنابراین آنتی‌ژن مورد نظر در این دو ناحیه واقع شده است.
3) استخـراج آنتـی‌ژن‌های سطـح اسپـرم انسـان با کمـک نمک LIS : در روش الایزای انجام شده با آنتی‌ژن‌های حاصل از نمک LIS، میزان جذب نوری (OD) ایجاد شده حدود 3/1 بود و در مقایسه با چاهک‌های کنترل منفی (با جذب نوری 18/0) مشخص شد که آنتی‌ژن مورد شناسایی توسط آنتیبادی منوکلونالHS56، توسط LIS از سطح اسپرم جدا می‌شود. پس از آن با استفاده از تکنیک SDS-PAGE، الگوی حرکت الکتروفورزی پروتئین‌های استخراج شده مشخص گردید که در شکل 1 نشان داده شده است.
4) تعیین وزن مولکولی و شناسایی برخی از خصوصیات آنتی‌ژن مورد شناسائی توسط آنتیبادی مونوکلونال: آنتی‌ژن‌های استخراج شده به کمک LIS، به دو صورت احیاء و غیر احیاء، الکتروفورز شدند. همانطور که در شکل 2 دیده می‌شود، مارکرهای وزن مولکولی kDa 94 و kDa67، kDa43، kDa30، kDa1/20، kDa4/14 به عنوان استاندارد‌های وزن مولکولی بکار رفته‌اند که پس از رسم منحنی Rf برای این مارکرهای وزن مولکولی و مقایسه میزان حرکت باند مربوط به آنتی‌ژن در حالت غیر احیاء، حدود وزن مولکولی kDa2±56، محاسبه گردید.
5) بررسی وجود اپی‌توپ مشابه در اسپرم رت و موش: با توجه به انجام روش الایزا روی اسپرم موش و رت و مقایسه نتایج با روش الایزا روی اسپرم انسان، مشخص گردید که چنین اپی‌توپی در اسپرم رت و موش وجود ندارد و میزان رنگ حاصل از آنتیبادی نزدیک به چاهک‌های بلانک و کنترل منفی بود.
6) بررسی نقش اپی‌توپ اختصاصی آنتیبادی منوکلونال HS56 در واکنش آکروزومی: با مقایسه نتایج ناشی از 3 نوع تست C.I (کنترل مثبت شامل مراحل ظرفیت‌پذیری اسپرم وافزودن یونوفور) CMI (مراحل ظرفیت‌پذیری اسپـرم، افـزودن آنتـی‌بـادی منـوکلـونـال و یونوفور) و CPI (شامل مراحل ظرفیت‌پذیری و افزودن ایمنوگلوبولین غیر اختصاصی موشی و یونوفور)، مشخص شد که اثر آنتیبادی منوکلونال HS56 بر اسپرم انسان، تفاوت معنی‌داری را در انجام واکنش آکروزومی در مقایسه با نمونه کنترل مثبت ایجاد نکرده است. حضور ایمونوگلوبولین‌های موشی نیز تفاوت معنی‌داری را در انجام واکنش آکروزومی در مقایسه با نمونه کنترل مثبت ایجاد نکرده است.
با توجه به پوشیده شدن سطح اسپرم انسان از آنتی‌ژن‌های متنوع و اینکه هر یک از آنها عملکرد و نقش خاصی در اعمال اختصاصی اسپرم به عهده دارند، شناسایی این آنتیژنها به منظور درک هرچه بهتر فرآیند لقاح و نیز کمک به بیماران نابارور دارای نقایص مولکولی در ساختار اسپرم و سرانجام مطالعات انتوژنی و فیلوژنی، مفید خواهد بود. از جمله ابزارهای بسیار کارآمد در چنین مطالعاتی، آنتی‌بادی‌های منوکلونال هستند که به کمک آنها می‌توان هر یک از مولکول‌های سطح سلول را به طور کاملاً مجزا بررسی کرد(3).
با توجه به کارآیی بسیار بالای آنتیبادی منوکلونال در مطالعات سلولی و مولکولی، از جمله توانایی استفاده از آن در آزمایشات متنوعی از جمله ایمونوسیتوشیمی، ایمونوهیستوشیمی تخلیص آنتیژنها، کروماتوگرافی، ایمونوبلاتینگ و سایر تکنیک‌های ایمونوشیمی، در مطالعه حاضر نیز از آنتیبادی منوکلونال استفاده گردید.
در این مطالعه ابتدا روش‌های مختلف برای استخراج آنتی‌ژن‌های سطح اسپرم بکار گرفته شد SDS،Triton-X100 و LIS از جمله موادی بودند که به این منظور به کار رفتند. SDS چون یک مادة دناتوره کننده است و نیز با دیالیز کردن به طور کامل از محلول خارج نمی‌شود، برای ادامة کار استفاده نشد. به علاوه SDS و Triton-X100 هر دو در طول موج مربوط به سنجش غلظت با تکنیک برادفورد، جذب دارند و باعث ایجاد اشتباه در تعیین غلظت پروتئین می‌شوند. Triton-X100 نیز که یک دترژنت با وزن مولکولی g/mol38/250 است در محلول به صورت پلیمر درآمده و وزن مولکولی بالایی پیدا می‌کند که در نتیجه نمی‌توان با دیالیز آن را از محلول خارج کرد و باید روش‌های دیگری برای خارج کردن آن بکار برد. بدین دلیل از این میان LIS برای ادامه مطالعه حاضر انتخاب شد.
با القاء آسیت، آنتیبادی به مقدار زیاد حاصل و برای آزمایشات بعدی از جمله ایمونوبلاتینگ و تعیین وزن مولکولی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنتی‌ژن، مورد استفاده قرار گرفت. وزن مولکولی آنتی‌ژن حدود kDa2±56 به‌دست آمد. با انجام الکتروفورز به دو صورت احیاء و غیراحیاء و با توجه به نتیجه وسترن بلاتینگ، چنین به نظر می‌رسد که:
1) اپی‌توپ مورد شناسایی توسط آنتیبادی منوکلونال HS56، یک اپی‌توپ خطی است؛ زیرا با وجود مجاورت با SDS موجود درSDS-PAGE، باز هم توسط آنتیبادی منوکلونال شناسایی می‌شود. 2) اپی‌توپ مورد نظر دارای پیوند دی‌سولفید در ساختار خود نیست؛ زیرا در حالت احیاء نیز توسط آنتیبادی منوکلونال شناسایی شده است. 3) آنتی‌ژن مورد نظر دارای پیوند دی‌سولفید در ساختار خود می‌باشد؛ زیرا که آنتی‌ژن پس از احیاء شدن توسط 2ME، بازتر شده و حرکت الکتروفورتیکی کندتری پیدا کرده و در حالت احیاء بالاتر از حالت غیر احیاء ایستاده است. 4) با توجه به تک باندی بودن بلات در حالت احیاء و غیر احیاء چنین بر می‌آید که احتمالاً این آنتی‌ژن یک مونومر باشد و یا آنکه یک اولیگومر اما با زیر واحدهای دارای وزن مولکولی یکسان باشد که در نتیجه در هر دو حالت احیاء و غیر احیاء، یک باند بدست آمده است.
در تحقیقی که توسط Rajeev و همکارانش انجام شد، آنتی‌ژنی با وزن kDa 57 در سطح اسپرم انسان شناسایی شد که در ناحیة سر اسپرم بدون واکنش آکروزومی، قرار دارد و بلوکه‌‌کردن آن با آنتیبادی منوکلونال مانع لقاح اسپرم انسان و تخمک بدون زونای هامستر شده است(15). با ادامه تحقیقات روی آنتی‌ژن شناسایی شده توسط این گروه و نیز ادامه تحقیقات روی آنتی‌ژن با وزن مولکولی حدود kDa56 شناسایی شده توسط تحقیقات به عمل آمده در پژوهشکده ابن‌سینا، تشابه یا عدم تشابه این دو آنتی‌ژن را می‌توان بدست آورد.
با انجام تست ایمنوفلورسانس غیرمستقیم با استفاده از کنژوگة FITC، مشخص شد که محل قرارگیری آنتی‌ژن مورد مطالعه، ناحیة آکروزومی و گردن اسپرم انسان می‌باشد. همانطور که در بالا نیز ذکر شد، آنتی‌ژن 57 کیلودالتونی شناسائی شده توسط Rajeev و همکارانش، نیز در ناحیة آکروزومی اسپرم، قرار داشته است(15). در مطالعة Yoshiki و همکارانش نیز، با استفاده از آنتیبادی منوکلونال HSA-5، وجود آنتی‌ژنی در ناحیة آکروزومی و استوای اسپرم، گزارش شده است(16). وجود اپی‌توپ شبیه یا یکسان با اپی‌توپ موجود در سطح اسپرم انسان که توسط آنتیبادی منوکلونال HS56 شناسایی شود، در اسپرم رت و موش مورد بررسی قرار گرفت و نهایتاً پس از انجام تست الایزا، مشخص گردید که چنین اپی‌توپی در سطح اسپرم رت و موش وجود ندارد و ظاهراً این اپی‌توپ در میان اسپرم‌های انسان، موش و رت، منحصر به اسپرم انسان می‌باشد. در مطالعة انجام شده توسط Isahakiaو همکارش، واکنش متقاطع چندین آنتیبادی منوکلونال تولید شده علیه اسپرم انسان، با اسپرم گونه‌های دیگر مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که یکی از آنتی‌بادی‌های منوکلونال با نام MAL، ناحیة آکروزومی اسپرم انسان، میمون، گاو، سگ، خرگوش، رت و موش را می‌شناسد اما آنتیبادی منوکلونال دیگری به نامMAb، فقط ناحیة دم اسپرم انسان را می‌شناسد یا آنتیبادی منوکلونال MA5 نیز فقط ناحیة استوایی اسپرم انسان را شناسایی کرده است(17).
به منظور بررسی تأثیر و دخالت اپی‌توپ مورد نظر در انجام واکنش آکروزومی اسپرم، تست مورد نظر طراحی شد. با توجه به نتایج این تست چنین برمی‌آید که با اینکه این آنتی‌ژن در ناحیة آکروزومی واقع است اما بلوکه کردن اپی‌توپ مورد مطالعه با آنتیبادی منوکلونال HS56 تأثیر معنی‌داری در واکنش آکروزومی ندارد (11/0=P). البته این نظر را نمی‌توان در مـورد کل آنتـی‌ژن مصـداق داد. زیرا ممکن است که عملکرد کلی آنتی‌ژن در واکنش آکروزومی دخیل باشد اما اپی‌توپ مذکور دراین فرآیند دخالتی نداشته باشد. البته این موضوع را می‌توان با تولید نتی‌بادی‌پلی‌کلونال علیه این آنتی‌ژن و بلوکه کردن کل آنتی‌ژن با آنتیبادی پلی‌کلونال، مورد بررسی قرارداد. به علاوه می‌توان تحقیق را بر روی دخالت این اپی‌توپ یا کل آنتی‌ژن در دیگر عملکردهای اسپرم از جمله اتصال به زوناپلوسیدا یا لقاح با تخمک و نیز نقش آنها در مراحل ظرفیت‌پذیری یا حرکت اسپرم، ادامه داد و در صورت امکان آن را بـه عنـوان یک کاندیدا برای تولید واکسن‌های جلوگیری بارداری در نظر گرفت.
از زحمات آقایان اصغر طالبیان، دکتر سادات هاشمی و خانم‌ها جمیله قاسمی و دکترپونه دوکوهکی قدردانی می‌گردد. در ضمن از سرکار خانم پروانه احمدی که زحمت تایپ این مقاله را متحمل شدند، تشکر می‌شود.
