Mercury and Nicotine-induced Oxidative Stress Changes in Bull Spermatozoa: Modulation by Manganese and Albumin

Arabi, Mehran; Mohammadpoor, Ahmad Ali

Mercury and Nicotine-induced Oxidative Stress Changes in Bull Spermatozoa: Modulation by Manganese and Albumin

Authors

Mehran Arabi ¹

Ahmad Ali Mohammadpoor ²

¹ Biology Department, Faculty of Sciences, Shahr Kord University, Shahr-e-Kord, Iran

² Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord University, Shahr-e-Kord, Iran

Abstract

Introduction: Oxidative stress (OS) is an important factor in the etiology of male infertility which presents abnormal increase in the production of free radicals with negative influences on reproduction. The aim of present study is evaluation effect of mercury (Hg) (600& 1200 micro molar) and nicotine (0.75 mM), in vitro, on membrane integrity (LPO), GSH content, motility, and acrosome reaction of bull spermatozoa with/ without manganese (Mn) and albumin (BSA). Materials and Methods: Lipid peroxidation (LPO) was assessed by measurement of MDA levels. Reduced glutathione (GSH) content evaluated by levels of reduced DTNB and acrosome reaction evaluated by gelatin digestion test. Sperm motility was assessed by under phase contrast micro-scopy at room temperature until 120 min. Statistical analysis performed using SPSS software by t- test, at p < 0.05 significance level. Results: Our results showed that addition of Hg and nicotine to the sperm samples resulted in elevation of LPO rate (p < 0.001). Meanwhile, Hg and nicotine treatments caused a significant reduction in the GSH content, motility, and acrosome reaction of bull sperm cells. Concomitantly, there was also an improvement in the mentioned altered processes following albumin and manganese addition. Here, Mn had better results than BSA. We found that BSA act as a pro-oxidant when added to medium containing high concentrations of metal ions, imposing more deleterious effects on bull spermatozoa [more increase in the LPO and decrease in GSH level (p < 0.01), decreased acrosome reaction (p < 0.001) and dropped motility]. Conclusion: According to our results, Hg and nicotine may impose sperm dysfunction in bull spermatozoa via altering some biochemical and physiological aspects of sperm like membrane integrity and cell movement. Our data suggest BSA and Mn that involved in antioxidant capacity are as double-edged swords (particularly BSA), which may show unwanted and negative effects.

Keywords

Acrosome reaction

Albumin

Antioxidant

GSH

manganese

Mercury

motility

Nicotine

oxidative stress

Spermatozoa

زمینه و هدف

یکی از عوامل مهم در ناباروری مردان فرآیند استرس اکسیداتیو (OS) است که در بیشتر موارد، اثرات منفی بر گامتها و روند تولیدمثل افراد بر جای می‌گذارد (1). این نوع استرس، زمانی بروز می‌کند که سرعت تولید و عرضة رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) بیش‌تر از سرعت دفع آن از محیط درون و برون سلول باشد. بنابراین تمامی موجودات زنده هوازی با پارادوکسی به نام اکسیژن مولکولی (O2) روبرو هستند؛ یعنی از یک سو به اکسیژن نیاز دارند و از سوی دیگر طی روند استرس اکسیداتیو، انواع ROS نظیر رادیکال هیدروکسیل (OH) و آنیون سوپراکسید (O2-) بر عملکرد و ساختار سلولها تأثیر منفی داشته و بقاء موجود زنده را در معرض خطر قرار می‌دهد.

امروزه کاربرد مواد آنتی‌اکسیدان با هدف خنثی‌سازی ROS و کاهش اثرات منفی ناشی از OS بر سلولها و بافت‌های بدن مدنظر محققان بسیاری قرار دارد. اسپرم به علت دارا بودن مقادیر کمی از آنتی‌اکسیدانها در سیتوپلاسم خود (کاهش سیتوپلاسم در طی روند اسپرماتوژنز)، بسیار وابسته به سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی موجود در پلاسمای مایع منی است و چنانچه به هر علتی نظیر شستشو، این بخش از مایع منی از آن جدا شود، اسپرمها بسیار مستعد آسیب‌های اکسیداتیو خواهند شد (5-1).

یکی از تظاهرات مهم OS در سلول ها، پراکسیداسیون‌ لیپیدهای غشاء (LPO) است که به عنوان پدیده‌ای‌ فیزیولوژی‌ در تمامی‌ سلول‌های غنی از اسیدهای‌ چرب‌ غیراشباع‌، رخ‌ می‌دهد‌ و از مجموعه‌ واکنش‌‌ها‌‌ شامل‌ تخریب‌ و تشکیل‌ مجدد پیوندهای‌ دوگانه‌ در اسیدهای‌ چرب غشایی تشکیل‌ می‌شود. روند LPO موجب تخریب ساختار غشاء، کاهش قدرت تحرک، مهار فعالیت‌های آنزیمی، و ایجاد شکستگی در ساختار DNA اسپرم می‌شود (1،2،4،6،7). در بیشتر موارد، این قبیل تغییرات همراه با ایجاد ناباروری در افراد خواهد بود (1،7،8).

منگنز(Mn2+ ) به‌عنوان یون فلزی کمیاب برای فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز میتوکندری و نیز فعال‌سازی آنزیم‌های هیدرولاز و کربوکسیلاز سلولی ضروری است (9) منگنز در برخورد با برخی رادیکال‌های آزاد نظیر آنیون‌سوپراکساید ضمن تبدیل شدن بهMn3+ باعث حذف این رادیکال می‌گردد (10). آلبومین نیز به عنوان پروتئین کوچک موجود در مایع سمینال و با عمل کلاتوری خود، یون‌های فلز‌ی‌ عامل‌ پیشرفت‌ و گسترش‌ واکنش‌‌های پراکسیداسیون سلولی را جذب و حذف می‌نماید(11).تحقیق Kankofer و همکاران نشان داد که وجود فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی (نوع آنزیمی)در مایع سمینال اسب موجب مهار روند تولیدROS و توقف پراکسیداسیون‌ غشایی می‌شود(12).

با توجه به مطالب فوق و اهمیت القاء استرس اکسیداتیو توسط یون‌های فلزی و دیگر ترکیبات شیمیایی آلاینده محیط که موجب بسیاری از اختلالات بیوشیمیایی و عملکردی در سلول‌ها می‌گردد، هدف این مطالعه بررسی اثرات منفی احتمالی ناشی از افزودن کلرید جیوه و نیکوتین بر عملکرد اسپرم گاو، به عنوان یک مدل جانوری و میان کنش ترکیبات منگنز وآلبومین در تعدیل این اثرات در شرایط in vitro می‌باشد.

روش بررسی

جمع آوری و آماده سازی نمونه‌های اسپرمی: در این تحقیق، آزمایش‌ها روی اسپرم‌های انزال یافته گاو نژاد هولشتاین انجام شد. بدین منظور دوازده نمونه سمینال (سیمن خالص) به کمک روش واژن مصنوعی، از مرکز اصلاح نژاد دام و تلقیح مصنوعی سازمان جهادکشاورزی، روستای کبوترآباد، شهرستان زیار از توابع شهر اصفهان تهیه گردید. نمونه‌های مذکور به سرعت و در یک فلاسک حاوی یخ، به محل آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری در دانشگاه شهرکرد منتقل شد و پس از شستشو با محلول رینگر تایرود (شامل:g8/0 NaCl،g 02/0 KCl،g02/0 CaCl2، g 1/0 NaHCO3، g 005/0 NaH2PO4، g 01/0MgCl2، g1/0 گلوکز، g5/0 Hepes در ml100 آب مقطر دو بار تقطیر شده) دو بار سانتریفوژ (g500، هر بار به مدت 5 دقیقه) گردید تا پلاسمای سمینال از اسپرم تفکیک گردد. در نهایت رسوب اسپرمی حاصله به چهار بخش مساوی تقسیم و به صورت حل شده در حداقل مقدار رینگر تایرود (سوسپانسیون سلولی) در مراحل بعدی پژوهش مورد استفاده قرار گرفتند.

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپید‌های غشاء: به این منظور مقدار تولید ترکیبات واکنش‌دهنده با اسید تیوباربی تیوریک (TBA) از جمله مالوندی آلدئید ، در محیط‌ حاوی اسپرم گاو، اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش شامل نمونه اسپرمی، محلول آبی 2/1% TBA، با یا بدون یون‌های فلزی، نیکوتین و آنتی‌اکسیدانها بود که به مدت 90 دقیقه در دمای  C37 انکوبه شدند.

پس از حرارت دادن مخلوط واکنش، و درانتها سانتریفوژ کردن، مقدارغلظت مجموعه MDA+TBA تشکیل شد. در محیط یا میزان جذب نوری سطحی‌ترین لایه از مخلوط واکنش، در طول موج nm532 با کمک روش طیف سنجی نوری سنجیده شد و واحد نهایی برای آن n moles MDA/mg protein/min، در نظرگرفته شد (13). در این پژوهش جهت نشان دادن فعالیت ویژه واکنش‌های بیوشیمیایی، واحدهای مربوطه در میزان محتوی پروتئین نمونه‌های اسپرمی (برحسب میلی‌گرم) بیان گردیدند.

تعیین میزان واکنش آکروزومی: به منظور تعیین میزان درصد واکنش‌های آکروزومی انجام شده در شرایط مختلف از روش آزمایش هضم ژلاتین استفاده شد (14). در این روش لامها پس از شستشو با الکل به مدت دو ساعت در یخچال نگهداری شدند و سپس یک لایه نازک (l100) از محلول ژلاتین 5/2% روی آنان گسترش داده شد. در مرحله بعد لامها به مدت یک شب در محلول 05/0% گلوتارآلدئید تثبیت گردید. صبح روز بعد یک شستشوی کامل به وسیله آب مقطر جهت حذف مازاد گلوتارآلدئید روی لامها به عمل آمد و سپس به میزان l50 از نمونه‌های اسپرمی به سطح آنان اضافه گردید و در انتهای این بخش، لامها برای 24 ساعت در درون یک اتاقک مرطوب با دمای  C39 نگهداری شدند. پس از انقضای این مدت، لامها با رنگ کوماسی آبی رنگ‌آمیزی شدند و به کمک میکروسکوپ نوری معمولی (با بزرگنمایی 400) تعداد و درصد نقاط روشن اطراف سر اسپرمها یا هاله‌ها (محل‌های هضم ژلاتین توسط آنزیم‌های آزاد شده از آکروزوم) ثبت گردید.

اندازه‌گیری میزان گروه‌های سولفیدریل غیرپروتئینی: این گروه‌ها به عنوان یک سیستم آنتی‌اکسیدانی غیرآنزیمی در درون اسپرم، که در حدود 90% آنان گلوتاتیون احیاء شده (GSH) است، در نمونه‌های اسپرم هوموژن شده (به کمک هوموژنایزر با 300-250 RPM، به مدت 30-20 ثانیه)، با یا بدون یون فلزی و نیکوتین، و نیز آنتی‌اکسیدانها (با زمان انکوباسیون 90 دقیقه) و با به کارگیری DTNB به عنوان معرف به انجام رسید و واحد نهایی برای آنmoles-SH/mg protein/min، در نظر گرفته شد (15).

بررسی قدرت تحرک اسپرم: برای این بررسی، تعداد و درصد سلول‌های متحرک و غیرمتحرک درمحیط‌های متفاوت به کمک میکروسکوپ فازکنتراست، و در حرارت اتاق، به مدت 120 دقیقه و با فواصل زمانی یک ساعت، شمارش گردیدند. در این مرحله، نوع و درجه‌بندی حرکت اسپرمها مد نظر نبود و هر اسپرم با فعالیت حرکتی مشخص در میدان دید به عنوان سلول متحرک ثبت گردید. اسپرم‌های فاقد حرکت در قبل و پس از افزودن نیکوتین و جیوه به عنوان سلول‌های غیرمتحرک (غیرفعال یا مرده) در نظر گرفته شدند (16).

غلظت‌های مورد استفاده از جیوه، نیکوتین و آنتی‌اکسیدانها: در پژوهش حاضر، اثرات کلرید جیوه (HgCl2) با غلظت‌های M600 وM1200 و نیکوتین با غلظت mM75/0 بر عملکرد اسپرم‌ گاو را در میانکنش با ترکیبات منگنز (MnCl2) با غلظت mM1/0 و آلبومین سرم گاوی BSA)) با غلظت 1% بررسی‌نمودیم.

مواد شیمیایی و آنالیز آماری: کلیه مواد شیمیایی مورد استفاده از کارخانة Merck آلمان تهیه و خریداری شد. محلول‌های مورد استفاده به کمک PBS (در آب مقطر دو بار تقطیر) تهیه شدند.

با بهره‌گیری از نرم افزارSPSS version 11.0))، روش آماری Student’s t-testمورد استفاده قرارگرفت. به کمک این روش میانگین داده‌های گروه‌های تجربی (تیمار) با گروه شاهد (کنترل) مقایسه گردید. مقدار 05/0p<، از نظرآماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

آزمون آماری t-test در مورد میانگین داده‌های حاصل از آزمایش سنجش میزان LPO یا تعیین غلظت MDA بعد از یک دوره انکوباسیون 90 دقیقه‌ای، نشان داد که افزودن کلرید جیوه (M600 و1200) و نیکوتین (mM75/0) موجب افزایش قابل توجه و معنی‌داری در میزان تولید کمپلکس MDA+TBA محیط در مقایسه با گروه شاهد (بدون جیوه، نیکوتین و آنتی‌اکسیدانها)، به ترتیب به میزان 74/26 ، 88/34 و 07/29% (01/0p<) گردید (جدول شمارة 1). افزودن آنتی‌اکسیدان‌های منگنز و آلبومین به محیط حاوی اسپرم گاو موجب کاهش معنی‌دار در تولید محصول مهم روند LPO یعنی MDA گردید.

نکته قابل توجه در این میان اثر آلبومین در نمونه‌های اسپرمی تیمار شده با غلظت M1200 جیوه بود که نه تنها باعث کاهشی در میزان تولید MDA محیط نگردید؛ بلکه موجب افزایشی نسبی در مقادیر MDA محیط شد (76/7%). در این قسمت از آزمایشها، جیوه به صورت وابسته به دوز در پیشبرد تولید MDA محیط وارد عمل گردید (جدول شمارة 1).

جدول شمارة 2 مقادیر ثبت شده مربوط به تاثیر جیوه و نیکوتین بر میزان گروه‌های تیولی (GSH) موجود در محیط‌های حاوی اسپرم‌های گاو (با زمان انکوباسیون 90 دقیقه) را نشان می‌دهد. از نظر آماری مشخص گردید که پس از کاربرد جیوه و نیکوتین، کاهش معنی‌داری در غلظت GSH محیط‌های حاوی اسپرم گاو پدید آمد که این کاهش به ترتیب به میزان 79/22%، 71/33% و 69/27% بود. در این قسمت میزان کاهش GSH توسط نیکوتین در حد فاصل کاهش ایجاد شده توسط دو غلظت متفاوت از جیوه قرار داشت. در بررسی نتایج مندرج در جدول شمارة 2 نیز مشخص گردید که کاربرد آلبومین در نمونه‌های اسپرمی تیمار شده با غلظت M 1200 جیوه، میزان کاهش غلظت GSH محیط تشدید شد (22/12%) (جدول شمارة 2).

در جدول شمارة 3، نتایج تاثیر جیوه و نیکوتین بر میزان قدرت تحرک اسپرم گاو در محدوده زمانی 120-0 دقیقه به نمایش درآمده است. بر اساس این داده‌ها مشخص گردید که پس از طی زمان 120 دقیقه انکوباسیون، کاهش معنی‌داری در قدرت تحرک اسپرم‌های گروه شاهد به میزان 35/10% (01/0p<) پدیدار شد و این میزان کاهش در تیمارهای جیوه و نیکوتین نیز تداوم یافته و بیشتر گردید. در این مجموعه از آزمایشها، منگنز در مقایسه با آلبومین از توان آنتی‌اکسیدانی بهتری در جهت افزایش میزان قدرت تحرک اسپرمها در گروه‌های تیماری و نیز شاهد برخوردار بود. مشابه با موارد قبلی، در این قسمت نیز کاربرد آلبومین در گروه‌های تیمار شده با غلظت M 1200 از جیوه نتایج معکوس به دنبال داشت و منجر به کاهش بیشتر (در 90 و 120 دقیقه پس از شروع انکوباسیون) قدرت تحرک اسپرمها گردید.

در آزمایش سنجش میزان فعالیت آکروزومی اسپرم‌های گاو در شرایط مختلف مشخص گردید که تیمارهای جیوه (M600 وm1200) و نیکوتین (mM75/0) موجب کاهش معنی‌دار درصد اسپرم‌های واجد واکنش آکروزومی گردیدند (جدول شمارة 4). این میزان کاهش در تیمار با جیوه M1200 بیشتر از سایر تیمارها بود (98/10%، 001/0p<). منگنز از قدرت آنتی‌اکسیدانی بهتری نسبت به آلبومین برخوردار بود. در این قسمت نیز آلبومین رفتار بیوشیمیایی مشابه‌ای را ارائه داد و در گروه‌های تیمار شده با غلظت M1200 از جیوه، موجب کاهش بیشتری در تعداد اسپرم‌های با آکروزوم تخلیه شده، گردید (جدول شمارة 4).

بحث

پژوهش‌های اخیر نشان داده است که اثرات منفی ROS وLPO بر ساختار اسپرم، به عنوان یک عامل مهم در بروز ناباروری در انسان در نظر گرفته شده، و از میان آنها می‌توان به اختلالات وسیع غشاء، کاهش قدرت تحرک، اختلالات آکروزومی اسپرمها، که موجب تضعیف اتصال اسپرم به تخمک و انجام لقاح اشاره نمود (18-16، 1،3،4،6). از آن جایی که اسپرم طی اسپرماتوژنز حجم عمده‌ای از سیتوپلاسم خود را از دست می‌دهد؛ لذا در مقایسه با سلول‌های سوماتیک از ذخیره و توان آنتی‌اکسیدانی کمتری برخوردار هستند و چنانچه پلاسمای سمینال (محیط بقاء زیست اسپرمها) که حاوی انواع زیادی از آنتی‌اکسیدان هاست، به نحوی از آنان جدا گردد شرایط بسیار خطرناک و نامطلوبی را برای این سلولها فراهم خواهد آورد که اولین پیامد آن هجوم ROS موجود در محیط به آنان خواهد بود (18، 17).

در پژوهش حاضر اثرات غلظت‌های M600 و M1200 جیوه و mM75/0 نیکوتین بر روی اسپرم‌های گاو و میان کنش آن با ترکیبات منگنز و آلبومین مورد بررسی قرارگرفت.

جیوه یک یون فلزی بسیار فعال و لیپوفیل است به طوری که بخار آن به سرعت از راه ریه‌ها و مخاط دهان جذب خون می‌شود. این عنصر پس از جذب در بدن از غشاء سلولها عبور می‌نماید ودر بافت‌های بدن انباشته می‌گردد(19). گزارش‌های زیادی از اثرات سمی جیوه برعملکرد سلول‌های جانوری موجود است. جیوه موجب القاء تولید ROS درون سلول، آسیب به لوله‌های منی‌ساز بیضه، القاء و آپوپتوز در سلولها می‌شود (23-20). نتایج حاصل از پژوهش حاضر نیز نشان می‌دهد که جیوه به صورت وابسته به زمان، قادر به القاء و پیشبرد معنی‌دار روند LPO در نمونه‌های اسپرم گاو است، که این اثر با افزایش غلظت MDA محیط به اثبات رسید.

در مورد مکانیسم و محل اثر جیوه در غشاء سلولها، در گزارشی عنوان شد که جیوه در بافت‌های کبدی و کلیوی موشها موجب گسترش روند LPO می‌شود و این اثر خود را از طریق پراکسیداسیون فسفاتیدیل سرین و فسفاتیدیل اتانول آمین موجود در غشاء این سلولها به انجام رسانیده که خود مؤید حساسیت زیاد این دو فسفولیپید نسبت به جیوه است (24). همچنین براساس یافته‌های اخیر تحقیقات جیوه علاوه بر چسبیدن به گروه‌های سولفیدریلی (تیولی) پروتئینها، به مجموعه‌ای از نقاط ویژه در مجموعه‌های فسفولیپیدی غشاء سلولها نیز متصل شده و موجب کاهش سیالیت غشاء می‌شود (25). در یکی از جدیدترین پژوهشها توسطMarchi و همکاران مشخص شد که جیوه از طریق فعال‌سازی فسفولیپاز A2 موجود در غشاء لیزوزوم‌های سلولها موجب ناپایداری و تخریب ساختار غشاء این اندامک درون سلولی می‌شود (26).

از سوی دیگر در سایر پژوهشها به تولید مستقیم ROS توسط تاثیر جیوه بر بافت‌های بدن جانوران اشاره دارد که موجب پیشبرد روند LPO در سلول‌های آنان می‌شود (29-27).

نتایج قبلی در مورد تاثیر یون‌های فلزی جیوه و مس بر سلول‌های آبشش ماهی کپور معمولی نیز نشان می‌دهد که جیوه به صورت وابسته به غلظت، موجب القاء پراکسیداسیون سلولی و افزایش تولید MDA در سوسپانسیون‌های سلولی می‌شود (5). بر طبق یک قاعده کلی، یون‌های فلزی به کمک عمل واسطه‌ای خود قادر به تولید رادیکال پر قدرت .OH(به عنوان محرک اصلی شروع روند LPO) از دیگر انواع ROS بوده که با نام معادله هابر- ویس معروف است و به صورت زیر به انجام می‌رسد (30):

یون فلزی

.O2- + H2O2 . O2 + .OH + OH-

از سویی دیگر، نیکوتین به عنوان ماده‌ای فعال در دود سیگار منجر به افزایش سطح ROSپلاسمای سیمن می‌شود، بدین ترتیب درجاتی از اختلال در قدرت باروری اسپرم را القاء می‌کند (31). در پژوهش حاضر نیز پس از افزودن نیکوتین، میزانLPO محیط پس از 90 دقیقه انکوباسیون به صورت معنی‌دار افزایش یافت که این موید افزایش میزان ROS در محیط حاوی اسپرم‌های گاو بود و منجر به بروز پراکسیداسیون گردید. در مطالعه‌ای روی سلول‌های پانکراس در انسان مشخص گردید که افزودن نیکوتین به محیط کشت این سلولها موجب افزایش میزان ROS محیط و به دنبال آن افزایش روند LPO می‌گردد (32).

MDA نیز به عنوان یکی از محصولات نهایی روند LPO به راحتی با نفوذ به ساختار بیوشیمیایی غشاء سلولها موجب عدم تقارن در ساختار لیپیدی آن شده و به این ترتیب موجب کاهش سیالیت غشاء می‌شود. کاهش سیالیت غشاء موجب کاهش قدرت تحرک اسپرم و نیز عدم کارایی اسپرم اتصال به تخمک و عمل لقاح می‌گردد (33).

GSH به عنوان تری‌پپتیدی مهم در درون انواع سلول‌های موجودات زنده با حداکثر غلظت mM10 وجود دارد. با توجه به وجود گروه تیول در ساختار GSH و واکنش خنثی کنندگی این ترکیب با رادیکال‌های آزاد محیط، در صورت بروز هرگونه اختلال در تولید و ذخیره GSH، شاهد گسترش هرچه بیشتر روند LPO خواهیم بود (34 ). کاهش میزان GSH در تیمارهای مختلف با جیوه به اثبات رسیده است (35). نتایج آزمایش‌های حاضر نشان داد که تیمارهای جیوه و نیکوتین موجب کاهش قابل ملاحظه و معنی‌داری در میزان GSH نمونه‌های اسپرم گاو گردید. طی مطالعه‌ای دیگر نیز مشخص گردید که GSH توسط میانکنش مستقیم با عناصر فلزی نظیر جیوه (اتصال یک یون جیوه به روش کوئووالانسی با دو مولکول GSH)، سبب خنثی‌سازی و سپس دور سازی آنان از محیط زیست سلولها شده و بدین ترتیب ضمن کاهش غلظت GSH سلول، از سمیت جیوه در درون سلولها نیز کاسته می‌شود (36). از سوی دیگر با توجه به القاء LPO توسط جیوه و نیکوتین که به طور یقین از مسیر تولید ROS عبور نموده، کاهش میزان GSH محیط در ارتباط با اثر قوی آنتی‌اکسیدانی این ترکیب بوده که ضمن خنثی‌سازی ROS محیط، به گلوتاتیون اکسید شده تبدیل شده است.

قـدرت تحـرک پیشـرونـدة اسپـرمها بـه عنـوان عـامـل تعیین‌کننده و موثر در باروری افراد مطرح می‌شود و متضمن لقاح موفقیت‌آمیز خواهد بود. طی این پژوهش مشخص شد که تیمارهای جیوه و نیکوتین موجب کاهش درصد اسپرم‌های متحرک در محیط گردد و براساس نتایج قبلی قدرت تحرک اسپرمها به هنگام افزایش رادیکال‌های آزاد و محصولات میانی و یا نهایی روند LPO درمحیط آزمایش، به صورت معنی‌داری کاهش یافته و در واقع به دنبال اختلال در فرایندهای تبادل یونی غشاء وآنزیم‌های دخیل در آن، از میزان فعالیت و تحرک این سلولها کاسته می‌شود (37).

از سوی دیگر، انواع ROS موجب مهار آنزیم‌های درون سلولی نیز می‌گردد، بدین ترتیب اسپرمها از منابع آنزیمی دخیل در تأمین ATP مورد نیاز جهت قدرت تحرک محروم می‌گردند (3،16،37،38). تغییرات ناشی از پراکسیداسیون اجزاء غشاء اسپرمها منجر به کاهش فعالیت آنزیم Na+/K+-ATPase (به عنوان یک پمپ یونی دخیل در حرکت) و در نهایت افت شدید در قدرت تحرک این اسپرمها می‌شود (38). در پژوهش دیگری در سال 2000 نیز مشخص گردید که یون‌های فلزی سمی از طریق ایجاد اختلال در سازمان‌دهی اجزاء غشاء میتوکندری‌های اسپرم، باعث کاهش معنی‌داری در قدرت تحرک آنان می‌شوند (39).

واکنش آکروزومی (آزاد شدن آنزیم‌های هیدرولیتیک از کیسه آکروزومی اسپرم) کامل و طبیعی جهت نفوذ اسپرم به درون لایه‌های محافظ تخمک و به دنبال آن عمل لقاح لازم و ضروری است. بر اساس نتایج پژوهش، تیمارهای جیوه و نیکوتین موجب کاهش معنی‌داری در درصد اسپرم‌های واجد واکنش آکروزومی گردیدند. بر اساس نتایج سایر پژوهشها، نقایص عملکردی ناشی از تاثیرROS وLPO بر اسپرمها موجب کاهش قدرت تحرک و انجام واکنش آکروزومی ناقص در آنان شده که نتیجه آن عدم موفقیت‌ اسپرم در اتصال به تخمک و عمل لقاح است(17).

براساس این نتایج می‌توان به بروز تغییرات ناشی از پراکسیداسیون لیپیدها در غشاء اسپرمها اشاره نمود که منجر به ارائه یک واکنش آکروزومی غیرطبیعی شده است. از آن جایی که وجود یک غشاء سالم و طبیعی جهت انجام واکنش آکروزومی ضروری است، لذا هرگونه ایجاد آسیب در ساختار بیوشیمیایی غشاء، منجر به کاهش قدرت باروری اسپرمها و اختلال در روند باروری فرد خواهد شد. در پژوهش حاضر، منگنز به میزان بیشتری در جهت بهبود وضعیت غشاء اسپرمها و واکنش آکروزومی آنان در مقایسه با آلبومین عمل نمود.

کاربرد آنتی‌اکسیدانها به عنوان مواد دور کننده رادیکال‌های آزاد از محیط اطراف سلولها موجب فروکش‌سازی روند LPO و دیگر اثرات منفی آنان شده و بدین ترتیب ساختار بیوشیمیایی سلولها و فیزیولوژی آنان محفوظ خواهند ماند. در پژوهش حاضرنیز مشخص گردید که کاربرد غلظت‌های مشخص از منگنز و آلبومین موجب کاهش و مهار روند LPO، افزایش میزان GSH در محیط، و ایجاد بهبود در قدرت تحرک اسپرمها می‌شود. در این میان منگنز به عنوان آنتی‌اکسیدان بهتر و با نتایج مطلوب‌تر نسبت به آلبومین عمل نمود.

نتیجه‌گیری

در بررسی به عمل آمده در پژوهش حاضر مشخص شد که آلبومین علاوه بر فعالیت آنتی‌‌اکسیدانی، واجد نوعی خاصیت پرواکسیدانی نیز می‌باشد. در خصوص توجیه این خاصیت آلبومین که در مواجهه با غلظت‌های زیاد از یون‌های فلزی از خود نشان می‌دهد، می‌توان عنوان کرد که گروه تیولی موجود در ساختار آلبومین موجب اوتواکسیداسیون یون‌های فلزی شده و این روند در نهایت موجب عرضه یون‌های سوپراکسید به محیط شده، که خود عامل تشدید کننده پراکسیداسیون سلولی خواهد بود. بنابراین کاربرد آنتی‌اکسیدانها به مثابه یک تیغ دو لبه است که در یک محدوده بسیار ظریف از تغییرات غلظت، ضمن تغییرماهیت، مبدل به عوامل خطرآفرین برای بسیاری از سلولها خواهند شد (40).

تشکر و قدردانی

مؤلفین بدین وسیله مراتب تقدیر و تشکر خود را از همکاری سرکار خانم دکتر نها افتخاری (در آنالیز آماری) و از کمک‌های جناب آقای سید رسول صیدایی (در اجرای آزمایشها) کارشناس محترم آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری گروه زیست شناسی دانشگاه شهرکرد، اعلام می‌دارند.

Agarwal A., Saleh R.A., Bedaiwy M.A. Role of rea-ctive oxygen species in the pathophysiology of human reproducetion. Fertil Steril.2003;79:829-843.
عربی مهران، راویندر آناند. تاثیر نیکوتین بر اسپرم افراد نورمواسپرمیک: تعدیل توسط آنتی‌اکسیدانها. فصلنامه باروری و ناباروری،سال سوم،شماره یازدهم، تابستان1381،صفحات22-11.
Arabi M., Sanyal S.N., Kanwar U., Anand, R.J.K. The Effect of antioxidants on nicotine and caffeine induced changes in human sperm-An in vitro Study. In: Male fertility and lipid metabolism. Editors. De Vriese S.R., Christophe A.B.), Chapter 16, Published by AOCS Press, USA.2003;pp:250-267.
Arabi M. Nicotinic infertility: assessing DNA and plasma membrane integrity of human spermatozoa. Andrologia.2004;36(5):305-310.
Arabi M. Analysis of impact of metal ion contamina-tion on Carp (Cyprinus carpio L). Biol Trace Elem Res. 2004;100(3):229-246.
Aitken R.J., Clarkson J.S., Fisher S. Generation of rea-ctive oxygen species, lipid peroxidation and human sperm function. Biol Reprod.1989;40:183-197.
Iwasaki A., Gagnon A. Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients. Fertil Steril.1992;57:409-416.
Agarwal A., Allamaneni S.S., Nallella K.P., George A. T., Mascha E. Correlation of reactive oxygen species levels with the fertilization rate after in vitro fertili-zation: a qualified meta-analysis. Fertil Steril.2005;84 (1):228-231.
Sikka S.C. Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Front Biosci. 1996;1:78-86.
Depuydt C.E., Bosmans E., Zalata A., Schoonjans F., Comhaire F. The relation between reactive oxygen spe-cies and cytokines in andrological patients with or without male accessory gland infection. J Androl.1996; 17:699-707.
Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radical in biolo-gy and medicine. 2nd Edition, Published by Clarendon Press, Oxford.1989;pp:372-390.
Kankofer M., Kolm G., Aurich J., Aurich C. Activity of glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase and peroxidation intensity in stallion semen during storage at 5 degrees C. Theriogenology.2005; 63(5):1354-1365.
Aitken R.J., Harkiss D., Bukingham D. Relationship between iron-catalyzed lipid peroxidation potential and human sperm function. J Reprod Fertil.1993;98:257-265.
Fiscor G., Ginsberg L.C., Oldford G.M., Snoke R.E., Becker R.W. Gelatin-substrate film technique for detec-tion of acrosin in single mammalian sperm. Fertil Steril. 1983;30:543-552.
Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total, protein-bound and non- protein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Anal Biochem. 1968;25:192-205.
Verma A., Kanwar K.C. Human sperm motility and lipid peroxidation in different ascorbic acid concentra-tions: an in vitro analysis. Andrologia.1998;23:325-29.
Sharma R.K., Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. J Urol.1996;48:835-850.
Crinnion W.J. Environmental medicine, part three, Long-term effects of chronic low dose mercury expo-sure. Altern Rev Med.2000;5:209-223.
Schurz F., Sabater-Vilar M., Fink-Gremmels J. Mut-agenicity of mercury chloride and mechanisms of cellular defence: the role metal-binding proteins. Mutage-nesis. 2000;15(6):525-530.
Rao M.V., Sharma P.S. Protective effect of vitamin E against mercuric chloride reproductive toxicity in male mice. Reprod Toxicol.2001;15:705-712.
Araragi S., Kondoh M., Kawase M., Saito S., Higash-imoto M., Sato M. Mercuric chloride induces apoptosis via a mitochondrial-dependent pathway in human leukemia cells. Toxicology.2003;184:1-9.
Sener G., Sehirli A.O., Ayanoglu-Dulger G. Melatonin protects against mercury (II)-induced oxidative tissue damage in rats. Pharmacol Toxicol. 2003;93:290-296.
Shinada M., Takizawa Y., Muto H. Effect of mercuric chloride on phospholipid peroxidation in rat. Nippon Koshu Eisei Zasshi.1990;37(12): 1010-1014.
Delnomdedieu M., Allis J.W. Interaction of inorganic mercury salts with model and red cell membrane: im-portance of lipid-binding sites. Chem Biol Interact.1993; 88:71-87.
Marchi B., Burlando B., Moore M.N., Viarengo A. Mercury and copper-induced lysosomal membrane destabilisation depends on [Ca2+]i dependent phosphor-lipase A2 activation. Aquat Toxicol.2004;66:197-204.
Lund B.A., Miler D.M., Woods J.S. Mercury-induced H2O2 formation and lipid peroxidation in vitro in rat kidney mitochondria.Biochem Pharmacol.1991;42:181-187.
Nath K.A., Croatt A.J., Likely S., Behrens T.W., Warden D. Renal oxidant injury and oxidant response induced by mercury. Kidney Int.1996;50:1032-1043.
Ariza M.E., Bijur G.N., Williams M.V. Lead and mer-cury metagenesis: Role of H2O2, superoxide dismutase, and xanthine oxidase. Environ Mol Mutagen.1998;31: 352-361.
Halliwel B., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxy-gen radicals, transition metals and disease. Biochem J. 1984;219:1-14.
Cope G.F. The in vitro effects of nicotine and cotinine on sperm motility. Hum Reprod.1998;13:777-778.
Wetscher G.J., Bagchi M., Bagchi D., Perdikis G., Hinder P.R., Glaser K., Hinder R. Free radical production in nicotine treated pancreatic tissue. Free Radic Biol Med.1995;18:877-882.
Yuli I., Wilbrandt W., Shinitzky M. Glucose transport through cell membrane of modified lipid fluidity. Biochemistry.1981;20:4250-4257.
Meister A., Anderson M.E. Glutathione. Ann Rev Biochem.1983;52:711-760.
Elia A.C., Galarini R., Taticchi M.I., Dorr A.J., Man-tilacci L. Antioxidant responses and bioaccumulation in Ictalurus melas under mercury exposure. Ecotoxicol Environ Saf.2003;55:162-167.
Hultberg B., Anderson A., Isaksson A. Interaction of metals and thiols in cell damage and glutathione distri-bution: potentiation of mercury toxicity by dithiothrei-tol. Toxicology.2001;156: 93-100.
Lissak A., Wiener-Megnazi Z., Reznick A.Z., Shnizer S., Ishai D., Grach B., Lahav-Baratz S., Shiloh H., Koi-fman M., Dirnfeld M. Oxidative stress indices in semi-nal plasma, as measured by the thermocheminesce-nce assay, correlate with sperm parameters. Fertil Steril. 2004;81(suppl.1):792-797.
Bilodeau J.F., Blanchette S., Cormier N., Sirard M.A. Reactive oxygen species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by pyru-nate, metal chelators and bovine liver or oviduvtal fluid catalase. Theriogenology.2002;57(3):1105-1122.
Woo A.L., James P.F., Lingrel J.B. Sperm motility is dependent on a unique isoform of the Na, K-ATPase. J Biol Chem.2000;275:20693-20699.
Au D.W., Chiang M.W., Wu R.S. Effects of cadmium and phenol on motility and ultrastructure of sea urchin and mussel spermatozoa. Arch Environ Cont Toxicol. 2000;38(4):455-463.
Tien M., Bucher J.R., Aust S.D. Thiol-dependent lipid peroxidation. Biochem. Biophys Res Commun.1982;107(1):279-285.