Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

A morphologic and morphometric study of adult mouse testis following different doses of busulfan administration

Authors
Mohammad Amin Homafar 1
Jafar Soleimanirad 2
Ahmad Ali Ghanbari 3
1 Faculty of Medicine, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran
2 Histology Department, Faculty of Medicine, Tabriz Medical Sciences University, Tabriz, Iran
3 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran
Abstract
Introduction: Anti-cancer drugs have adverse effects on spermatogenesis. Therefore, informa-tion on their role for the prevention of germinal epithelium destruction is necessary. The aim of this study was morphologic and morphometric evaluations of testes, measurement of volume and volume density of testes parameters, measurement of tubular diameters, germ and somatic cell counts following administration of different doses of busulfan in adult mice. Materials & Methods: In the present study, 42 male NMRI mice aged 6-8 weeks were used. The animals were divided into 5 groups. Case groups received a single dose of busulfan by intraperitoneal injection as 5, 10, 20 and 40 mg/kg in the first, second, third and forth groups respectively. The control group received only the solvent for busulfan. All the animals were killed 35 days after treatment and their testes were dissected out and processed for light microscope studies. Then morphometric studies were performed on testicular parameters. The data were analyzed using ANOVA and Tukey test and p values less than 0.05 were considered significant. Results: Busulfan administration in 5, 10, 20 and 40 mg/kg doses significantly reduced most morphometric parameters in testes with a maximum effect in the 40 mg/kg group. Volumes of testes, tubules and germinal epithelia were decreased significantly in the experiment groups (p < 0.05) however, the volume of interstitial tissue increased (p < 0.05). Tubular diameters and thickness of epithelia were also decreased in the experiment groups. Number of germ cells was reduced, but number of sertoli cells was not affected. The number of leydig cells were not affected in 10 and 20 mg/kg busulfan treated groups, however in the 40 mg/kg treated group they were increased significantly (p < 0.003). In 5 mg/kg treated group there were no significant differences in morphologic and morphometric studies. Conclusion: Busulfan could reduce testicular parameters and disrupt spermatogenesis through affecting both germ and somatic cells in a dose dependent manner. Therefore, the side effects of busulfan on spermatogenesis should be considered during cancer therapies.
Keywords
busulfan
Chemotherapy
Germ cells
morphometry
Mouse
spermatogenesis
Testis

زمینه و هدف

اسپرماتوژنز فرآیندی بسیار پیچیده است که عوامل متعددی می‌تواند بر آن اثر کرده و منجر به ناباروری و یا کاهش باروری در فرد شود (1). از جمله عوامل دارای آثار سوء بر اسپرماتوژنز شیمی‌درمانی است که با مکانیسم‌های مختلفی با اثر بر روند تقسیمات سلولی در لوله‌های سمی‌نیفروس در نهایت باعث ایجاد آزواسپرمی و ناباروری می‌گردد (3،2). آزواسپرمی به دنبال شیمی‌درمانی عارضه‌ای مهم و قابل توجه است که گاهی بسته به نوع و مقدار مصرف دارو سال‌های طولانی حتی 20- 15 سال نیز به طول می‌انجامد (4). علاوه بر شیمی‌درمانی، عوامل متعددی چون ضایعات پاتولوژی مادرزادی، آتروفی دفران و اپی‌دیدیم، وازکتومی دو طرفه، سندرم سلول سرتولی، توقف بلوغ اسپرم، سندرم کلاین فلتر، آتروفی بیضه در کریپتور-کیدیسم و همین طور توقف اسپرماتوژنز به دنبال عوامل داروئی از جمله فاکتورهای دخیل در ایجاد آزواسپرمی هستند (5). بوسولفان یکی از داروهای مورد استفاده در شیمی- درمانی است که دارای خاصیت آلکیله‌کنندگی بوده و عموماً جهت درمان لوسمی مزمن، کانسر تخمدان و همچنین قبل از پیوند مغز استخوان در بیماران سرطانی استفاده می‌شود (7،6). این دارو جزء گروه مواد دی‌استرهای‌متان سولفونیک اسید و تحت عنوان 4و1 بوتان‌دی‌متیل ‌سولفونات می‌باشد (8). براساس مطالعات انجام شده در جنین و یا نوزاد رت‌‌های متولد شده از مادران حامله‌ که در دوران بارداری در معرض این دارو بوده‌اند، این دارو باعث اختلال کارکردی گناد و کاهش سلول‌های سوماتیک و ژرمینال بیضه می‌شود (10،9). استفاده از بوسولفان به صورت تک دوز با مقادیر بالا یعنی mg/kg 55-40 در موش بالغ باعث القاء آزواسپرمی می‌شود (12،11). بررسی‌های انجام‌ شده نشان می‌دهند که در انسان درمان ترکیبی بوسولفان همراه با سیکلوفسفاماید باعث کاهش فعالیت گنادها و اختلالات آندوکرینی می‌شود؛ ضمن این که در آن مطالعات هیچ‌گونه بیوپسی بیضه و مطالعه هیستوپاتولوژیک انجام نگرفته است (15-13،2).

در ارتباط با اثرات توکسیک بوسولفان به تنهایی بر بیوپسی و هیستوپاتولوژی بیضه انسان گزارشات زیادی در دسترس نمی‌باشد. بیشتر مطالعات اثر توکسیک بوسولفان بر بیضه روی مدل‌های جوندگان مانند موش و رت بوده و مخصوصاً در سال‌های اخیر عمدتاً جهت القاء آزواسپرمی قبل از پیوند سلول‌های ژرمینال به داخل بیضه در گونه‌های مختلف مطرح شده است (12،11).

به نظر می‌رسد که به دنبال مصرف بوسولفان اختلال ایجاد شده در اسپرماتوژنز، ناشی از خاصیت آلکیله‌کنندگی آن و اثرات عمده آن بر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی باشد (7،6). تغییرات مورفومتریک بافتی مانند تغییرات حجم سلولها و پارامترهای بیضه و تعداد سلول‌های اپیتلیوم ژرمینال بیضه از جمله نکات قابل توجه در مطالعات فیزیولوژی و سم‌شناسی بافت بیضه محسوب می‌شوند و برای درک شروع و پیشرفت اختلالات اسپرماتوژنز و باروری حائز اهمیت می‌باشند (17،16).

تاکنون آزمایشات تجربی متنوعی در زمینه اثرات بوسولفان بر روی اسپرماتوژنز خصوصاً در موش و رت انجام شده است. این مطالعات هم در دوره جنینی و پره‌ناتال (10،9) و هم در دوره بزرگسالی (21- 18) انجام گرفته است. استفاده از بوسولفان به‌عنوان روش داروئی مناسب جهت تخلیه لوله‌های سمی‌نیفروس قبل از پیوند سلول‌های ژرمینال به داخل بیضه به ویژه در سال‌های اخیر مورد توجه زیادی قرار گرفته است (12،11). مطالعات در مورد اثرات بوسولفان عمدتاً به صورت کیفی و هیستوپاتولوژیک بوده است و در موارد مطالعات کمی نیز صرفاً به صورت شمارش سلولی بوده است (20-18). در این بررسیها پس از تجویز تنها یک دوز دارو مطالعات هیستولوژیک در زمان‌های مختلف انجام شده است و به عبارت دیگر مطالعه وابسته به زمان بوده است (20،19). اگرچه Bucci و همکاران در سال 1987 ارزیابی وابسته به دوز داشته‌اند؛ ولی در ارزیابی خود صرفاً مطالعه هیستولوژیک کیفی لوله سمی‌نیفروس، مطالعه آنومالی کروموزومی اسپرم و موتاسیون‌های کشنده غالب در اسپرمها را انجام داده و در آن مطالعه اشاره‌ای به شمارش سلولی و ارزیابی کمی پارامترهای مختلف بیضه نشده است (21). مطالعات کمی به ویژه در کنار مطالعات مورفولوژیک دارای ارزش و دقت بالاتری هستند (22،17). با توجه به اینکه تاکنون مطالعه‌ای در زمینه تاثیر بوسولفان به صورت وابسته به دوز از جهت کمی انجام نشده است؛ لذا مطالعه حاضر با هدف مطالعه حجم و دانسیته حجمی توبولها و بافت بینابینی بیضه با روش جدید مورفومتری، اندازه‌گیری اقطار توبولها و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال با کمک آنالیز کامپیوتری و همچنین شمارش سلول‌های ژرمینال و سوماتیک بیضه موش بالغ به دنبال تجویز دوزهای مختلف بوسولفان در کنار مطالعه مورفولوژیک صورت گرفت تا آثار تخریبی بیشترین دوز و کمترین دوز در بیضه مشخص شود.

روش بررسی

در این مطالعه از موش‌های نر نژاد NMRI با سن 8–6 هفته استفاده شد. حیوانات در شرایط استاندارد حیوانخانه با دسترسی کافی به آب و غذا و دمای مناسب  C3±21 و 12ساعت روشنائی نگهداری شدند. حیوانات به طور تصادفی به 5 گروه شامل چهار گروه آزمایش و یک گروه کنترل تقسیم گردیدند. تعداد حیوانات در همه گروهها 8 سر بود؛ مگر در گروه تحت درمان با دوز mg/kg40 که از ده سر موش استفاده شد. حیوانات در گروه‌های آزمایش به ترتیب تحت درمان با دوزهای mg/kg 20،10،5 و 40 بوسولفان (Sigma, USA) به صورت یک دوز داخل صفاقی تزریق شد. جهت حل کردن دارو مطابق مطالعه Udagawa و Xu از DMSO (Sigma, USA) استفاده شد (24،23). برای این منظور ابتدا mg10 پودر بوسولفان در ml1 از DMSO حل نموده و بلافاصله پس از آن ml 1 آب مقطر نیز به آن اضافه شد تا محلولی با غلظت mg/ml 5 به دست آید. سپس براساس وزن حیوان موردنظر تزریقات انجام گرفت. با توجه به این که بوسولفان خیلی سریع رسوب می‌نماید، بنابراین باید این محلول به صورت کاملاً تازه تهیه شده و عمل تزریق نیز سریع انجام شود (23). حیوانات گروه شاهد یک دوز DMSO به صورت داخل صفاقی دریافت کردند. با توجه به سیکل کامل 35 روزه اسپرماتوژنز در موش (26،25)، 35 روز پس از درمان، حیوانات با کلروفرم بیهوش و پس از پرفیوژن قلبی، بیضه آنها از حفره شکمی خارج شد. نمونه‌ها برای مدت 48 ساعت در فیکساتیو بوئن در دمای اتاق غوطه‌ور شدند و سپس برای مطالعه با میکروسکوپ نوری (Zise, Germany) پاساژ داده شدند. جهت به حداکثر رساندن تعداد برش‌های مناسب لوله‌های سمی‌نیفروس در مقطع عرضی، بیضه‌ها در جهت محور طولی در پارافین قالبگیری شدند. سپس با استفاده از دستگاه میکروتوم دوار (Leitz, Germany) مقاطعی با ضخامت m5 و فواصل منظم m200 به صورت نمونه‌گیری تصادفی منظم و یکنواخت تهیه گردید. از هر بیضه 8 اسلاید انتخاب و به طریق هماتوکسیلین ائوزین، رنگ‌آمیزی و با میکروسکوپ نوری مطالعه شد (27).

تخمین حجم بیضه: برای اندازه‌گیری، تصاویر از یک میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین تهیه و با استفاده از نرم‌افزار مخصوص تخمین حجم انجام گرفت. سپس با بزرگنمائی 165، شبکه نقاط گرید استاندارد متشکل از شبکه صلیبی به صورت کاملاً تصادفی و بدون هیچ‌گونه سو‌گرائی روی تصاویر بافتی منتقل شد و سپس با شمارش نقاط برخورد گرید با شاخص‌های مورد نظر با استفاده از قانون کاوالیری مطابق فرمول حجم بیضه به دست آمد (31،30).

در این فرمول p تعداد نقاط برخورد گرید با شاخص مورد نظر، a(p) مساحت مربوط به اطراف هر نقطه در شبکه، t متوسط ضخامت مقاطع وM2، مربع بزرگنمائی نهائی می‌باشد (29،28).

برای تخمین چگالی حجمی لوله سمی‌نیفروس و بافت بینابینی بیضه و نیز محاسبه دانسیته حجمی هر یک از شاخص‌های مورد نظر نیز از تکنیک شمارش نقطه‌ائی استفاده شد. مجموع تعداد نقاطی که روی ناحیه موردنظر قرار می‌گرفت P(y) بر تمام نقاطی که بر کل بیضه منطبق می‌گردید P(ref) تقسیم و پس از ضرب در عدد 100، به صورت درصد بیان شد (29،28).

اندازه‌گیری قطر مجرا و لوله سمی‌نیفروس با استفاده از تصاویر حاصل از یک میکروسکوپ نوری (Olampus, Germany) مجهز به دوربین و با استفاده از نرم افزار ویژه انجام گرفت. پس از ذخیره تصاویر بافتی، با بزرگنمائی 165 برابر در هر مقطع سه میدان و حداقل تعداد 20 لوله در مقطع عرضی در هر بیضه به صورت تصادفی انتخاب و ابتدا اقطار بزرگ و کوچک عمود بر هم در هر لوله اندازه‌گیری و میانگین اقطار بر حسب میکرون ثبت شد. ضخامت اپی‌تلیوم ژرمینال نیز به صورت غیرمستقیم و با کسر قطر مجرای داخلی لوله از قطر لوله سمی‌نیفروس محاسبه گردید (27).

شمارش سلول‌های ژرمینال، سرتولی و لیدیگ: برای این منظور مقطع عرضی 20 لوله سمی‌نیفروس (تقریباً یک اندازه) در هر بیضه انتخاب شد. در هر لوله تعداد سلول‌های سرتولی، اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت‌های اولیه، اسپرماتیدهای دراز و گرد مورد شمارش قرار گرفتند. همچنین در بافت بینابینی مربوط به هر بیضه در 20 میدان میکروسکوپی تعداد سلول‌های لیدیگ شمارش شد. جهت شمارش سلولی از میکروسکوپ نوری زایس با بزرگنمایی 400 و همچنین مشخصات مورفولوژیک سلولی استفاده می‌گردید (30).

سلول‌های ژرمینال سرتولی در داخل لوله سمی‌نیفروس و سلول‌های لیدیگ در بافت بینابینی قرار دارند. سلولها از نظر مرفولوژی به‌صورت زیر گروه‌بندی می‌شدند:

سلول سرتولی: هسته این سلولها کاملاً متفاوت از سلول‌های ژرمینال است. هسته اغلب مثلثی، هرمی نامنظم و یوکروماتین می‌باشد و این سلولها حاوی یک هستک واضح می‌باشند.

اسپرماتوگونی: این سلولها برروی غشاء پایه قرار دارند و دارای هسته یوکروماتین بیضوی شکل همراه با یک یا 2 هستک هستند این سلولها دارای دوگروه تیره و روشن هستند و در این مطالعه هر دو نوع سلول تحت یک عنوان بررسی شد.

اسپرماتوسیت اولیه: بین غشاء پایه و سلول‌های گرد کوچک اسپرماتید گرد، در چند طبقه سلول‌های درشت‌تری بنام اسپرماتوسیت اولیه به چشم می‌خورد که هسته آنها در مراحل مختلف میوز، لپتوتن، زیگوتن، پاکی‌تن، دیبلوتن دیاکینز بودند و در مطالعه ما همه آنها تحت یک گروه اسپرماتوسیت اولیه بررسی می‌شدند.

اسپرماتیدها: این سلولها براساس موقعیت قرارگیری و سایزشان به راحتی از اسپرماتوسیت‌های اولیه قابل تشخیص بودند. اسپرماتیدها به لومن نزدیکتر بودند و اندازه کوچکتری داشتند ضمن این که فاقد هتروکروماتین بودند به‌طور کلی این سلولها به 3 دسته قابل تقسیم هستند.

1) اسپرماتیدهای گرد که شکل سلولها کاملاً گرد است.

2) اسپرماتید در حال دراز شدن که شکل آنها نه کاملاً گرد و نه کاملاً دراز می‌باشد.

3) اسپرماتیدهای دراز دارای هسته کشیده و دم هستند که در مطالعه حاضر اسپرماتیدها در دو گروه یعنی اسپرماتید گرد و اسپرماتید دراز بررسی شدند.

سلول‌های لیدیگ: این سلولها برخلاف سایر سلول‌های ذکر شده در خارج سمی‌نیفروس و در بافت بینابینی و اغلب به صورت گروهی قابل رویت بودند. سلول‌های لیدیگ اسیدوفیل دارای هسته گرد با موقعیت مرکزی و یک یا دو هستک مشخص می‌باشند.

آنالیز آماری: به منظور مقایسه آماری، یافته‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS و آزمون آنالیز واریانس یکطرفه مورد تحلیل قرار گرفتند. یافته‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد و مقادیر 05/0p≤ معنی‌دار تلقی گردید.

نتایج

در بررسی هیستولوژیک گروه کنترل، اسپرماتوژنز فعال در لوله‌های سمینیفروس در مراحل مختلف همراه با اسپرم‌های بالغ یا در حال بلوغ مشاهده شد. در داخل لوله‌ها رده‌های مختلف سلول‌های اسپرماتوژنیک در مراحل مختلف تقسیم به همراه سلول‌های سرتولی دیده شدند. در این لوله‌ها اپیتلیوم ژرمینال از ضخامت قابل توجهی برخوردار و سر حد مجاری لوله منظم بود. همچنین در بافت بینابینی تجمعاتی از سلول‌های لیدیگ به همراه عروق و سایر سلول‌های همبندی مشهود بود (شکل 2). در گروهی که به میزان mg/kg 5 بوسولفان دریافت نموده بودند مشخصات هیستولوژی مشابه گروه کنترل و دارای اسپرماتوژنز فعال بودند و تفاوت خاصی از نظر مورفولوژی با گروه کنترل و مشاهده نداشت و شمارش سلولی نیز در این گروه تفاوت خاصی در تعداد سلول‌های ژرمینال و سوماتیک در مقایسه با کنترل مشاهده نگردید (جدول 1).

در حالیکه در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40و20و10 بوسولفان، درجات متفاوتی از تخریب لوله‌های سمینیفروس، دژنره شدن سلول‌های ژرمینال و ناپدید شدن اسپرم‌های بالغ و اکثر سلول‌های اسپرماتوگونی دیده شد. هسته سایر سلول‌های موجود نیز به صورت پیکنوتیک یا قطره‌ای مشاهده گردید و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال به طور مشخصی کاهش داشت. ضمن این که در ضخامت آن، واکوئل‌های بزرگی (جای خالی سلول‌های ژرمینال از بین رفته) دیده شد. حاشیه مجاری لومن نامنظم بود. همچنین مورفولوژی سلول‌های سرتولی به نظر نامنظم‌تر می‌رسید. با افزایش دوز دارو تغییرات هیستوپاتولوژیک افزایش می‌یافت که این تغییرات در گروه تحت درمان با mg/kg40 در میزان حداکثر بود. در این گروه در بسیاری از لوله‌ها عمدتاً سلول سرتولی وجود داشت و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال بسیار کاهش یافته بود. ضمناً در گروه تحت درمان با mg/kg 40 تعداد دو حیوان در طی مطالعه در روزهای 19 و30 از شروع درمان از بین رفتند و از مطالعه خارج شدند (شکل 3). در گروه‌های ذکر شده در بافت بینابینی تفاوت قابل ملاحظه مورفولوژیکی در مقایسه با گروه کنترل دیده نشد؛ ولی تعداد سلول‌های بافت بینابینی در گروه تحت درمان با mg/kg 40 بیشتر بود. در مطالعه کمی در گروه تحت درمان با mg/kg10، به جز سلول‌های اسپرماتوگونی سایر سلول‌های ژرمینال کاهش معنی‌داری داشتند. تعداد تمامی سلول‌های ژرمینال در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40 و20 در مقایسه با کنترل کاهش معنی‌داری نشان داد )001/0(p<. تعداد سلول‌های لیدیگ در گروه‌های تحت درمان با mg/kg 20و10و5 در مقایسه با کنترل تغییر نداشت؛ در حالی که در گروه تحت درمان با mg/kg40، تعداد سلول‌های لیدیگ به طور معنی‌داری افزایش داشت (01/0p<)، ضمن اینکه هیچ‌گونه تفاوتی در تعداد سلول‌های سرتولی در هیچ یک از گروهها دیده نمی‌شد (جدول 2).

براساس یافته‌های مورفومتریک که در جدول 2 خلاصة آنها ارائه شده است، در گروه تحت درمان با mg/kg 5 تفاوت خاصی در اندازه‌ اقطار لوله‌ها مشاهده نگردید (البته لازم به ذکر است حجم پارامترهای بیضه در این گروه ارزیابی نشد)؛ در حالیکه میانگین قطر لوله‌ها و ضخامت اپی‌تلیوم در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40، 20 و10 به طور معنی‌داری کاهش نشان می‌داد و این کاهش با افزایش دوز افزایش می‌یافت )001/0(p<. به عبارت دیگر یافته‌های مورفومتریک موید یافته‌های مورفولوژیک بود.

همچنین براساس یافته‌های حجمی که در جدول شمارة 3 خلاصه آنها ارائه شده است، حجم لوله‌های سمی‌نیفروس، حجم اپی‌تلیوم ژرمینال و دانسیته حجمی توبولها در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40، 20 و10 به صورت معنی‌داری کاهش یافته است؛ در حالی که حجم و دانسیته حجمی بافت بینابینی در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40 و20 افزایش معنی‌دار داشته است.

بحث

بوسولفان داروئی است که در کلینیک جهت درمان لوسمی و قبل از پیوند مغز استخوان در بیماران استفاده می‌شود (7،6 ). ضمن اینکه در آزمایشات تجربی جهت پیوند سلول‌های ژرمینال نیز استفاده می‌شود (12،11). در مطالعه حاضر جهت بررسی مطالعه کمی و حجم پارامترهای بیضه از نمونه‌برداری تصادفی ساده و یکنواخت و روش کاوالیری استفاده نمودیم که روش ساده و در عین حال کارآمد و قوی برای محاسبه حجم می‌باشد (29،28،18). امروزه مطالعات استریولوژیکی دارای اهمیت و کاربرد زیادی در مطالعه کمی پارامترهای مختلف بیضه هستند چرا که این مطالعات در عین این که ساده و دقیق هستند دارای فوایدی نیز هستند، از جمله اینکه 1) از آنجائیکه نمونه‌برداری در این مطالعات به صورت تصادفی و یکنواخت است بنابراین همه اجزای موجود در بیضه دارای شانس یکسانی برای نمونه‌برداری هستند. 2) در این روش نمونه‌برداری به صورت بدون سوگیری است چرا که هیچ گونه پیش فرض قبلی در مورد شکل اندازه و یا جهت قرارگیری سلول‌های موجود در بافت وجود ندارد (17،16).

نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که درمان با دوز پائین بوسولفان (mg/kg 5) تغییر خاصی از نظر مورفولوژیک و مورفومتریک در بیضه موش بالغ ایجاد نمی‌کند در حالیکه حیوانات تحت درمان با mg/kg 20،40 و 10 بوسولفان دچار اختلال اسپرماتوژنزو آزواسپرمی می‌شوند که این یافته‌ها با نتایج محققین دیگر مطابقت دارد (20،12،11) که این اثر ناشی از خاصیت آلکیله‌کنندگی DNA توسط این دارو بوده و مکانیسم اثر آن روی سلول‌هائی است که قدرت تکثیری زیادی دارند لذا بدیهی است که می‌تواند با تخریب شدید سلول‌های اسپرماتوگونی همراه باشد با تخریب سلول‌های اسپرماتوگونی تعداد کل سلول‌های ژرمینال و در نتیجه ضخامت اپیتلیوم لوله‌ها کاهش می‌یابد. در مطالعه حاضر در گروه تحت درمان با mg/kg 10 علیرغم این که تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی تغییری نیافت ولی سایر سلول‌های ژرمینال به‌طور معنی‌داری کاهش یافتند که علت احتمالی آن توقف رشد سلولها در مرحله میوز I است و در نتیجه سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد و دراز دچار کاهش معنی‌دار شده‌اند. در گروه تحت درمان با mg/kg 5 هیچ‌گونه تغییر معنی‌داری در تعداد و مورفولوژی سلول‌های ژرمینال و بیضه ایجاد نشد. تجربه حاضر نشان داد که با افزایش دوز دارو میزان تخریب بافت و اختلالات اسپرماتوژنز شدیدتر می‌گردد. در مطالعه حاضر علیرغم این که تعداد کل سلول‌های ژرمینال کاهش یافت اما تعداد سلول‌های سرتولی تغییری نداشت که این موضوع معرف مقاومت این سلولها است که این یافته با مطالعات Aich وVecino مطابقت دارد (19،18). در این مطالعه مورفولوژی سلول‌های سرتولی با افزایش دوز بوسولفان بی‌نظمی بیشتری را نشان داد که احتمالاً ناشی از تغییرات مولکولی این سلولها در پاسخ به بوسولفان باشد (23). در تائید یافته فوق Bar-Shira Maymon و همکارانش در سال 2004 (31) نشان دادند که میزان مارکر CK-18 در سلول‌های سرتولی به دنبال شیمی‌درمانی افزایش می‌یابد و این در حالی است که در اسپرماتوژنز طبیعی پس از بلوغ این مارکر در سلول‌های سرتولی حضور ندارد. بنابراین چنین استنباط می‌گردد که غیرفعال شدن سلول‌های سرتولی به دنبال شیمی درمانی ممکن است در اختلال اسپرماتوژنز و ناباروری نقش داشته باشد (23). سلول‌های سرتولی که 3% سلول‌های لوله سمی‌نیفروس بالغ را تشکیل می‌دهند تنها سلول‌های سوماتیک موجود در لوله‌ها هستند و در ارتباط نزدیک با سلول‌های ژرمینال یک محیط مناسب (Niche) برای اسپرماتوژنز را فراهم می‌سازند. این سلولها نقش بسیار مهمی در تکامل نسل سلول‌های ژرمینال و پشتیبانی از این سلولها و حفظ خاصیت عدم تمایز و پر استعداد بودن سلول‌های بنیادی اسپرماتوگنی را دارا هستند. بنابراین هرگونه تغییر در این سلولها می‌تواند منجر به اختلال و نقص اسپرماتوژنز گردد (32). به دنبال درمان با بوسولفان مهمترین عامل در تخریب سلول‌های اسپرماتوگونی و ژرمینال عدم توازن بین تکثیر سلولی و آپوپتوژنز است. به عبارت دیگر احتمالاً بوسولفان باعث القاء آپوپتوژنز در روند اسپرماتوژنز می‌شود که یافته‌های Choi و همکارانش در سال 2004 مؤید این مطلب است (33). همچنین براساس یافته‌های مطالعات دیگر در درمان با داروی سیس پلاتین و‍ سیکلو فسفاماید از گروه داروهای ضد سرطان باعث القاء آپوپتوزیز در لوله سمی‌نیفروس می‌شود (35،34). در مطالعة حاضر تعداد سلول‌های لیدیگ در گروه‌های تحت درمان با mg/kg 20، 10 و5 تغییری نداشت که با مطالعه Aich مشابهت دارد (22). Boujrad در سال 1995 و Janes در سال 1985 عنوان نمودند که تجویز بوسولفان در دوره جنینی و نوزادی باعث کاهش سلول‌های سرتولی و نیز لیدیگ می‌شود (10،9). در مطالعه حاضر عدم تغییر در تعداد سلول‌های لیدیگ در دوز mg/kg 20-5 و افزایش شدید در دوز mg/kg 40 را می‌توان اینگونه توجیه کرد که اثرات تخریبی بوسولفان بر سلول‌های لیدیگ با افزایش دوز بیشتر می‌شود. در دوزهای پائین اثرات تخریبی کم یا در حدی نیست که بر تعداد این سلولها تاثیر بگذارد و در تأیید یافته‌های حاضر، استفاده Aich از دوز پایین این دارو mg/kg 10 و مشاهده نتایج مشابه قابل ذکر است (19). در مطالعه Boujard و Janes تجویز بوسولفان در دوره جنینی و نوزادی انجام شد و مشاهده گردید که این یافته‌ها احتمالاً ناشی از حساسیت متفاوت داروهای فوق در این مرحله است.

با توجه به موارد فوق احتمالاً سن حیوان، غلظت و دوز دارو در میزان وشدت تخریب بافت و سلول مؤثر می‌باشد.

براساس مطالعات انجام شده در رت، اولین رده سلول‌های لیدیگ در بیضه در طی روز 15 جنینی از سلول‌های مزانشیمی موجود در بیضه منشاء می‌گیرد (36). بدیهی است که بوسولفان بتواند بر روی تکثیر و در نتیجه تمایز سلول‌های مزانشیمی به عنوان پیش‌ساز سلول لیدیگ اثر سوء گذاشته و باعث کاهش سلول‌های لیدیگ گردد. همچنین سلول‌های سرتولی که در دوره جنینی از اپی‌تلیوم سلوم منشاء می‌گیرند در موشها از روز 16 جنینی تکثیر یافته و به حداکثر تعداد خود در 2 روز قبل از تولد می‌رسد ضمن اینکه تا 2 هفته پس از تولد نیز این سلولها افزایش می‌یابند و سپس در طول دوره زندگی تعداد آنها ثابت می‌ماند (36). با توجه به اینکه بوسولفان دارای خاصیت الکیله‌کنندگی بوده و برروی سلول‌های با قدرت میتوزی بالا اثر می‌گذارد بدیهی است که تجویز بوسولفان در دوره جنینی و نوزادی بتواند هم با کاهش سلول‌های لیدیگ و هم سرتولی همراه باشد. اما در مطالعة حاضر تعداد سلول‌های لیدیگ پس از mg/kg 40 افزایش یافت که برای توجیه این مطلب می‌توان گفت با توجه با این که بین سلول‌های سوماتیک بیضه یعنی: لیدیگ؛ میوئید و سرتولی ارتباط عملکردی قوی وجود دارد (36). احتمالاً به دنبال درمان با دوز بالای بوسولفان mg/kg40 میزان تخریب سلول‌های ژرمینال، تغییر کارکرد سلول‌های سوماتیک و همچنین تغییرات سطوح هورمونی FSH, LH؛ آندروژن و همچنین سایر فاکتورهای مترشحه توسط این سلولها در سطح وسیعتری انجام گرفته است و مجموعه این عوامل با مکانیسم ناشناخته توانسته است منجر به افزایش تعداد سلول‌های لیدیگ به صورت یک پاسخ جبرانی گردد.

در این راستا تمایز سلول‌های دوکی شکل موجود در بافت بینابینی به سلول لیدیگ نیز گزارش شده است (37). یافته‌های مطالعة حاضر با برخی مطالعات دیگر چون کمبود ویتامین A، اشعه X، کریپتو‌رکیدیسم، بسته شدن مجرای انتقال اسپرم از بیضه، گرما و درمان تانگستیت در موش‌های دیابتیک با افزایش تعداد سلول‌های لیدیگ در بزرگسالی همراه می‌باشد (41-38).

براساس یافته‌های Howell به دنبال شیمی درمانی تخریب اپی‌تلیوم ژرمینال به طور غیرمستقیم بر روی کارکرد سلول‌های لیدیگ اثر می‌گذارد (42) که در مطالعه حاضر نیز سلول‌های ژرمینال دچار تخریب شدند.

Boujrad در سال 1995 و Howell در سال 2001 نشان داده‌اند که درمان با بوسولفان مقادیر گنادوتروپین‌های LH و FSH را افزایش می‌دهد؛ هرچند مکانیسم آن شناخته نشده است. به هر حال، ولی براساس مطالعات انجام شده هورمون LH باعث القاء تمایز سلول‌های لیدیگ شده و به عنوان اصلی‌ترین محرک برای شروع تکامل سلول‌های لیدیگ، هم در دوره بزرگسالی و هم قبل از بلوغ می‌باشد (37) ضمن این که در موارد تجربی افزایش هورمون LH تعداد سلول‌های لیدیگ نیز افزایش می‌یابد (41- 38). در این بررسی حجم بیضه، لوله‌های سمی‌نیفروس، اپی‌تلیوم ژرمینال، دانسیته حجمی توبولها و میانگین قطر لوله سمی‌نیفروس در گروه‌های تحت درمان با دوزهای mg/kg 40،20 و10 آزمایش به صورت معنی‌داری کاهش یافتند. به عبارت دیگر نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که همزمان با کاهش سلول‌های ژرمینال و اپیتلیوم ژرمینال حجم بیضه، توبولها و دانسیته حجمی توبولها نیز کاهش می‌یابد، ضمن این که تعداد سلول‌های سرتولی در این بررسی تغییری نکرد. به عبارت دیگر شاید بتوان گفت که حجم بیضه و توبول‌های سمینی‌فروس در موش، وابسته به تعداد سلول‌های ژرمینال می‌باشد. ضمن این که Zhengwei و همکارانش در سال 1997 نشان دادند که در پریماتها نیز ارتباط مستقیمی بین حجم بیضه و تعداد سلول‌های ژرمینال وجود دارد (43). در مطالعة حاضر همزمان با کاهش پارامترهای فوق الذکر حجم و دانسیته حجمی بافت بینابینی در گروه آزمایش تحت درمان با دوزهای mg/kg 40و20 افزایش نشان داد که احتمالاً ناشی از تغییرات ادمی بافت بیضه به دنبال افزایش نفوذپذیری عروق خونی به دنبال اختلال در اسپرماتوژنز می‌باشد (36،23) تغییر در حجم و بافت بینابینی بیضه و اختلالات اسپرماتوژنز ناشی از آن در برخی تحقیقات دیگر نیز به دنبال هورمون درمانی و کریپتوارکیدیسم گزارش شده است (44،37،16). ضمن اینکه Ballester و Tan نشان دادند که افزایش حجم بافت بینابینی بیضه می‌تواند یک واکنش جبرانی به دنبال کاهش حجم بیضه باشد (45،41).

بررسی کمی تعداد سلولهای اقطار توبولها و حجم بیضه و سایر پارامترهای آن می‌تواند کمک موثری در درک بهتر فرایند اسپرماتوژنز باشد، ضمن این که با این روشها می‌توان ارتباط بین یافته‌های کمی، علائم فیزیولوژیک و بالینی را در مورد کارکرد بیضه بدست آورد (46). از طرف دیگر بررسی حجم بیضه و یا توبول‌های آن نه تنها برای تعیین حجم پارامتر مورد نظر و تفسیر کارکرد پاتولوژی بیضه اهمیت دارد بلکه حجم خود به عنوان یک کمیت حد واسط برای تخمین مساحت مقطع، طول توبولها و یا سایر اجزاء موجود در بافت نیز کاربرد دارد، که در درک شروع و پیشرفت اختلالات اسپرماتوژنز و باروری حائز اهمیت است.

به عبارت دیگر تعیین حجم بیضه و توبول‌های آن شاخص مهمی در تشخیص بلوغ اسپرماتوژنز و پاتولوژی آن است (46،17).

نتیجه‌گیری

1- به‌طور خلاصه نتایج بررسی حاضر نشان داد که تجویز بوسولفان در دوز mg/kg 5 منجر به تغییرات کمی و یا کیفی بیضه موش بالغ نمی‌شود.

2– تجویز بوسولفان در دوزهای mg/kg 40 و20 و10 با تخریب اسپرماتوژنز و لوله‌های سمی‌نیفروس و کاهش عمده پارامترهای لوله سمی‌نیفروس و بیضه (شمارش سلولی، هیستومتری وحجم) همراست و در دوز mg/kg40 این اثرات شدیدتر است.

3– تجویز بوسولفان چه در دوزهای پائین و چه دوز بالاتر تأثیری بر شمارش سول‌های سرتولی موش بالغ ندارد.

4– تجویز بوسولفان در دوز mg/kg 40 با مکانیسم ناشناخته‌ائی منجر به افزایش سلول‌های لیدیگ در بافت بینابینی می‌شود و این در حالی است که در دوز پائین‌تر فاقد این اثرات هستند.

5- بررسی ما همچنین نشان داد که نتایج کمی و کیفی حاصل از اثرات بوسولفان بر بیضه با یکدیگر همخوانی دارند و می‌توان از مورفومتری به عنوان روشی کارآمد و دقیق در تعیین تغییرات بافت بیضه به خصوص در آسیب‌شناسی بالینی و مدل‌های تجربی به عنوان یک روش مؤثر در تشخیص و پیش‌آگهی اختلالات اسپرماتوژنز و شرایط باروری استفاده نمود.

بنابراین جهت جلوگیری از تخریب بیضه در بیماران تحت مداوا با این دارو می‌بایستی با احتیاط بیشتری تجویز شود.

بدین ترتیب بررسی تغییرات فراساختاری سلول‌های سوماتیک بیضه (سرتولی‌ـ لیدیگ و میوئید).

همچنین تغییرات هورمونی FSH,LH و تستوسترون از جمله مواردی است که در مطالعات آینده پیشنهاد می‌شود. ضمناً با توجه به این که دوز mg/kg 40 بوسولفان با مرگ و میر در موشها همراه می‌باشد لذا دوز mg/kg 20 به‌عنوان دوز مناسب جهت استفاده از آزمایشات تجربی و یا پیوند سلول‌های ژرمینال در موش NMRI توصیه می‌گردد.

تشکر و قدردانی

با سپاس از معاونت محترم پژوهشی و مرکز تحقیقات کاربردی داروئی دانشگاه علوم پزشکی تبریز که هزینه‌ها و امکان انجام این تحقیق را تأمین نمودند.

  1. Nudell D.M., Monoski M.M., Hipshultz L.I. Common medications and drugs: how they affect male fertility.Urol Clin North Am.2002;29(4):965-73.
  2. Howell S.J., Shalet S.M. Spermatogenesis after cancer treatment: damage and recovery. J Natl Cancer Inst Monogr.2005;(34):12-17.
  3. Puscheck E., Philip P.A., Jeyendran R.S., Male fertility preservation and cancer treatment. Cancer Treat Rev. 2004;30(2):173-180.
  4. Shetty G., Meistrich M.L. Hormonal approaches to pre-servation and restoration of male fertility after cancer treatment. J Natl cancer Inst Monogr.2005; (34):36-9.
  5. Silber S.J., Rodriguez- Rigau L.P. Quantitative analysis of testicle biopsy: determination of partial obstruction and prediction of sperm count after surgery for obstru-ction. Fertril Steril.1981;36:480.
  6. Anderson P.h.O., Knoben J.E., Troutman W.G. Hand-book of clinical data. Mc Graw Hill.10th Edition.2002; pp:136-140.
  7. Trevor A.J., Katzung B.G., Masters S.B. A long medical book Katzung & Trevors Pharmacology exa-mination and board review. Mc Graw Hill.2002;6th Edition.pp:206-8.
  8. Molenaar R., de Rooij D.G., Rommerts F.F, Reuvers P. J., van der Molen H.J. Specific destruction of Leydig cells in mature rats after in vivo administration of ethane dimethyl sulfonate. Biol Reprod.1985;33(5): 1213-22.
  9. Boujrad N., Hochereau-de Riviers M.T., Kamtchouing P., Perreau C., Carreau S. Evolution of somatic and germ cell populations after busulfan treatment in utero or neonatal cryptorchidism in the rat. Andrologia. 1995;27(4):223-8.
  10. Jansz G.F., Pomerantz D.K. The effect of prenatal treatment with busulfan on in vitro androgen produc-tion by testes from rats of various ages. Can J Physiol Pharmacol.1985;63(9):1155-8.
  11. Brinster R.L., Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial trans-plantation Proc Natl Acad Sci USA.1994;91:11303-7.
  12. Honaramooz A., Behboodi E., Hausler C.L., Blash S., Ayres S., et al. Depletion of endogenous germ cells in male pigs and goats in preparation for germ cell trans-plantation. J Androl. 2005;26(6):698-705.
  13. De Sanctis V., Galimberti M., Lucarelli G., Polchi P., Ruggiero L., Vullo C.Gonadal function after allogenic bone marrow transplantation for thalassaemia. Arch Dis Child.1991;66(4):517-20.
  14. Grigg A.P., McLachlan R., Zaja J., Szer J. Reproduc-tive status in long-term bone marrow transplant survi-vors receiving busulfan-cyclophosphamide (120mg/kg) Bone Marrow Transplant.2000;26(10):1089-95.
  15. Afify Z., Shaw P.J., Clavano-Harding A., Cowell C.T. Growth and endocrine function in children with acute myeloid leukaemia after bone marrow transplantation using busulfan/ cyclophosphamide. Bone Marrow Transplant.2000;25(10):1087-1092.
  16. Yang Z.W., Guo Y., Lin L., Wang X.H., Tong J.S., Zhang G.Y. Quantitative (stereological) study of in-complete spermatogenic suppression induced by testos-terone undecanoate injection in rats. Asian J Androl. 2004;6(4):291-7.
  17. Osinubi A.A., Noronha C.C., Okanlawon A.O., Mor-phometric and stereological assessment of the effects of long-term administration of quinine on the morpho-loyg of rat testis. West Afr J Med.2005;24(3):200-5.
  18. Vecino P., Uranga J.A., Arechaga J. Suppression of spermatogenesis for cell transplantation in adult mice. Protoplasma.2001;217(4):191-8.
  19. Aich S., Manna C.K. Histophysiological changes of the testicular tissue due to busulphan administration in the wild Indian house rat. Acta Biol Hung.2001;52 (1):105-16.
  20. Haddad S., Carvalho T.L., Anselmo-Franci J.A., Pete-nusci S.O., Favaretto A.L. Ultrasound stimulation of rat testes damaged by busulfan. Ultrasound Med Biol. 1997;23(9):1421-25.
  21. Bucci L.R., Meistrich M.L. Effects of busulfan on murine spermatogenesis: cytotoxicity, sterility, sperm abnormalities, and dominant lethal mutations. Mutat Res.1987;176(2):259-68.
  22. Mandarim-de-Lacerda C.A. Stereological tools in bio-medical research. An Acad Bras Cienc.2003;75(4):469 -86.
  23. Udagawa K., Ogawa T., Watanabe T., Yumura Y., Takeda M., Hosaka M. GnRH analog, leuprorelin acetate, promotes regeneration of rat spermatogenesis after severe chemical damage. Int J Urol.2001;8(11): 615-22.
  24. Jiang F.X. Behavior of spermatogonia following reco-very from busulfan treatment in the rat. Anat Embryol (Berl).1998;198(1):53-61.
  25. Adler I.D. Comparison of the duration of spermato-genesis between male rodents and humans. Mutar Res. 1996;352(1-2):169-72.
  26. Cheng Yan C., Mruck D.D. Cell junction dynamic in the testis: sertoli-germ cell interaction and male contra-ceptive development. Physiol Rev.2002;82:825-874.
  27. Costa D.S., Paula T.A., Matta S.L. The intertubular compartment morphometry in capybaras (Hydrochoe-rus hydrochaeris) testis. Anim Reprod Sci.2006;91(1-2):173-9.
  28. Tae H.J., Jang B.G., Ahn D.C., Choi E.Y., Kang H.S., et al. Morphometric studies on the testis of Korean ring-necked pheasant (Phasianus colchicus karpowi) during the breeding and non-breeding seasons. Vet Res Commun.2005;29(7):629-43.
  29. Gunderson H.J., Bagger P., Bendtsen T.F., Evans S. M, Korbo L., et al. The new stereological tools: disec-tor, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS.1988;96(10):857-81.
  30. Hess R.A. Spermatogenesis overview, encyclopedia of reproduction.1999;(4):Academic press University f Illinois at Urbana.pp:534-45.
  31. Bar-Shira Maymon B., Yogev L., Marks A., Hauser R., Botchan A., Yavets H. Sertoli cell inactivation da-mage to the human testis after cancer chemotherapy. Fertil Stril.2004:81(5):1391-1394.
  32. Shinohara T., Orwig K.E., Avarbock M.R., Brinster R.L., Restoration of spermatogenesis in infertile mice by sertoli cell transplantation. Biol Reprod.2003;68(3): 1064-71.
  33. Choi Y.J., Ok D.W., Kwon D.N., Chung J.I., Kim H.C., et al. Murine male germ cell apoptosis induced by busulfan treatment correleates with loss of c-kit-expression in a Fas/FasL-and P53-independent manner. FEBS Lett.2004;575(1-3):41-51.
  34. Sawhney P., Gimmona C.J., Meistrich M.L., Richburg J.H. Cisplatin- induced long-term failure of spermato-genesis in adult C57/Bl/6J Mice. J Androl.2005;26(1): 136-45.
  35. Cai L., Hales B.F., Robaire B. Induction of apoptosis in the germ cells of adult male rats after exposure to cyclophosphamide. Biol Reprod.1997;56(6):1490-7.
  36. O Donell L., Robertson K.M., Jones M.E., Simpson E.R. Estrogen and spermatogenesis.2001;22(3):289-318.
  37. Siril Ariyaratne H.B., Ian Mason J., Mendis- Handagama S.M. Effects of thyroid and luteinizing hormones on the onset of precursor cell differentiation into leydig progenitor cells in the prepubertal rat testis. Biol Reprod.2000;63(3):898-904.
  38. Benton L., Shan L.X., Hardy M.P., Differentiation of adult Leydig cells. J Steroid Biochem Mol Biol.1995; 53(1-6):61-8.
  39. Mendis- Mandagama S.M.L., Risbridger G.P., de Kretser D.M. Morphometric analysis of the compo-nents of the neonatal and the adult rat testis intersti-tium. Int J Androl.1987;10:525-534.
  40. Qin D.N., Lung M.A. Morphometric study on leydig cells in capsulotomized testis of rats. Asian J Androl. 2002;4(1):49-53.
  41. Ballester J., Dominguez J., Munoz M.C., Sensat M., Rigau T., et al. Tungstate treatment improves Leydig cell function in streptozotocin- diabetic rats. J Androl. 2005;26(6):706-15.
  42. Howell S.J., Shalet S.M. Testicular function following chemotherapy. Hum Reprod Update.2001;7(4):363-9.
  43. Zhengwei Y., McLachlan R.I., Bremner W.J., Wre-ford N.G. Quantitative (stereological) study of the nor-mal spermatogenesis in the adult monkey (Macaca fa-scicularis). J Androl.1997;18(6):681-7.
  44. Meistrich M.L., Wilson G., Huhtaniemi I. Hormonal treatment after cytotoxic therapy stimulates recovery of spermatogenesis, Cancer Res.1999;59(15):3557-60.
  45. Tan K.A., Walker M., Morris K., Greig I., Mason J.I., Sharpe R.M. Infant feeding with soy formula milk: effects of puberty progression, reproductive function and testicular cell numbers in marmoset monkeys in adulthood. Hum Reprod.2006;21(4):896-904.
  46. Petersen P.M., Giwercman A., Gundersen H.J., Pak-kenberg B. Efficient and unbiased tools for quantitating laydig and sertoli cells in testes from testes biobsies. Image Anal Stereol.2000;19:113-117.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 7, Issue 1
Spring 2006
Pages 25-36