Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

The expression profile of indolamine 2,3-dioxygenase in murine endometrium during estrous cycle

Authors
Narges Abbasi 1
Amir Hassan Zarnani 2
Pouneh Dokouhaki 3
Jamileh Ghasemi 4
Abdolamir Feyzi 5
Mohammad Mehdi Akhondi 4
Mahmood Jeddi-Tehrani 3
1 Faculty of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran; Department of Immunology, Faculty of Medicine, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
4 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
5 Department of Pathology, Faculty of Medicine, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
Abstract
Introduction: Activation of Indolamine 2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme responsible for tryptophan catabolism, has been reported to be a necessary requirement to achieve immunological tolerance against the fetus and protection against intracellular and extracellular pathogens. The objective of this study was to evaluate the expression of IDO gene in murine endometrium and its expression rate in different phases of estrous cycle. Noticing the role of this enzyme especially in the survival of a semi-antigenic embryo, the results of this study may be used as a basis for practical studies on the immunologic bases of recurrent abortions.Materials & Methods: In this experimental study, we studied the expression of IDO in the female BALB/c mice endometrium during four stages of estrous cycle .The phases of estrous cycle were determined by examining vaginal cytology .At each phase, endometrium was pealed away and the relative expression of IDO mRNA was detected by semi-quantitative RT-PCR using specific primers to IDO and mGAPDH as a housekeeping gene. The specificity of reaction was confirmed by enzymatic digestion of amplicon which yielded to 138bp and 259bp fragments .Results: Our results showed, for the first time, that IDO is expressed in the endometrium of cycling mice during all stages of estrous cycle. The expression of IDO was highest at estrus and lowest at diestrus (p < .001). Conclusion: Expression of IDO in endometrium during all phases of estrous cycle reveals that this enzyme as an effective arm of innate immune system may serve a role in protecting the female reproductive tract against ascending infections. Also regarding the fact that, mating only occurs at estrus phase, the high expression of IDO in this phase, may act as the main mechanism in inducing immunological tolerance to the fetus.
Keywords
Endometrium
Estrous cycle
Immunological tolerance
Indolamine 2,3- dioxygenase
Mice
Recurrent abortion

زمینه و هدف

یکی از مکانیسم‌هایی که اخیراً از سوی بسیاری از محققین در مورد موفقیت بارداری و تحمل ایمونولوژیک مادر در برابر جنین نیمه بیگانه مورد توجه قرار گرفته است، بیان ژن آنزیم ایندول آمین 2و3 دی اکسیژناز (IDO) در سطح تماس مادر- جنین می‌باشد (4-1). آنزیم IDO، تریپتوفان را کاتالیز کرده و آن را به N- فورمیل کینورنین و سپس کینورنین تبدیل می‌کند (5). IDO از طریق کاتابولیسم تریپتوفان، موجب کاهش سطح این اسید آمینه شده و در نتیجه تکثیر لنفوسیت‌های T‌ که وابسته به حضور تریپتوفان می‌باشد مهار می‌شود. از طرف دیگر متابولیت‌های تریپتوفان نیز در مهار تکثیر لنفوسیت‌های T نقش دارند (6). نشان داده شده است که در حضور IDO‌ لنفوسیت‌های T‌ قادر به گذر از ابتدایی‌ترین فاز سیکل تقسیم سلولی نمی‌باشند (7). علاوه بر آن میزان آپوپتوز سلول‌های T‌ نیز در حضور IDO افزایش می‌یابد (8).

اینترفرون گاما (IFNγ) قوی‌ترین محرک شناخته شده برای القا بیان IDO می‌باشد (9). شواهدی وجود دارد مبنی بر اینکه سلول‌های عرضه‌کننده آنتی‌ژن نظیر ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک از طریق تولید IDO تکثیر لنفوسیت‌های T‌ را مهار می‌کنند (10). مهار IDO توسط 1- متیل تریپتوفان از اثرات مهاری سلول‌های عرضه‌کننده آنتی‌ژن بر روی لنفوسیت‌های T ممانعت می‌کند (11). ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک منبع اصلی بیان IDO هستند (12،11). سلول‌های دندریتیک طحال موش IDO را بیان می‌کنند. اگرچه هر دو زیرردة لنفوئیدی و میلوئیدی سلول‌های دندریتیک آنزیم IDO را بیان می‌کنند؛ ولی فقط شکل فعال این آنزیم در ردة لنفوئیدی (CD11c+CD8α+) بیان می‌شود (13). سلول‌های بیان کننده IDO در بسیاری از مکان‌های امن سیستم ایمنی نظیر تیموس، اپیدیدیم، جفت و اتاقک قدامی چشم وجود دارند (17-14). بنابراین به نظر می‌رسد که این سلولها مسئول القاء تحمل ایمونولوژیک در مکان‌های فوق‌الذکر باشند. مطالعات Munn و Mellor راه‌گشای اولیه نقش IDO در ایمونولوژی بارداری بود. آنها نشان دادند که IDO در موش‌های باردار آلوژنیک از روز 5/7 تا 5/9 بارداری در سطح تماس مادر و جنین بیان شده و تزریق مهارکننده IDO یعنی 1– متیل تریپتوفان به موش‌های باردار سبب سقط تمام جنینها می‌شود (1). بنابراین به نظر می‌رسد که IDO یکی از مکانیزم‌های اصلی بقاء جنین نیمه بیگانه باشد. اساس بارداری در جوندگانی نظیر موش، سیکل استروس می‌باشد؛ چرا که جفت‌گیری و بارداری متعاقب آن فقط در فاز استروس (و نه سایر فازها) اتفاق می‌افتد. با توجه به این مهم و نقش مهارکنندگی ایمنی آنزیم IDO‌، این انتظار وجود دارد که بیان IDO در فازهای مختلف سیکل استروس متفاوت باشد. به همین منظور در این پژوهش بیان آنزیم IDO در فازهای مختلف سیکل استروس به روش RT-PCR نیمه کمی مورد ارزیابی قرار گرفت.

روش بررسی

1– حیوانات مورد مطالعه: موش‌های همخون ماده نژادBALB/C با سن 12– 8 هفته از انستیتو پاستور ایران خریداری و در شرایط بهداشتی مناسب و شرایط نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی بدون محدودیت غذایی نگهداری شدند. کلیه آزمایشات تجربی انجام شده در این پژوهش توسط کمیته اخلاق پزشکی در پژوهشکدة فن‌آوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا تأیید گردید.

2- تعیین فازهای سیکل استروس: مراحل سیکل استروس برای هر موش با بررسی اسمیر واژینال تعیین شد. برای این کار حدود l20 از PBS برای شستشوی آرام واژن با بکارگیری یک سمپلر مورد استفاده قرار گرفت و یک اسمیر مرطوب تهیه گردید. مراحل سیکل استروس با توجه به نسبتها و مورفولوژی لوکوسیتها و سلول‌های اپی‌تلیال موجود در اسمیر با بزرگنمایی  400 میکروسکوپ نوری تعیین شد. هر حیوان براساس سیتولوژی اسمیر واژینال در یکی از چهار فاز پرواستروس، استروس، مت استروس و دی استروس طبقه‌بندی شد. برخی از اسمیرها نیز با روش پاپانیکلا رنگ‌آمیزی گردید. موش‌هایی که دارای دو سیکل متوالی بودند، جهت بررسی‌های‌ بعدی انتخاب شدند.

3– تهیه نمونه بافت آندومتر: پس از تعیین فاز استروس، موشها کشته شدند و شاخ‌های رحمی آنها در شرایط استریل خارج گردید. سپس رحم با حجم زیاد بافر PBS شسته شد و توسط پنس و قیچی ریز از محور آنتی‌مزومتریال باز گردید. بافت آندومتر توسط تیغ اسکالپل به آرامی و با دقت تراشیده شد و قطعات بدست‌آمده بلافاصله در محلول RNA-Bee (Biosite, Sweden) جهت استخراج RNA منجمد گردید.

4– استخراج RNA از نمونه‌های بافت آندومتر: بافت موردنظر در محلول RNA-Bee توسط Pellet Pestel (Sigma, USA) یکنواخت گردید. سپس کلروفرم (Sigma, USA) با غلظت نهایی 10% (حجمی) به آن اضافه و به شدت تکان داده شد. میکروتیوب بعد از 5 دقیقه انکوبه شدن درون ظرف یخ، با دور g18000 به مدت 10 دقیقه در دمای صفر درجه سانتریفوژ گردید. فاز بالایی به آرامی با سمپلر جمع‌آوری شد و با حجم مساوی از ایزوپروپانل (Merck, Germany) مخلوط گردید. مخلوط حاصل به مدت حداقل یک ساعت درون فریزر قرار داده شد و بعد از گذشت این زمان مجدداً با همان شرایط قبلی سانتریفوژ گردید. محلول رویی با واژگون نمودن سریع میکروتیوب‌ خارج شد و تودة RNA در کف میکروتیوب باقی ‌ماند. برای شستشوی RNA و خارج شدن کامل ایزوپروپانل، ml1 اتانل 75% به آن افزوده شد و با دور g 18000 به مدت 20 دقیقه در دمای  C4 سانتریفیوژ گردید. اتانل باقیمانده نیز خارج شد و پس از خشک شدن تودة RNA، به آن l50-20 (با توجه به اندازة تودة RNA) آب مقطر استریل اضافه شد تا RNA در آن حل شود. سپس RNA استخراج شده تا زمان استفاده بعدی منجمد گردید.

5– تهیه cDNA از RNA استخراج شده: مخلوطی شامل l4 از(x5)(Fermentas, Lithuania) Reaction buffer ، l 3 از (mM5)mix dNTP (Roche, Switzerland)، l1 از (M 20) Random-Hexamer (GE, Sweden) و l1 از آنزیم رونویسی معکوس M-MuLV (Fermentas, Lithuania) تهیه گردید و حجم نهایی با آب مقطر استریل به l10 رسید. l10 از نمونة RNA‌ در دمای  C65 به مدت 7 دقیقه حرارت داده شد و بلافاصله روی یخ قرار گرفت. l10 از محلول فوق‌الذکر به میکروتیوب دارای نمونة RNA اضافه گردید و بعد از سانتریفوژ، در دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf, Germany) به مدت 1 ساعت در دمای  C42 قرار داده شد. سپس cDNA بدست آمده با آب مقطر استریل به میزان 2 به 7 رقیق و در فریزر در دمای  C20– قرار داده شد.

6– واکنش زنجیره‌ای پلیمر از (PCR) : ابتدا در دو میکروتیوب به صورت جداگانه مخلوطی از l5/2 بافر PCR x10(Roche,Switzerland)، l2 از (mM 25) MgCl2 (Roche,Switzerland)،l1(mM10)dNTP mix (Roche, Switzerland) وl2/0 آنزیم Taq DNA پلی‌مراز (Roche, Switzerland) تهیه گردید و به یکی از میکروتیوبها l1 از هر کدام از پرایمرهای Reverse و Forward ویژه آنزیم IDO (با غلظت M5) و به میکروتیوب دیگر l1 از پرایمرهای آنزیم mGAPDH (با غلظت M5) اضافه گردید و با آب مقطر استریل به حجم نهایی l24 رسانده شد. سپس l1 cDNA رقیق شده به هر یک از میکروتیوبها افزوده گردید. PCR در شرایط حرارتی  C94 به مدت 2 دقیقه و سپس در 40 سیکل  C94 به مدت 30 ثانیه،  C57 به مدت 30 ثانیه و  C72 به مدت 30 ثانیه و بدنبال آن C72 به مدت 7 دقیقه برای پرایمر IDO انجام گردید. جهت انجام PCR برای mGAPDH به صورت زیر عمل شد:  C94 به مدت 3 دقیقه، سپس در 30 سیکل  C94 به مدت 30 ثانیه،  C60 به مدت 30 ثانیه و  C72 به مدت 30 ثانیه و بدنبال آن،  C72 به مدت 7 دقیقه. ترادف پرایمرهای مورد استفاده برای IDO (ندای فن راه، ایران) و برای mGAPDH (CyberGene, Sweden) به شرح زیر بود:

7– القاء بیان ژن IDO در ماکروفاژهای صفاقی موش: به عنوان کنترل مثبت بیان ژن IDO، از ماکروفاژهای صفاقی موش و تیمار آنها با اینترفرون گاما (IFNγ) (Sigma, USA) استفاده شد. برای این کار پس از نخاعی کردن حیوان، ml5 از PBS استریل به ناحیه صفاقی تزریق و سلول‌های ناحیه جمع‌آوری گردید. سلول‌های بدست آمده در دو پلیت 15 × 60 در محیط کشت RPMI-1640 (Sigma, England) حاوی 10% سرم جنین گاوی (FCS) (Invitrogen, England) کشت داده شدند. بعد از دو ساعت سلول‌های غیرچسبان، با محیط RPMI گرم ( C37) شستشو گردیدند. خلوص سلول‌های ماکروفاژ با توجه به مرفولوژی آنها در زیر میکروسکوپ فاز کنتراست بررسی و حدود 80% برآورد گردید. سپس به یکی از پلیتها RPMI کامل و به پلیت دیگر RPMI کامل حاوی U/ml 1000 اینترفرون گاما اضافه شد. بعد از گذشت زمان 48 ساعت، سلولها توسط خراشگر جمع‌آوری و پس از شستشو، RNA از سلولها تهیه گردید و سپس cDNA از آنها تهیه شد و در پایان بیان ژن IDO با تکنیک PCR بررسی گردید.

8– تخلیص سلول‌های دندریتیک و القای بیان IDO در آنها: سلول‌های دندریتیک طحال موش به عنوان کنترل مثبت دوم بیان IDO مورد استفاده قرار گرفتند.

به همین منظور سلول‌های دندریتیک طحال موش با روشی که قبلاً توسط محققین مقاله حاضر منتشر شده است (17)، تخلیص گردید. به‌طور خلاصه، پس از نخاعی نمودن موشها، طحال آنها در شرایط استریل خارج شد. طحال با محلول کلاژناز D با غلظت mg/ml 5/0 (Roche, Germany) و DNaseI با غلظت g/ml30 (Roche, Germany) پرفیوز شدند. سوسپانسیون حاصل جمع‌آوری و در مجاورت یخ قرار داده شد. سپس طحال با قیچی به قطعات ریز خرد شد. هضم آنزیمی با محلول کلاژناز D با غلظت mg/ml 2/1 و DNase با غلظت g/ml 30 در انکوباتور CO2 به مدت 45-35 دقیقه انجام شد. بافت هضم شده از غربال فلزی عبور داده شد و سوسپانسیون سلولی حاصل با سلول‌های بدست آمده از مرحله قبل مخلوط گردید. مخلوط سلولی بدست آمده دوباره با PBS شسته شد و رسوب سلول با اپتی پرپ (Axis-Shield, Oslo, Norway) 15% (gr/ml 085/1=d) مخلوط گردید. روی مخلوط حاصل محلول اپتی‌پرپ 12% و سپس محلول CMF-HBSS به آرامی اضافه گردید. لوله‌ها به مدت 15 دقیقه با دور g600 سانتریفوژ شدند و سلول‌های کم‌چگال از حد فاصل محلول CMF-HBSS و اپتی‌پرپ 12% جمع‌آوری و دو بار با PBS حاوی EDTA mM 5 (Merck, Germany) در شرایط سرد شستشو و سلول‌های کم چگال در RPMI کامل حاوی 5% سرم جنین گاوی به مدت 2 ساعت کشت شدند. سپس سلول‌های غیرچسبان از طریق شستشو با RPMI گرم حذف گردیدند. به سلول‌های باقیمانده محیط RPMI گرم حاوی 10% سرم جنین گاوی اضافه گردید و انکوبه کردن به مدت 16 ساعت دیگر ادامه یافت. به برخی از پلیتها در طی کشت شبانه U/ml 1000 از IFNγ اضافه گردید. پس از پایان زمان کشت، سلول‌های غیرچسبان به آرامی جمع‌آوری و با PBS سرد شسته شدند. خلوص سلول‌های دندریتیک به روش فلوسیتومتری مطابق با روش گروه محققین حاضر و با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی ضد CD11c (17) ارزیابی گردید. در تمام آزمون‌های انجام شده، خلوص سلول‌های فوق‌الذکر بالاتر از 90% بود (شکل 4). استخراج RNA، سنتز cDNA و PCR روی سلول‌های فوق به روش مندرج در قسمت‌های قبلی انجام گردید.

9- الکتروفورز ژل آگارز ، اسکن ژلها و دانسیتومتری: پودر آگارز (USB, USA) براساس درصد ژل که 5/2% بود توزین شد و در بافر الکتروفورز (TAE) مخلوط و بوسیلة حرارت دادن، کاملاً حل گردید. پس از اضافه کردن محلول اتیدیوم بروماید (Roche, Germany) با غلظت mg/ml 1-5/0، با ریختن ژل در سینی قالب‌گیری ژل آگارز در زمان 15 دقیقه به صورت جامد درآمد و درون تانک الکتروفورز حاوی بافر قرار داده شد. از هر نمونه محصول PCR ژن‌های mGAPDH و IDO به مقدار l8 به طور همزمان به همراه l2 بافر لودینگ (x6) به هر چاهک اضافه و الکتروفورز با آمپر حداکثر و ولتاژ 80 ولت به مدت 1 ساعت انجام شد. باندهای حاصل تحت اشعة UV مشاهده و از آنها عکسبرداری شد. سپس، بوسیلة نرم‌افزار Lab works‌ (UVP, USA) دانسیته باندها و نسبت دانسیته باندهای IDO به mGAPDH بدست آمد.

10- هضم آنزیمی محصولات PCR ژن IDO: به منظور بررسی ویژگی واکنش PCR، هضم آنزیمی قطعه تکثیر یافته با استفاده از آنزیم PspOMI (SibEnzym, Russia) انجام شد. به این منظور مخلوطی از l3 SE Buffer Y x10 (SibEnzyme, Russia) و l3/0 آنزیم فوق با آب مقطر استریل به حجم نهایی l10 رسانیده شد. l20 از محصول PCR ژن IDO به این مخلوط اضافه گردید و حجم نهایی به l30 رسید و در دمای  C37 به مدت دو ساعت قرار داده شد. سپس محصولات هضم شده روی ژل آگارز 5/2% الکتروفورز شد و عکسبرداری گردید (شکل 2).

آزمون‌های آماری: نسبت دانسیته باند IDO به mGAPDH برای هر موش تعیین شد و سپس نسبت‌های بدست آمده از فازهای مختلف سیکل استروس با استفاده از آزمون غیر پارامتری Kruscall-Wallis مقایسه گردید. 05/0p< اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تهیه نمونه بافت آندومتر در فاز‌های مختلف سیکل استروس: براساس سیتولوژی اسمیر واژینال، موش‌های مورد مطالعه در یکی از چهار فاز استروس، پرواستروس، مت‌استروس و دی‌استروس قرار گرفتند. در فاز پرواستروس سلول‌های گرد بازال، به تعداد قابل توجه و تعداد محدودی از سلول‌های اپیتلیال چند وجهی و لکوسیت دیده شد. تمام سلول‌های موجود در فاز استروس سلول‌های اپیتلیال چند وجهی شاخی بودند. در فاز مت‌استروس علاوه بر سلول‌های مذکور، لکوسیتها نیز قابل مشاهده بودند. لکوسیتها عمدة سلول‌های فاز دی‌استروس را تشکیل می‌دادند. در این فاز همچنین تعداد معدودی از سلول‌های اپیتلیال شاخی و یا سلول‌های گرد بازال قابل ردیابی بودند.

مجموعاً 25 نمونه آندومتر موش‌های ماده BALB/C در فازهای مختلف سیکل استروس شامل 7 نمونه در فاز پرواستروس، 6 نمونه در فاز استروس، 5 نمونه در فاز مت‌استروس و 7 نمونه در فاز دی‌استروس از نظر بیان ژن IDO به روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند.

تکثیر ژن‌های IDO و mGAPDH با استفاده از PCR : انجام PCR با پرایمرهای ویژه IDO و mGAPDH به ترتیب منجر به تکثیر قطعات 397 و 309 جفت بازی شد (شکل 1).

جهت تأئید اینکه قطعه تکثیر یافته مربوط به IDO می‌باشد، هضم آنزیمی روی محصولات PCR مربوط به IDO انجام گرفت و سپس محصولات حاصل از هضم آنزیمی روی ژل آگارز 5/2% الکتروفورز گردید. با هضم آنزیمی روی IDO، دو قطعه 259 جفت‌باز و 138 جفت‌باز بدست آمد که مؤید ویژگی واکنش می‌باشد (شکل 2).

بیان IDO در ماکروفاژهای صفاقی و سلول‌های دندریتیک طحال موش: به عنوان کنترل مثبت، ماکروفاژهای صفاقی و سلول‌های دندریتیک طحال موش در طی ‌کشت شبانه با IFNγ به میزان U/ml 1000 تیمار شد. نتایج RT-PCR نشان داد که سلول‌های مذکور پس از تیمار با IFNγ سطح بالایی از IDO‌ را بیان می‌کنند؛ در حالی که سلول‌های دست‌نخورده آنزیم IDO را بیان نمی‌کردند (شکل 3).

بیان IDO‌ در فازهای مختلف سیکل استروس: جهت بررسی بیان نسبی IDO در آندومتر موش، روی هر نمونه از cDNA‌ بافت آندومتر مربوط به فازهای مختلف سیکل استروس با دو پرایمر IDO و mGAPDH بطور جداگانه PCR انجام گرفت. سپس محصولات PCR هر دو ژن همزمان با هم و به مقدار مساوی الکتروفورز گردید و با استفاده از نرم افزار Lab Works ‌بیان نسبی IDO در فازهای مختلف سیکل استروس از طریق مقایسه نسبت دانسیته IDO به mGAPDH بررسی شد. بررسی بیان نسبی ژن IDO در فازهای مختلف سیکل استروس نشان داد که اولاً آنزیم IDO در تمام فازها بیان می‌شود. ثانیاً بیان این آنزیم در فاز استروس به‌طور معنی داری نسبت به سایر فازها بیشتر است (001/0p<) (شکل 1).

میانگین بیان ژن IDO در فازهای مختلف سیکل استروس موش در جدول 1 نشان داده شده است. طبق داده‌ها، بیشترین بیان نسبی IDO در فاز استروس (112/0638/0) و کمترین مقدارآن مربوط به فاز دی استروس (016/0061/0) بود.

بحث

با توجه به اینکه جنین یک پیوند نیمه بیگانه است، سرکوب پاسخ‌های ایمنی مادر علیه آنتی‌ژن‌های جنین دور از ذهن نیست. بسیاری از مطالعات انجام شده صحت این نظریه را تأیید کرده‌اند (20- 18). مطالعات انجام شده در مورد چگونگی تعدیل یا سرکوب سیستم ایمنی مادر در طی بارداری نشان می‌دهد که مکانیزم‌های مختلفی در انجام این امر نقش دارند. یکی از مهمترین مکانیزم‌های عدم رد جنین، تولید فاکتورهای سرکوبگر ایمنی در موضع بارداری می‌باشد (21).

با توجه به نقش IDO در مهار پاسخ سلول‌های T (12) و بیان IDO بوسیلة سن‌سیشیوتروفوبلاستها (4،3) این امکان وجود دارد که بیان IDO در فصل مشترک مادری‌ـ جنینی در سرکوب پاسخ‌های ایمنی و نهایتاً بقای جنین نیمه بیگانه دخالت داشته باشد. Mellorو Munn نشان دادند که mRNA ژن IDO در دورة بارداری موش از روز 5/7 تا 5/9 بیان شده، اما بیان این آنزیم در روز 5/10 تا 5/13 بارداری به جفت محدود شد و در دسیدوا و یا جنین وجود ندارد (1). از آنجا که اساساً آنتی‌ژن‌های بیگانه پدری بوسیلة سلول‌های T مادری شناسایی می‌شوند یک رخداد مهم در حفظ جنین نیمه بیگانه، مهار عملکرد سلول‌های T مادری بوسیلة IDO‌ خواهد بود (22). Munn و Mellor نشان داده‌اند که تیمار کردن موش‌های باردار آلوژن در روز 4 بارداری با 1- متیل‌تریپتوفان که مهارکننده اختصاصی آنزیم IDO‌ می‌باشد، سبب سقط تمام جنینها می‌شود. در صورتی‌ که مهار IDO‌ در موش‌های باردار سینژنیک تأثیر سویی بر روند بارداری ندارد (1). این یافته‌ها بخوبی نشان می‌دهد که آنزیم IDO‌ در مهار پاسخ‌های تکثیری لنفوسیت‌های T‌ مادر علیه آنتی‌ژن‌های بیگانه پدری نقش اساسی دارد. این فرضیه در مطالعات بعدی Munn و با استفاده از موش‌های دارای نقص در ژن‌های RAG1 و RAG2 و موش‌های ترانس‌ژن مورد تأیید قرار گرفت. استفاده از موش‌هایی که دارای هاپلوتیپ MHC‌ یا کمپلکس اصلی سازگاری بافتی یکسان ولی آنتی‌ژن‌های سازگاری بافتی مینور متفاوت بودند، نشان داد که IDO نه تنها در مهار پاسخ‌های تکثیری لنفوسیت‌های T مادر علیه آنتی‌ژن‌های اصلی سازگاری بافتی بلکه در مهار پاسخ علیه آنتی‌ژن‌های مینور نقش دارد (24).

سیکل استروس در جوندگان رخدادی فیزیولوژی است که توسط عوامل مختلف و بویژه سطح تولید هورمون‌های جنسی استروژن و پروژسترون کنترل می‌شود. این سیکل در جوندگان تعیین کننده زمان جفت‌گیری است. برخلاف بسیاری از پستانداران که در آنها جفت‌گیری مستقل از سیکل ماهیانه می‌باشد، در جوندگانی نظیر موش و رت جفت‌گیری فقط در فاز استروس انجام می‌شود و در سایر فازهای سیکل معمولاً جفت‌گیری به وقوع نمی‌پیوندد. با توجه به اینکه جفت‌گیری در فاز مذکور با انزال اسپرم‌ و مواجهة سیستم ایمنی مادر با تعداد زیادی از آنتی‌ژن‌های بیگانه همراه است، منطقی است که تنظیم ایمنی در این فاز با مکانیزم‌های متفاوتی نسبت به سایر فازهای سیکل استروس انجام پذیرد. با توجه به نقش اساسی آنزیم IDO در مهار پاسخ‌های تکثیری لنفوسیت‌های T، در این مطالعه بیان ژن این آنزیم در آندومتر موش‌های BALB/C در فازهای مختلف سیکل استروس به روش RT- PCR نیمه کمی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که آنزیم IDO در تمام فازهای سیکل استروس بیان می‌شود. با توجه به اینکه IDO به عنوان یکی از ابزارهای سیستم ایمنی ذاتی نقش مهمی در جلوگیری از تکثیر ارگانیسم‌های درون سلولی و برون سلولی دارد (25)، بیان IDO در آندومتر طی فازهای مختلف سیکل استروس حاکی از نقش احتمالی این آنزیم به عنوان یکی از ابزارهای سیستم ایمنی ذاتی در حفاظت کانال تولید مثل در برابر عفونت می‌باشد. جالب توجه اینکه بیان این آنزیم در فاز استروس به طور معنی‌داری نسبت به سایر فازهای سیکل بیشتر بود (001/0p<). یافته اخیر می‌تواند توضیح مناسبی برای سرکوب سیستم ایمنی مادر در بارداری احتمالی بعد از جفت‌گیری باشد.

القاء پاسخ‌های مخرب سیستم ایمنی مادر علیه آنتی‌ژن‌های اسپرم می‌تواند با ناباروری و یا سقط جنین همراه باشد. از این رو تنظیم ایمنی در موضع بارداری از اهمیت ویژه‌ای برخوردار خواهد بود. از وقایع ایمونولوژیک فاز استروس، مهاجرت ترجیحی جمعیت خاصی از سلول‌های سیستم ایمنی به موضع آندومتر می‌باشد. مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان داده است که در فاز استروس تعداد ماکروفاژها در آندومتر موش به شدت افزایش می‌یابد. برعکس در فاز دی‌استروس، هنگامی که غلظت استروژن کاهش و پروژسترون افزایش پیدا می‌کند، فراوانی این سلولها بسیار کم شده و در طی فاز پرواستروس در سطح پائینی باقی می‌ماند (23).

مهاجرت ماکروفاژها به آندومتر در فاز استروس احتمالاً ناشی از تأثیر استروژن در آزاد شدن طیف وسیعی از فاکتورهای کموتاکتیک توسط سلول‌های اپی‌تلیال و استرومایی آندومتر می‌باشد (23). جالب توجه اینکه پس از شروع بارداری و به هنگام لانه‌گزینی تعداد ماکروفاژهای آندومتر باز هم افزایش می‌یابد. مطالعات انجام شده توسط زرنانی و همکاران (27) نشان داد که سلول‌های دندریتیک در تمام فازهای سیکل استروس موش حضور دارند و فراوانی نسبی این سلولها در فاز استروس به طور معنی‌داری بالاتر از سایر فازهای سیکل استروس می‌باشد.

در مورد سلول‌هایی که آنزیم IDO را در آندومتر بیان می‌کنند، اطلاعات جامعی در دسترس نیست.

در انسان نشان داده شده است که سلول‌های سن‌سی‌شیوتروفوبلاست و سلول‌های تروفوبلاست خارج ویلوسی این آنزیم را بیان می‌کنند (3). ولی سلول‌های عرضه‌کننده آنتی‌ژن شامل ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک مهمترین کاندیدای بیان IDO‌ در سطح تماس مادر- جنین می‌باشند. مطالعات انجام شده نشان داده است که ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک IDO‌ را به مقدار زیاد بیان می‌کنند (12،11). در این مطالعه نیز نشان داده شد که ماکروفاژهای صفاقی و سلول‌های دندریتیک طحالی موش پس از تحریک با IFNγ سطح بالایی از IDO را بیان می‌کنند. بنابراین به نظر می‌رسد که بالا بودن بیان نسبی IDO‌ در فاز استروس نسبت به سایر فازها مربوط به مهاجرت ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک به آندومتر باشد. این سلولها می‌توانند آنتی‌ژن‌های اسپرم و یا سایر آنتی‌ژن‌های بیگانه پدری را به لنفوسیت‌های T‌ مادر عرضه کرده و پس از تحریک آنها، بواسطة بیان IDO سبب القاء انرژی در این سلولها شوند.

نتیجه‌گیری

در مجموع با توجه به یافته‌های این پژوهش به نظر می‌رسد آنزیم ایندول‌ آمین 2 و3 دی ‌اکسیژناز در آندومتر موش طی فازهای مختلف سیکل استروس کاملاً‌ کنترل شده بیان می‌شود و بیان بالای آن در فاز استروس مؤید نقش حفاظتی این آنزیم در جلوگیری از القاء واکنش‌های ایمونولوژیک مضر علیه آنتی‌ژن‌های اسپرم می‌باشد. با توجه به توضیحات فوق به نظر می‌رسد که بر خلاف یافته Munn و Mellor (24) آنزیم IDO در روزهای بعد از جفت‌گیری نیز در دسیدوای موش‌های باردار بیان شود. نظریة اخیـر در حال حاضر توسط این گروه تحت بررسی می‌باشد.

تشکر و قدردانی

این مطالعه با اعتبار تخصیص یافته از سوی مرکز ملی تحقیقات علوم پزشکی کشور طی قرارداد شمارة 3356/ت/م‌م و حمایت‌های مالی پژوهشکده فناوری‌آوری‌های علوم پزشکی‌ـ ابن‌سینا انجام گرفته است. بدین‌وسیله از زحمات جناب آقای محمدرضا پازوکی که تایپ این مقاله را بر عهده گرفتند تشکر و قدردانی می‌گردد.

  1. Munn D.H., Zhou M., Attwood J.T., Bondarev I., Con-way S.J., Marshall B., et al. Prevention of allogeneic
  2. Suzuki S., Tone S., Takikawa O., Kubo T., Kohno I., Minatogawa Y. Expression of indoleamine 2,3-dioxy-
  3. Sedlmayr P., Blaschitz A., Wintersteiger R., Semlitsch M., Hammer A., MacKenzie C.R., et al. Localization of indoleamine 2,3-dioxygenase in human female reproductive organs and the placenta. Mol Hum Reprod. 2002;8(4):385-91
  4. Kudo Y., Boyd C.A. Human placental indoleamine 2,3-dioxygenase: cellular localization and characterization of an enzyme preventing fetal rejection. Biochim Biophys Acta. 2000;1500(1):119-24
  5. Taylor M.W., Feng G.S. Relationship between inter-feron-gamma, indoleamine 2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism. FASEB J. 1991;5(11):2516-22. Review
  6. Mellor A.L., Munn D.H. Extinguishing maternal immune responses during pregnancy: implications for immunosuppressionSemin Immunol.2001;13(4):213-8
  7. Frumento G., Rotondo R., Tonetti M., Ferrara G.B. T cell proliferation is blocked by indoleamine 2,3-dioxygenase. Transplant Proc. 2001;33(1-2):428-30
  8. Takikawa O., Habara-Ohkubo A., Yoshida R. IFN-gamma is the inducer of indoleamine 2,3-dioxygenase in allografted tumor cells undergoing rejection. J Immunol. 1990;145(4):1246-50
  9. Werner-Felmayer G., Werner E.R., Fuchs D., Hausen A., Reibnegger G., Wachter H. Characteristics of inter-feron induced tryptophan metabolism in human cells in vitro. Biochim Biophys Acta. 1989;1012 (2):140-7
  10. Fuchs D., Malkovsky M., Reibnegger G., Werner E.R., Forni G., Wachter H. Endogenous release of interferon gamma and diminished response of peripheral blood mononuclear cells to antigenic stimulation. Immunol Lett. 1989;23(2):103-8. Review
  11. Munn D.H., Shafizadeh E., Attwood J.T., Bondarev I., Pashine A., Mellor A.L. Inhibition of T cell prolifera-tion by macrophage tryptophan catabolism.J Exp Med. 1999;189(9):1363-72
  12. Hwu P., Du M.X., Lapointe R., Do M., Taylor M.W., Young H.A. Indoleamine 2,3-dioxygenase production by human dendritic cells results in the inhibition of T cell proliferation. J Immunol. 2000; 164(7):3596-9
  13. Fallarino F., Vacca C., Orabona C., Belladonna M.L., Bianchi R., Marshall B., et al. Functional expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by murine CD8 alpha (+) dendritic cells. Int Immunol. 2002;14(1):65-8
  14. Yoshida R., Urade Y., Nakata K., Watanabe Y., Haya-ishi O. Specific induction of indoleamine 2,3-dioxy-genase by bacterial lipopolysaccharide in the mouse lung. Arch Biochem Biophys. 1981;212(2):629-37
  15. Malina H.Z., Martin X.D. Indoleamine 2,3-dioxy-genase: antioxidant enzyme in the human eye. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1996;234(7):457-62
  16. Yamazaki F., Kuroiwa T., Takikawa O., Kido R. Human indolylamine 2,3-dioxygenase. Its tissue distri-bution, and characterization of the placental enzyme. Biochem J. 1985;230(3):635-8
  17. Zarnani A.H., Moazzeni S.M., Shokri F., Salehnia M., Dokouhaki P., Shojaeian J., et al. The efficient isola-tion of murine splenic dendritic cells and their cyto-chemical features. Histochem Cell Biol. 2006;126(2): 275-82
  18. Thellin O., Heinen E. Pregnancy and the immune system: between tolerance and rejection. Toxicology. 2003;185(3):179-84. Review
  19. مصفا نریمان، زرنانی امیر حسن، حسن زهیر محمد. ایمونولوزی حاملگی طبیعی. چاپ اول، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی‌ـ درمانی شهید بهشتی (1382)، فصل 6، صفحات: 181-164
  20. Heyborne K., Silver R.M. Immunology of postim-plantation pregnancy, In: Reproductive Immunolog, Bronson R. (Editors), Blakwell scientific publitions Ltd. 1996;pp:383-417
  21. Mellor A.L., Munn D.H. Tryptophan catabolism pre-vents maternal T cells from activating lethal anti-fetal immune responses. J Reprod Immunol. 2001;52(1-2): 5-13. Review
  22. Hunt J.S., Robertson S.A. Uterine macrophages and environmental programming for pregnancy success. J Reprod Immunol. 1996;32(1):1-25. Review
  23. Mellor A.L., Sivakumar J., Chandler P., Smith K., Molina H., Mao D., et al. Prevention of T cell-driven complement activation and inflammation by trypto-phan catabolism during pregnancy. Nat Immunol. 2001;2(1):64-8
  24. Zarnani A.H., Dokouhaki P., Tehrani M.J., Indole-amine 2,3-Dioxygenase and Immunological Tolerance during Pregnancy. Iranian J Immunol. 2004;1:143-153. Rewiew
  25. مصفا نریمان، زرنانی امیر حسن، حسن زهیر محمد، ایمونولوژی حاملگی طبیعی. چاپ اول، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی‌ـ درمانی شهید بهشتی (1382)، فصل 5، صفحات: 156-135
  26. Zarnani A.H., Moazzeni S.M., Shokri F., Salehnia M., Dokouhaki P., Shojaeian J., et al. Analysis of endo-metrial myeloid and lymphoid dendritic cells during mouse estrus cycle. J Reprod Immunol. 2006;71(1):28-40
  27. Erlebacher A. Why isn't the fetus rejected? Curr Opin Immunol. 2001;13(5):590-3.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 7, Issue 2
Summer 2006
Pages 91-100