Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Effects of leuprolide acetate on the ultrastructure of germ cells in adult male mice

Authors
Mohammad Amin Homafar 1
Jafar Soleimanirad 2
Ahmad Ali Ghanbari 3
Parvaneh Tabatabaei Nabavi 4
1 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Gilan University of Medical Sciences, Gilan, Iran
2 Drug applied research center, Tabriz University of Medical ٍSciences, Tabriz, Iran
3 Anatomy Department, Faculty of Medicine, Tabriz Medical Sciences University, Tabriz, Iran
4 Cellular & Molecular Research Center, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Gonadotropin hormones control spermatogenesis and any alteration in their level can influence the process and subsequently the number of germ cells. Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonists suppress the pituitary-gonadal axis. The objective of this study was to investigate the ultrastructural and histological alterations in spermatogenic and spermiogenic cells following administration of a single dose of leuprolide acetate, an analogue of gonadotropin-releasing hormones. Materials & Methods: This study was done on 24 adult male 8-old week mice were used. The animals were divided in to 3 groups. The control group received no drugs but to the animals in the second and third groups 0.2ml of carboxymethyl cellulose and 7.6mg/kg of leuprolide acetate were administered respectively. All the animals were dissected five weeks after the administrations and their testes were processed for the study of germ cells and morphometric studies of seminiferous tubule parameters using transmission electron (TEM) and light microscopes (LM). The results from the five groups were compared morphologically and the data were statistically analyzed by ANOVA tests. Results: The ultrastructural study revealed that most alterations were in spermiogenic cells. The nuclei and acrosomes had been deformed in most spermatids. In some developing spermatids, there were acrosomal vesicles inside the nucleus and ectoplasmic specialization had been partially deleted in some areas. The flagella were deformed in elongated spermatids and their fibrous sheaths were discontinuous. In light microscopy, the maturity of spermatogenetic cells, based on Johnson’s testicular biopsy score, in the control, sham and experimental groups were 8.1±0.53, 8.04±0.82 and 7.01±0.57 respectively and maturation had been significantly reduced in the third group (p < 0.01). In addition, all histometric parameters in seminiferous tubules had been decreased compared to the sham and control groups (p < 0.01). Conclusion: Administration of a single dose of leuprolide acetate during a spermatogenetic cycle in mice is associated with adverse effects on spermatogenesis and it is mostly associated with alterations in spermiogenesis or transformation of round spermatids into elongated spermatids.
Keywords
Electron microscope
Germ cells
GnRH
Leuprolide acetate
Male infertility
Mouse
spermatogenesis
Spermiogenesis

زمینه و هدف

اسپرماتوژنز روندی است که بوسیله هورمون‌های گونادوتروپینی مانند هورمون تحریک‌کننده فولیکولی (FSH) و لوتئینیزه‌ (LH) کنترل می‌شود. بدیهی است هرگونه تغییر در میزان گنادوتروپینها می‌تواند با تغییر در اسپرماتوژنز همراه باشد. تجویز گنادوتروپین‌های اگزوژن در فرم آگونیست یا آنتاگونیستGnRH در نهایت باعث مهار محور هیپوفیزی‌ـ گنادی و مهار ترشح FSH، LH و تولید استروئیدهای جنسی می‌شود؛ هرچند که نحوه مکانیسم عمل آنالوگها و آنتاگو-نیست‌هایGnRH با یکدیگر متفاوت است (1).

لوپرلایداستات یک دکاپپتید سنتتیک و آگونیست هورمون آزادکننده گنادوتروپین می‌باشد. این دارو برای درمان اندومتریوز، لیومیومای رحم، سرطان پیشرفته پروستات و در برخی موارد جهت درمان ناباروری (2) و کریپتورکیدیسم (3) مورد استفاده قرار می‌گیرد. تجویز لوپرلاید استات در رت (4) و انسان (7-5) باعث کاهش تستوسترون سرم می‌شود و ممکن است باعث کاهش وزن بیضه شود (8،4). یکی از مکانیسم‌های لوپرلاید، سرکوب کردن محور هیپوفیزی‌ـ گنادی می‌باشد. تجویز لوپرلاید در رت به‌دنبال دوکسوروبیسین (9)، پروکاربازین (10) و اشعه درمانی (11) باعث حفظ و نگهداری اسپرماتوژنز در طی درمان می‌شود. همچنین در موشها نیز لوپرلاید می‌تواند اسپرماتوژنز را به‌دنبال درمان با سیکلوفسفاماید (12) حفظ نماید. مطالعات در رت و موش نشان داده‌اند که تجویز لوپرلاید به بیضه میزبان باعث ایجاد محیط مناسب برای پیوند بهتر سلول‌های زایا و برقراری بهتر اسپرماتوژنز می‌شود (13،14).

مصرف گنادوتروپینها در گونه‌های دیگر نیز می‌تواند با اختلالات اسپرماتوژنز همراه باشد. برای مثال در سگها تجویز یک دوز آنتاگونیست GnRH منجر به کاهش تمایل جنسی، کاهش قطر اسکروتوم بیضه و کاهش مایع منی و پارامترهای اسپرم می‌شود (15،16). همچنین تجویز گنادوتروپین‌های اگزوژن به میمونها باعث اختلال در مراحل بلوغ و تکامل اسپرم در اپیدیدیم می‌شود (17). از آنجایی که اثرات گنادوتروپین‌های اگزوژن پس از قطع درمان برطرف می‌شود، در برخی مواقع می‌توانند به عنوان روشی برای جلوگیری از باروری در مردان نیز مطرح باشند (2)؛ لذا آگاهی از نحوه عملکرد آنها می‌تواند کمک مؤثری در درمان‌ ناباروری و همچنین روش‌های پیشگیری از باروری باشد.

براساس مطالعه Glode و همکاران در سال 1981 که با میکروسکوپ نوری انجام شد، مصرف لوپرلاید در موشها باعث تغییر ساختمانی و هیستولوژیکی در لوله‌های سمی‌نیفروس بیضه نمی‌گردد (12)، هرچند که Manabe در سال 1996 نشان داد که به‌دنبال تجویز mg/kg9 لوپرلاید در رت، قطر لوله سمی‌نیفروس و درجه بلوغ آنها کاهش می‌یابد (9). در هیچ یک از موارد نامبرده در ارتباط با تغییرات کمی و فراساختاری سلول‌های زایای بیضه مطالعه‌ای صورت نگرفته است.

براساس مطالعات حاضر اطلاعاتی در مورد تغییرات فراساختاری داروهای آگونیست GnRH و همچنین لوپرلاید استات بر روی سلول‌های زایای بیضه و رده‌های بلوغی اسپرم در دسترس نمی‌باشد. از طرف دیگر مطالعه با میکروسکوپ الکترونی با ارزش‌ترین نوع مطالعات مورفولوژیکی از نظر ارزیابی هسته، اندامکها، غشاها و اتصالات سلولی مخصوصاً در مقایسه با میکروسکوپ نوری به حساب می‌آید، ضمن اینکه آگاهی از تغییرات فراساختاری سلول‌های زایا و رده‌های بلوغی اسپرم به‌دنبال تجویز گنادوتروپینها می‌تواند کمک بیشتری در درک بهتر اسپرماتوژنز و اسپرمیوژنز و در نتیجه عملکرد آنها باشد؛ مطالعه حاضر با هدف بررسی تغییرات فراساختاری سلول‌های اسپرماتوژنیک یا اسپرمیوژنیک موش بالغ بدنبال تجویز یک دوز لوپرلایداستات در فرم دپو می‌باشد. همچنین در این مطالعه با استفاده از میکروسکوپ نوری وضعیت اسپرماتوژنز داخل لوله‌های سمی‌نیفروس و تعداد سلول‌های زایای بیضه و رده‌های بلوغی اسپرم و پارامترهای هیستومتریک لوله‌های سمی‌نیفروس نیز مورد ارزیابی قرار گرفت، تا بتوان مشخص کرد که این دارو بیشتر بر روی چه سلول‌هایی از لوله‌های سمی‌نیفروس مؤثر واقع شده است.

روش بررسی

حیوانات: 24 موش نر نژاد NMRI، با سن 6 هفته از موسسه رازی تهران خریداری شدند. حیوانات در اتاقی با درجه حرارت کنترل شده و سیکل نوری 12 ساعت تاریکی/ روشنایی با دسترسی آزادانه به آب و غذا نگهداری شدند. جهت تطبیق با محیط، حیوانات 2 هفته در محیط قرار گرفتند و سپس حیوانات 8 هفته به سه گروه کنترل، شم و آزمایش تقسیم شدند (هر گروه شامل 8 حیوان). به حیوانات گروه آزمایش mg/kg6/7 از آمپول لوپرلاید (Wyeth, UK) به‌صورت زیر جلدی به پوست پشت حیوان تزریق شد. شایان ذکر است که دارو در یک دوز تزریق گردید. همچنین دوز mg/kg6/7 لوپرلاید براساس گزارش‌های قبلی در موش انتخاب شد (13،14). جهت حلالیت دارو از کربوکسی متیل سلولز (Wyeth, UK) استفاده شد. به حیوانات شم ml2/0 کربوکسی متیل سلولز به‌صورت زیر جلدی تزریق شد اما حیوانات کنترل، دارویی دریافت نکردند.

با توجه به این که سیکل کامل اسپرماتوژنز در موش 35 روز می‌باشد (18،19)؛ لذا پس از گذشت 5 هفته از شروع درمان همه حیوانات با کلروفرم بیهوش شدند. بلافاصله پس از تشریح، هر دو بیضه از حفره شکم حیوان خارج شد. به منظور مطالعه با میکروسکوپ الکترونی در تمامی حیوانات برش‌هایی از بیضه چپ و برای مطالعه میکروسکوپ نوری بیضه راست مورد استفاده قرار گرفت.

میکروسکوپ الکترونی ترانسمیشن (TEM): برش‌های بافتی از بیضه چپ در گلوتارآلدئید 5/2% (Pro Sci Tech, AU) و پارافرمالدئید 4% (Merck, Germany) به مدت یک شب ثابت شدند. جهت ثابت کردن ثانویه از تتراکسید اسمیوم 2% (Taab, UK) به مدت دو ساعت استفاده شد. پس از پردازش بافتی، نمونه‌ها در رزین قالبگیری شدند. برش‌های نازک بیضه با ضخامت nm500 با استفاده از اولترا میکروتوم (Richert-Jung, AU) و تیغه شیشه‌ای به دست آمد و با تولوئیدین بلو رنگ‌آمیزی و زیر میکروسکوپ نوری (Leo, Germany) برای تعیین مکان مناسب مطالعه شدند. سپس برش‌های نازک nm100 با استفاده از تیغه الماس و اولترا-میکروتوم تهیه گردید.

پس از آن، برش‌های نازک با اورانیل استات و سیترات سرب رنگ‌آمیزی شدند و تغییرات سلولی با میکروسکوپ الکترونی (Zeise, Germany) مورد ارزیابی قرار گرفت (20).

ارزیابی اسپرماتوژنز با استفاده از میکروسکوپ نوری: بیضه راست از هر حیوان در محلول بوئن برای مدت 48 ساعت در حرارت اتاق غوطه‌ور شد و سپس برای مطالعه با میکروسکوپ نوری پاساژ داده شد. برای به حداکثر رساندن تعداد برش‌های مناسب لوله‌های سمی‌نیفروس در مقطع عرضی، بیضه‌ها در جهت محور طولی در پارافین قالبگیری شدند. سپس با استفاده از دستگاه میکروتوم دوار (Leitz, Germany) مقاطعی با ضخامت m5 و فواصل منظم m200 به‌صورت نمونه‌گیری تصادفی ساده یکنواخت تهیه گردید تا تمامی برشها از شانس یکسانی برای مطالعه برخوردار باشند. به عبارت دیگر با این نوع نمونه‌برداری میزان سوگیری به حداقل مقدار رسانیده شد (21). از هر بیضه 8 اسلاید انتخاب و به طریق هماتوکسیلن، ائوزین رنگ‌آمیزی و با میکروسکوپ نوری مطالعه شد.

برای بررسی وضعیت بلوغ اسپرماتوژنز در داخل لوله‌ها از روش جانسون استفاده شد (22). بدین منظور از مقطع عرضی 100 لوله سمی‌نیفروس در هر حیوان استفاده گردید. به هر لوله براساس جدول نمرات، امتیاز 1 تا 10 تعلق گرفت. همچنین درصد لوله‌هایی که دارای بلوغ بالا بودند یعنی لوله‌هایی که نمرات 8،9 و10 داشتند نیز در هر گروه مورد محاسبه قرار گرفت. لازم به ذکر است که جدول ارزیابی کننده بلوغ اسپرماتوژنز در مدل‌های موشی متفاوت از انسان می‌باشد هرچند که با یکدیگر شباهت‌هایی نیز دارند (25).

تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی A، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتیدهای جوان گرد، اسپرماتیدهای دراز (با هسته کاملاً متراکم و کشیده و دارای دم) در مقطع عرضی 20 لوله سمی‌نیفروس در هر اسلاید مورد شمارش قرار گرفتند. حتی‌الامکان سعی شد تا از لوله‌هایی با مقطع عرضی گرد و تقریباً سایز یکسان استفاده شود و لوله‌هایی که بیضوی شکل یا در مقطع طولی بودند مورد شمارش قرار نمی‌گرفتند. شمارش سلولی براساس معیارهای مورفولوژی سلولی بود که توضیح آن قبلاً ارائه شده است (23). برای اندازه‌گیری قطر لوله سمی‌نیفروس، ضخامت اپیتلیوم ژرمینال و قطر مجرای لوله سمی‌نیفروس از یک میکروسکوپ نوری (Olympus, Germany) متصل به نرم افزار (Image computer analyzer, UK) استفاده شد.

تحلیل آماری: نتایج مورفولوژی میکروسکوپ نوری و الکترونی در نمونه‌های مورد مطالعه با یکدیگر مقایسه می‌شدند. بلوغ اسپرماتوژنز، تعداد سلول‌های زایا و اقطار پارامترها در لوله‌های سمی‌نیفروس با استفاده از برنامه آماری SPSS و روش ANOVA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و سطح معنی‌داری 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

مطالعات فراساختاری سلولهای زایا: در گروه کنترل سلول‌های اسپرماتوگونی بر روی غشاء پایه تکیه داشتند و دارای هسته گرد تا بیضی با هتروکروماتین کناری و دارای تعداد کمی اندامک در سیتوپلاسم بودند؛ ضمن این که دارای سیتوپلاسم کم و در عین حال هسته نسبتاً بزرگی بودند. سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه با سایز بزرگتر، بالاتر از غشاء پایه از اسپرماتوگونیها قابل افتراق بودند. ضمن این که در مقایسه با سلول‌های اسپرماتوگونی دارای اندامک‌‌های بیشتری بودند (شکل 1). عمده سلول‌های زایا به‌وسیله سیتوپلاسم وسیع سلول‌های سرتولی یا پشتیبان احاطه شده بودند.

هیچگونه تغییر فراساختاری قابل توجه در سلول‌های اسپرماتوژنیک مانند اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت به‌دنبال درمان با لوپرلاید در گروهها مشاهده نشد.

شکل 2 نشانگر اسپرماتید در حال تکامل در مرحله اسپرمیوژنز در موش کنترل است. همانطور که مشخص است هسته توسط سیتوپلاسم سلول سرتولی احاطه شده است. آکروزوم در حال تکامل به‌خوبی بر روی هسته قابل رویت است. تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک که وجود آن برای تکامل اسپرماتیدها ضروری است به‌خوبی دیده می‌شود. این تخصص یافتگی شامل:

1- غشاء سلولی سلول سرتولی که در تماس با غشا سلولی اسپرماتید است.

2- سیسترن‌های توسعه یافته و تکامل یافته شبکه آندوپلاسمی سلول سرتولی که به طور منظم و به موازات غشاء اسپرم دیده می‌شوند.

3- دستجاتی از فیلامان‌های اکتین که بین دو لایه یک و دو قرار می‌گیرند. بدیهی است هرگونه نقص در این 3 جزء باعث اختلال در تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک و در نتیجه منجر به بروز اشکال در تکامل اسپرماتیدهای گرد به جوان می‌شود (شکل2).

در گروه تحت درمان با لوپرلاید هسته برخی از سلول‌های اسپرماتید در حال تکامل تغییر شکل یافته و در برخی موارد حاوی وزیکول‌های آکروزومی بود که این وضعیت در گروه کنترل دیده نمی‌شود. ضمن این که در برخی نواحی تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک بین سلول‌های سرتولی و اسپرماتیدهای در حال درازشدن تغییر کرده است و تعداد کمی از سیسترن‌های توسعه یافته شبکه آندوپلاسمیک در مقایسه با کنترل دیده می‌شود، در برخی قسمتها، این نواحی تخصص یافته در گروه آزمایش به‌صورت نسبی حذف شده بود (شکل 4و 3).

لوپرلاید همچنین روی فلاژلها اثر کرده بود. زمانیکه بخش دم اسپرم‌های داخل مجرا بررسی شد، غلاف فیبروزه در زیر غشاء پلاسمایی و اطراف اکسونم به‌صورت غیرممتد و تغییر شکل یافته مشاهده شد؛ در حالیکه این وضعیت در گروه کنترل مشاهده نشد و غشاء پلاسمایی اسپرم و غلاف فیبری زیرین آن کاملاً ممتد و منظم بود (شکل 5).

در گروه تحت درمان با کربوکسی متیل سلولز نه در مطالعه با میکروسکوپ نوری و نه در مطالعه فراساختاری تفاوت مورفولوژیکی در مقایسه با کنترل یافت نشد.

وضعیت اسپرماتوژنز با میکروسکوپ نوری: در بررسی هیستولوژیک گروه کنترل، اسپرماتوژنز فعال در لوله‌های سمینیفروس در مراحل مختلف همراه با اسپرم‌های بالغ یا در حال بلوغ مشاهده شد. در داخل لوله‌ها رده‌های مختلف سلول‌های اسپرماتوژنیک در مراحل مختلف تقسیم به همراه سلول‌های سرتولی دیده شدند. در این لوله‌ها اپیتلیوم ژرمینال از ضخامت قابل توجهی برخوردار بود و سرحد مجاری لوله‌ها منظم بود. مجرای لوله سمینیفروس به‌صورت کاملاً مشخص و روشن دیده شد. همچنین در بافت بینابینی تجمعاتی از سلول‌های اسیدوفیل لیدیگ به همراه عروق و سایر سلول‌های همبندی مشهود بود (شکل 6). در گروه شم نیز مانند گروه کنترل اسپرماتوژنز فعال دیده شد و تفاوت خاصی از نظر هیستولوژیک در مقایسه با کنترل یافت نشد (شکل 7).

در گروه تحت درمان با یک دوز لوپرلاید، لوله‌های سمی‌نیفروس دارای ساختمان واپی‌تلیوم زایای نسبتاً طبیعی بودند. همه انواع سلول‌های زایا و سرتولی در داخل لوله‌های سمی‌نیفروس وجود داشتند. همه مراحل اسپرماتوژنز در این گروه قابل مشاهده بود؛ هرچند که تعداد سلول‌های زایا به‌ویژه اسپرماتیدهای دراز کاهش داشت. در این گروه مجرای بیشتر لوله‌های سمی‌نیفروس بسیار کوچک بود و به‌صورت اسیدوفیل مشاهده می‌شد (شکل 8). وضعیت بلوغ اسپرماتوژنز در گروه تحت درمان در مقایسه با کنترل و شم به‌صورت معنی‌داری کاهش داشت (01/0>p).

همچنین تمام پارامترهای هیستومتریک در لوله‌های سمی‌نیفروس در مقایسه با دو گروه دیگر کاهش معنی‌دار داشت (01/0>p) (جدول 2و1). همچنین ملاحظه گردید که یک دوز لوپرلاید باعث کاهش معنی‌دار سلول‌های جرم اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد و دراز شده است. در گروه تحت درمان با لوپرلاید به نظر می‌رسید که تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی افزایش یافته باشد هرچند که این اختلاف از نظر آماری معنی‌دار تلقی نشد (جدول 1).

بحث

در مطالعه حاضر از یک دوز لوپرلاید استات در فرم دیپوت به‌عنوان داروی آنالوگ GnRH استفاده ‌شد. این دارو در کلینیک به طور عمده برای درمان سرطان پروستات، آندومتریوز و میوم رحم استفاده می‌شود. این فرم دارو ابتدا در هفته اول و دوم باعث ترشح LH و FSH می‌شود؛ ولی به تدریج در هفته‌های بعد به‌دلیل بی‌تفاوتی گیرنده‌های سلول‌های گنادوتروپ نسبت به آنها، سبب مهار ترشح گنادوتروپین می‌شود. نشان داده شده است که تزریق آنالوگ GnRH نه تنها باعث کاهش گیرنده‌های GnRH هیپوفیز می‌شود؛ بلکه ساختار مولکولی گنادوتروپینها را نیز تغییر می‌دهد (24).

در این مطالعه ارزیابی فراساختاری نشان داد که لوپرلاید فاقد اثرات واضح روی اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت اولیه است و بیشترین اثرات آن بر روی اسپرماتیدهای گرد و فرآیند اسپرمیوژنز یعنی فرآیند تکامل اسپرماتیدهای گرد به دراز می‌باشد. مشخص شده است که آنالوگ‌های آزادکننده هورمون گنادوتروپینی باعث سرکوب کردن ترشح FSH، LH و کاهش سطوح تستوسترون می‌شوند (24،25، 4). احتمالاً کاهش گنادوتروپین و آندروژن باعث ایجاد تغییرات فراساختاری در سلول‌های اسپرمیوژنیک شده است. نشان داده شده است که در بیضه موش‌های هیپوگناد (hpg) که به‌طور کامل فاقد آندروژن می‌باشد، درمان با آندروژن باعث القاء حضور اسپرماتیدهای گرد و دراز حتی در غیاب FSH می‌شود. این تغییر مبین این نکته است که به طور فیزیولوژیکی تستوسترون جهت تکمیل میوز (اسپرماتیدهای گرد) و اسپرمیوژنز (تبدیل اسپرماتید گرد به دراز) ضروری می‌باشد (26).

در مطالعه حاضر تعداد همه سلول‌های جرم به جز اسپرماتوگونیها در گروه آزمایش کاهش یافت. نکته قابل توجه در مطالعه حاضر این بود که علیرغم کاهش تعداد سایر سلول‌های ردة بلوغی اسپرم، اسپرماتو-گونیها کم نشدند. شاید بتوان گفت که تکثیر سلول‌های اسپرماتوگونی در موش بالغ فرآیندی وابسته به گنادوتروپین نمی‌باشد. یافته‌های مشابهی به‌دنبال ایمونیزاسیون با GnRH گزارش شده است (27). همچنین در تأیید این یافته در میمون بالغ، درمان با GnRH تأثیری روی تعداد اسپرماتوگونی A نداشته است (28)، هرچند که به‌خوبی مشخص شده است که در رفتارهای اسپرماتوگونی هم بین گونه‌ها و هم بین نژادهای مختلف حتی در مواجهه با یک عامل مشابه تفاوت وجود دارد (29).

در مطالعه حاضر تعداد سلولها از اسپرماتوسیت اولیه به بعد کاهش داشت. مطالعات مشابهی در رت نشان داد که کمبود آندروژن عمدتاً روی سلول‌های اسپرماتوژنیک در مرحله VII اثر می‌کند و منجر به کاهش خفیف در تعداد اسپرماتوسیستها در مراحل VII-XIV و اسپرماتیدها در مراحل I-VII می‌شود (25،30). از آنجا که وجود رسپتورهای FSH بر سطح سلول‌های سرتولی و LH بر سطح سلول‌های لیدیگ و رسپتورهای آندروژن بر سطح سلول‌های میوئید که هر سه جزء سلول‌های سوماتیک بیضه هستند مشخص شده است (25،30) و با توجه به اینکه ارتباط تنگاتنگ و قوی بین سلول‌های سوماتیک و سلول‌های زایای در حال تکامل وجود دارد، به نظر می‌رسد که لوپرلاید توانسته باشد از طریق اثر بر سلول‌های سوماتیک باعث کاهش سلول‌های زایای بیضه شده باشد. در تأیید یافته‌های کمی، بلوغ اسپرماتوژنز نیز در گروه آزمایش کاهش معنی‌داری داشت که به طور مشابهی در مطالعه Manabe در سال 1997 باعث کاهش بلوغ اسپرماتوژنز گشت. مطالعات بعدی در ارتباط با بررسی میزان تکثیر سلول‌های زایا به‌دنبال مصرف لوپرلاید در موش مورد نیاز می‌باشد. به‌عبارت دیگر شاید بتوان کاهش سلول‌های زایای لوله سمینیفروس و در نتیجه پارامترهای هیستومتریک لوله سمینیفروس را در گروه آزمایش ناشی از دو مکانیسم: الف) کاهش تکثیر سلول‌های زایا و ب) افزایش مرگ سلول‌های زایا دانست.

البته مطالعه حاضر به طور اختصاصی تکثیر و تزاید سلول‌های زایا را مورد بررسی قرار نداد؛ ولی با مطالعه کمی به نظر می‌رسد که تزاید این سلولها کاهش یافته باشد که مطالعات دقیقتر و اختصاصی‌تر در این زمینه مورد نیاز می‌باشد.

مکانیسم احتمالی دیگر افزایش مرگ سلول‌های زایا است. شاید لوپرلاید از طریق افزایش مرگ سلول‌های زایا توانسته باشد باعث کاهش شمارش سلولی و بلوغ اسپرماتوژنز شود. هرچند که در مطالعه حاضر، چه در مطالعه با میکروسکوپ نوری و چه در مطالعه فراساختاری سلول‌های زایا، هیچگونه نشانه مورفولوژیک دال بر مرگ سلولی از جمله تراکم کروماتین، متراکم شدن سیتوپلاسم، حضور اجسام آپوپتوتیک یا قطعه قطعه شدن هسته در هیچ یک از نمونه‌ها دیده نشد. ضمن این که محققان مقالة حاضر در مطالعه قبلی خود با استفاده از روش TUNEL نیز نتوانستند افزایش مرگ سلولی به‌دنبال لوپرلاید را در سلول‌های زایا نشان دهند (31). مطالعه حاضر مشابه مطالعه Endo در سال 2003 است (8). همچنین، هیپوفیزکتومی در رت‌های نر بالغ و هامستر و به‌دنبال آن توقف، ترشح گنادوتروپینها، نمی‌تواند باعث القاء مرگ سلول‌های زایا شود (32،33)، ضمن این که Billing و همکاران در سال 1995 نشان دادند که تجویز آنتاگونیست GnRH در رت‌های بالغ نر نیز نمی‌تواند مرگ را در سلول‌های زایا القاء نماید (34)؛ در حالیکه درمان رت‌های نر به مدت 4-2 هفته نر با آنتاگونیست GnRH و همچنین هیپوفیزکتومی در رت‌های نابالغ نر باعث القاء مرگ سلول‌های زایا می‌شود (34). به عبارت دیگر همه این مطالعات نشان می‌دهند که وابستگی بیضه به گنادوتروپینها یک فاکتور وابسته به سن است و در سنین مختلف اثرات گنادوتروپین بر سلول‌های زایای بیضه می‌تواند متفاوت باشد.

Udagawa معتقد است که لوپرلاید از طریق اثرات پاراکرینی روی سلول‌های سرتولی و لیدیگ اسپرماتوژنز را تحت تأثیر قرار می‌دهد. چرا که سلول‌های زایا فاقد گیرنده برای GnRH بوده و رسپتورهای گنادوتروپینی بر سطح سلول‌های سرتولی و لیدیگ قرار دارند (3).

نتایج میکروسکوپ الکترونی مطالعه حاضر نشان می‌دهد که اتصال اکتوپلاسمیک سلول‌های سرتولی در موش‌های تحت درمان تغییر کرده است و حتی در برخی نواحی به طور نسبی حذف شده است. تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک نوع ویژه‌ای از اتصال سلولی است که بین سلول سرتولی و اسپرماتیدها وجود دارد و نقش مهمی در تکامل و کارکرد سلول‌های زایا دارد (35،36). به‌عبارت دیگر نقش زیادی در مورفوژنز و تکامل اسپرماتیدهای گرد به دراز دارد (36). مشابه یافته مطالعه کنونی، درمان با فلوتاماید که نوعی آنتی‌آندروژن محسوب می‌شود نیز باعث حذف نسبی تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک می‌شود (37). همچنین آنالوگ‌های GnRH از طریق کاهش FSH و LHو تستوسترون می‌توانند دارای خواص آنتی‌آندروژنیک باشند (37،38). از طرف دیگر به‌دنبال تجویز بیسفنول A یا بتا استرادیول-3- بنزوات در موشها و رت‌های بالغ و نیز تجویز 17- بتا استرادیول در نوزادان موش، تغییرات فراساختاری مشابهی گزارش شده است (39) شایان ذکر است که داروهای فوق‌الذکر دارای خواص استروژنی هستند؛ ضمن این که تعادل بین استروژن و آندروژنها در برقراری اسپرماتوژنز طبیعی بسیار با اهمیت می‌باشد (40). علاوه بر این FSH نقش مهمی در نگهداری اتصالات سلولی در اپی تلیوم ژرمینال دارد (41). بنابراین ارزیابی‌های هورمونی FSH و LH و تستوسترون و همچنین استروژن و اثرات آنها روی اسپرمیوژنز و اتصالات سلول‌های اسپرماتیدـ سرتولی (تخصص یافتگی اکتوپلاسمیک) از جمله مواردی است که بررسی آن در مطالعات بعدی به‌دنبال تجویز آنالوگ‌های GnRH پیشنهاد می‌شود.

در این مطالعه فراساختار فلاژل دم اسپرم تغییر یافته و غلاف فیبروزه در زیر غشاء پلاسمایی اسپرم به‌صورت غیرممتد مشاهده می‌شود. مشابه مطالعه حاضر، درمان با تریپتولاید، نوعی دی‌ترپن‌تری اپوکساید حاصل از یک نوع گیاه دارویی چینی می‌تواند منجر به ایجاد ناباروری در رت و موش‌های نر شده و باعث از بین رفتن غلاف فیبروزه دم اسپرم می‌شود (42،43). طبق مطالعات، تریپتولاید فاقد هرگونه اثری بر سطوح هورمونی FSH و LH و تستوسترون و استروژن داخل بیضه‌ای می‌باشد (42،43). بنابراین به نظر می‌رسد که غیرممتد شدن غلاف فیبروزه فلاژل در آزمایش حاضر، با مکانیسم ناشناخته‌ای و نه مکانیسم هورمونی ایجاد شده باشد که نیاز به بررسی بیشتر دارد.

نتیجه‌گیری

براساس نتایج مطالعه حاضر بیشتر اثرات فراساختاری لوپرلاید بر روی سلول‌های پس از فاز میوزی اسپرماتوژنز یعنی اسپرمیوژنز می‌باشد. تجویز لوپرلاید به میزان mg/kg6/7 در موش بالغ تاثیری بر تعداد اسپرماتوگونیها ندارد؛ هرچند که تعداد سایر سلول‌های زایا را کاهش می‌دهد. تجویز لوپرلاید در موش بالغ باعث کاهش بلوغ و پارامترهای هیستومتریک لوله سمی‌نیفروس می‌شود.

مطالعات اندوکرینولوژی دقیق از جمله بررسی سطوح FSH وLH، تستوسترون، استرادیول و تستوسترون داخل بیضه، همچنین انجام آزمایشات استریولوژی برای بررسی دقیق‌تر تغییرات تعداد سلولی و بافت بیضه و بررسی تغییرات فراساختاری سلول‌های سوماتیک بیضه (سرتولی، لیدیگ و میوئید)، بررسی تکثیر و مرگ سلول‌های زایا به‌دنبال درمان با لوپرلاید استـات از جمله مـواردی است که بـرای مطالعات بعدی پیشنهاد می‌شود.

تشکر و قدردانی

با سپاس از معاونت محترم پژوهشی و مرکز تحقیقات کاربردی داروئی دانشگاه علوم پزشکی تبریز که هزینه‌های این تحقیق را تأمین نمودند. همچنین از سرکار خانم آیدا اعظمی کارشناس آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی به خاطر همکاری صمیمانه در اجرای این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.

  1. Gobello C. New GnRH in canine reproduction. Anim Reprod Sci. 2007;100(1-2):1-13.
  2. Chillik C, Acosta A. The role of LHRH agonists and antagonists. Reprod Biomed Online. 2001;2(2):120-28.
  3. Udagawa K, Takeda M, Hosaka M, Kubota Y, Ogawa T. Recovery of spermatogenesis by high dose gonado-tropin-releasing hormone analogue treatment in rat crypt orchid testis after orchiopexy: J Urol. 2002;168 (3):1279-83.
  4. Udagawa K, Ogawa T, Watanabe T, Yumura Y, Takeda M, Hosaka M. GnRH analog, leuprorelin ace-tate, promotes regeneration of rat spermatogenesis after severe chemical damage. Int J Urol. 2001;8:615-22.
  5. Tunn UW, Bargelloni U, Cosciani S, Fiaccavento G, Guazzieri S, Payano F. Comparison of LH-RH ana-logue 1-month depot and 3-month depot by their hormone levels and pharmacokinetic profile in patients with advanced prostate cancer. Urol Int. 1998;60 suppl 1:9-16.
  6. Berges R, Bello U. Effect of a new leuprorelin formu-lation on testosterone levels in patients with advanced prostate cancer. Curr Med Res Opin. 2006; 22(4):649-55.
  7. Sartor O. Eligard: leuprolide acetate in a novel sustained-release delivery system. Urology. 2003;61(2 suppl 1):25-31.
  8. Endo F, Manabe F, Takeshima H, Akaza H. Protecting apermatogonia from apoptosis induced by doxorubicin using the luteinizing hormone-releasing hormone analog Leuprorelin. Int J Urol. 2003;10:72-9.
  9. Manabe F, Takeshima H, Akaza H. Protecting sperma-togenesis from damage induced by doxorubicin using the luteinizing hormone-releasing hormone agonist leu-prorelin: an image analysis study of rat experimental model. Cancer. 1997;79(5);1041-21.
  10. Meistrich ML. Restoration of spermatogenesis by hor-mone treatment aftercytotoxic therapy. Acta Paediatr Scand. 1999;88:19-22.
  11. Kangasniemi M, Huhtaniemi I, Meistrich ML. Failure of spermatogenesisto recover despite the presence of A spermatogonia in the irradiated LBNF1 rat. Biol Reprod. 1996;54:1200-08.
  12. Glode LM, Robinson Gould SF. Protection from cyclophosphamide induced testicular damage with an analogue of gonadotropin-releasing hormone. The Lancet. 1981;(23):1132-34.
  13. Ogawa T, Dobrinski I, Brinster RL. Recipient prepa-ration is critical for spermatogonial transplantation in the rat. Tissue Cell. 1999;31:461-72.
  14. Dobrinski I, Ogawa T, Avarbock MR, Brinster RL. Effect of the GnRH agonist leuprolide on colonization of recipient testes by donor spermatogonial stem cells after transplantation in mice. Tissue Cell.2001;33:200-7.
  15. Valiente C, Corrada Y, De La Sota PE, Galassi Gerez P, Gobello C. Effect of the GnRH antagonist, acycline, on canine testicular charachteristics. Theriogenology. 2007, In press.
  16. Saratsis Ph, Ypsilantis Y, Tselkas K. Semen quality during vincristine treatment in dogs with transmissible venereal tumor. Theriogenology. 2000: 53:1185-92.
  17. Yeung Ch, Weinbauer GF, Cooper TG. Effect of acute androgen withdrawal by GnRH antagonist on epidi-dymal sperm motility and morphology in the cynomol-gus monkey. J Androl. 1999;20(1):72-9.
  18. Adler ID. Comparison of the duration of spermato-genesis between male rodents and humans. Mutat Res. 1996;352(1-2):169-72.
  19. Cheng Yan C, Mruck DD. Cell junction dynamic in the testis: sertoli-germ cell interaction and male contra-ceptive development. Physiol Rev. 2002;82: 825-74.
  20. Bancroft JD. Theory and practice of histological tech-niques. 3rd Edition, Edited by Churchill Livingstone. 2002; London.pp:305-310.
  21. Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF, Evans SM, Korbo L, Marcussen N, et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sam-pled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 1998;96(10):857-81.
  22. Lewis-Johnes DI, Kerrigan DD. A modified Johnsen’s count for evaluation of spermatogenesis in the rat. IRCS Med Sci. 1985;13:510-1.
  23. Mohammad-Ghasemi F, Soleimanirad J, Ghanbari AA. [A morphologic and morphometric study of adult mouse testis following different doses of busulfan administration]. J Reprod Infertil. 2006;7(1):25-37. persian.
  24. Hardman JG, Limbird LE, Gilman AF. Goodman & Gilmans the pharmacological basis of therapeutics, tenth edition. Edited by McGraw Hill, Mexico. 2001; pp:1552-5.
  25. Kangasniemi M, Wilson G, Huhtaniemi I, Meistrich M. Protection against procarbazine-induced testicular damage by GnRH-agonist and anti- androgen treatment in the rat. Endocrinology. 1995;136:3677-80.
  26. Handelsman DJ, Spaliviero JA, Simpson JM, Allan CM, Singht J. Spermatogenesis without gonadotropins maintenance has a lower testosterone threshold than initiation. Endocrinology. 1999;140(9):3938-46.
  27. Marshall GR, Ramaswamy S, Plant TM. Gonado-tropin-independent proliferation of the pale type A spermatogonia in the adult rhesus monkey. Biol Reprod. 2005;73(2):222-9.
  28. Mclachlan RI, Wfeford NG, Kretser DM, Robertson DM. The effects of recombinant follicle-stimulating hormone on the restoration of spermatogenesis in the gonadotropin releasing hormone Immunized adult rat. Endocrinology. 1995;136(9):4035-43.
  29. Meistrich ML, Shetty G. Inhibition of spermatogonial differentiation by testosterone. J Androl. 2003;24(2): 135-48.
  30. Kangasniemi M, Wilson G, Parchuri N, Huhtaniemi I, Meistrich ML. Rapid protection of rat spermatogenic stem cells against procarbazine by treatment with a gonadotropin-releasing hormone antagonist (Nal-Glu) and an antiandrogen (flutamide). Endocrinology. 1995; 136:2881-8.
  31. فهیمه محمد قاسمی. بررسی فراساختاری و مطالعه آپوپتوز در بیضه موشهای بالغ بدنبال درمان با بوسولفان و درمان حمایتی با انالوگ GnRH. پایان نامه دکتری تخصصی بافت شناسی. دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز. تابستان 1385.
  32. Gosh S, Bartke A, Grasso P, Reichert LEJR, Russel LD. Structural manifestations of the rat sertoli cells to hypophysectomy: A correlative morphometric and endocrine study. Endocrinology.1992;131(1):485-97.
  33. Gosh S, Bartke A, Grasso P, Reichert LEJR. Russel LD. Structural response of the hamster sertoli cell to hypophysectomia: a correlative morphometric and endocrine study. Anat Rec. 1993;237(2):296.
  34. Billing H, Furuta I, Rivier C, Tapanainen J, Parvinen M, Hsueh AJW. Apoptosis in testis germ cells: Developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages. Endocrino-logy. 1995;136(1):5-12.
  35. Toyama Y, Maekawa M, Yuasa S. Ectoplasmic specialization in the sertoli cell: new vistas based on genetic defects and testicular toxicology. Anat Sci Int. 2003;78(1):1-16.
  36. O’Donnell L, Stanton PG, Bartles JR, Robertson DM. Sertoli cell ectoplasmic specialization in the semini-ferous epithelium of the testosterone suppressed adult rat. Biol Reprod. 2000;63:99-108.
  37. Anahara R, Toyama Y, Mori C. Flutamide induces ultrastructural changes in spermatids and the ectoplas-mic specialization between the sertoli cell and sper-matids in mouse testes. Reproductive Toxicology. 2004;18:589-596.
  38. Behre HM, Nashan D, Hubert W, Nieschlag E: Depot gonadotropin releasing hormone agonist blunts the androgen-induced suppression of spermatogenesis in a clinical trial of male contraception. J Clin Endocrinol Metab. 1992;74(1):84-90.
  39. Haywood H, Spaliviero J, Jimenz M, King NJ, Handelsman DJ, Allan CM. Sertoli cell and germ cell development in hypogonadal mice (hpg) expressing transgenic follicle stimulating hormone alone or in combination with restosterone. Endocrinology. 2003; 144(2):509-17.
  40. Toyama Y, Suzuki-Toyata F, Maekawa M, Ito CH, Toshimori K. Adverse effects of bisphenil A to sper-matogenesis in mice and rats. Arch Histol Cytol. 2004; 67(4):373-381.
  41. Muffly KE, Nazian SJ, Cameron DF. Effects of follicle-stimulating hormone on the junction-related Sertoli cell cytoskeleton and daily sperm production in testosterone-treated hypophysectomized rats. Biol Reprod. 1994;51(1):158-66.
  42. Sinha Hikim AP, Helue Y, Wang C, Reutrakul V, Sangsuwan R, Swerdloff RS. Post testicular aninfer-tility action of triptolide in the male rat: Evidence for severe impairement of cauda epididymal sperm ultra-structure. J Androl. 2000;21(3):431-7.
  43. Huynh PN, Hikim AP, Wang C, Stefonovic K, Lue YH, Leung A, et al. Long term effects of triptolide on spermatogenesis, epididymal sperm function and fertility in male rats. J Androl. 2000;21(5):689-99.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 8, Issue 2
Summer 2007
Pages 111-121