Detection of Legionella pneumophila by nested PCR-RFLP and ELISA on urine specimens of pregnant women with respiratory infections

Chamani Tabriz, Leili; Jeddi-Tehrani, Mahmood; Motahari, Shila; Zeraati, Hojjat; Asgari, Soheila; Karegar, Mohammad; Ostad Karampour, Mahyar

Detection of Legionella pneumophila by nested PCR-RFLP and ELISA on urine specimens of pregnant women with respiratory infections

Authors

Leili Chamani Tabriz ¹

Mahmood Jeddi-Tehrani ²

Shila Motahari ³

Hojjat Zeraati ⁴

Soheila Asgari ¹

Mohammad Karegar ³

Mahyar Ostad Karampour ²

¹ Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran

² Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran

³ Department of Microbiology, Azad University of Jahrom, Jahrom, Iran

⁴ Epidemiology Department, Faculty of Publi Health, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran

Abstract

Introduction: Pneumonia during pregnancy can induce serious consequences to the mother and the fetus, therefore its diagnosis and therapy is very important. There are few published jri_articles on Legionella infection prevalence during pregnancy. In patients with Legionellosis, bacterial LPS and DNA are excreted into urine for extended periods, so combination of PCR and ELISA methods would be a good diagnostic tool. This research was done to determine the prevalence of L. pneumophila in pregnant women with respiratory infections. Materials & Methods: This is a cross-sectional study on 95 pregnant women with respiratory infection carried out during winter to summer 2006. Presence of Legionella infection was con-firmed by nested PCR-RFLP and antigen detection in urine specimens by ELISA method. The data were analyzed by SPSS, version 13, by using independent t tests, Fisher’s exact test, χ2, a logistic model and McNemar’s test, while considering p < 0.05 as significant. Results: The prevalence of infection using PCR was 22.1% (CI=14.1%-30.1%) and by ELISA it was 4.2% (CI=2%-8.2%); this difference was statistically significant (p < 0.005). The most pre-valent clinical features were Cough (56.8%), headache (54.7%), abdominal pain (38.9%), chills (35.8%), fever (22.1%) and diarrhea (8.4%). There were significant statistical relationships bet-ween cases with a positive CRP and fever, chills and abdominal pain and previous liver or renal problems (p < 0.05, p < 0.001). There were significant relationships between fever and chills with ELISA results (p < 0.05) but no relationships with other variables. Conclusion: There was a considerable prevalence of this infection in the studied population (22.1%). It seems that performing PCR & ELISA tests on urine sample is suitable in detecting Legionella species and it can provide results in a less than a day_ a great help in the diagnosis and treatment of pneumonia especially during pregnancy.

Keywords

ELISA

Legionella pneumophila

molecular

Pneumonia

Pregnancy

زمینه و هدف

لژیونلا، باسیل گرم منفی، کوچک، هوازی، اجباری، گرمادوست، نیازمند به دمای oC 42-20 و محیط رشد اختصاصی BCYEα حاوی مواد ضروری (آهن، L-Cysteine، α-Ketoglutarate) و پروتئین است. می‌توان لژیونلا را از نمونه‌های بالینی در دمای oC35 و محیط مرطوب روی محیط کشت BCYEα پس از 5-2 روز انکوبه شدن به‌دست آورد که در مورد گونه‌های نامعمول این زمان تا 14 روز افزایش می‌یابد.

بیش از 49 گونه لژیونلا شناسایی شده‌اند که 20 گونه آن برای انسان بیماریزا هستند. لژیونلانموفیلا خود دارای 16 گونه سرمی متفاوت است که گونه یک آن عامل 90-70% اپیدمیها و موارد تک‌گیر می‌باشد. این باکتری از طریق استنشاق ذرات ریز آب حامل باکتری، در دستگاه تنفسی انسان جایگزین شده و منجر به آلودگی می‌شود. این باکتری در سراسر جهان به طور طبیعی در دریاچه‌ها، رودخانه‌ها، نهرها، چشمه‌های آب گرم، لجن‌های کف منابع آب و همچنین مخازن و شبکه‌های لوله‌کشی و برج‌های خنک کننده یافت می‌شود (1). سویه‌های مختلف لژیونلا به عنوان عامل اپیدمی‌های متعدد و نیز موارد تک‌گیر پنومونی گزارش شده‌اند. شیوع بیماری لژیونر به میزان آلودگی منابع آبی و حساسیت افراد بستگی دارد.

لژیونلاها دو نوع بیماری مستقل کلینیکی را ایجاد می‌‌نمایند که یکی بیماری شدید با درگیری چند ارگان شامل ذات‌الریه (بیماری لژیونر) بوده و دیگری تب پونتیاک است که نوعی بیماری خودبه‌خود محدود شونده شبیه آنفولانزا می‌باشد (2).

مطالعات بیانگر این است که لژیونلا تا40% بوسیله کشت و80% از طریق PCR در محیط‌های آب شیرین یافت می‌شود. شناسایی آنتی‌ژن‌های ادراری و PCR لژیونلا نسبت به سایر روش‌های تشخیصی سریعتر انجام می‌گیرد و این امر می‌تواند به درمان آنتی‌بیوتیکی مناسب کمک کرده و از ایجاد عوارض بیماری لژیونر پیشگیری نماید (3). آنتی‌ژن لژیونلا 3 روز پس از شروع علایم بیماری در ادرار یافت می‌شود و می‌تواند برای مدتی بیش از 300 روز باقی بماند (3). DNA لژیونلا را می‌توان از نمونه‌های ادرار، سرم و لکوسیت‌های گرفته شده از مبتلایان به بیماری لژیونر تا حد حساسیت 30 الی 86% شناسایی کرد (1).

حساسیت و ویژگی تست الیزا برای تشخیص آنتی‌ژن‌های ادراری به ترتیب2/88% و 95% است و می‌تواند به عنوان آزمایشی برای شناسایی نمونه‌ها و گروه سرمی نموفیلا و غیرنموفیلا در نظر گرفته شود که دقت تشخیصی آن را می‌توان با استفاده از نمونه‌های ادراری تغلیظ شده به 100% افزایش داد (4).PCR تست سریعی است که با حساسیت 100-80% و ویژگی بیش از 90% نتیجه را مشخص می‌کند و همچنین از قابلیت آشکارسازی گونه‌های لژیونلا و گروه‌های سرمی آن برخوردار است و نتایج را طی زمان کوتاه و مناسبی برای کنترل بالینی بیماری فراهم می‌کند (1).

ذات‌الریه در دوران بارداری می‌تواند نتایج وخیمی برای مادر و جنین به همراه داشته باشد و شایع‌ترین عامل پاتوژن باکتریایی آن استرپتوکوکوس نمونیا است؛ اما لژیونلا هم باید در موارد پنومونی همراه با درگیری چند ارگان در نظر گرفته شود. در موارد شدید بیماری احتمال زایمان زودرس (5) و مرگ جنینی (6) وجود دارد. در واقع ذات‌الریه باعث ایجاد اختلال در 1/0 درصد از بارداریها می‌شود (5).

از آنجا که دوران بارداری دوران بسیار حساسی است و عفونت‌های ریوی می‌توانند باعث ایجاد مرگ ومیر و ناتوانی در مادر و جنین شوند و از طرفی نقش لژیونلا در عفونت‌های تنفسی در دوران بارداری در ایران نامشخص است، این تحقیق به منظور تعیین نقش لژیونلا در ایجاد عفونت‌های تنفسی در زنان باردار و دستیابی به یک روش تشخیصی حساس و مناسب برای تشخیص عفونت‌های تنفسی ناشی از لژیونلا انجام شد تا اهمیت شناخت و درمان به موقع و مناسب بیماری به‌منظور پیشگیری از عوارض احتمالی بعدی آن مورد ارزیابی قرار گیرد.

روش بررسی

این مطالعه از زمستان84 تا تابستان 85 روی 95 زن باردار مبتلا به عفونت تنفسی با انتخاب تصادفی از میان مراجعین به درمانگاه‌های مامایی بیمارستان‌های وابسته به سازمان تأمین اجتماعی و دانشگاه علوم پزشکی تهران انجام شد. این زنان رضایت خود را جهت شرکت در مطالعه ابراز نمودند. معیارهای ورود به مطالعه شامل بارداری، عدم مصرف آنتی‌بیوتیک طی 3 هفته قبل از زمان انجام نمونه‌گیری و دارا بودن دو یا چند مورد از علایم عفونت شامل تب، سرفه، خلط‌ چرکی، آبریزش بینی و گرفتگی بینی همراه یا بدون سردرد و اسهال بود. ابزار تحقیق پرسشنامه و نمونه مورد استفاده، نمونه ادراری بود که شرکت‌کننده طی حداقل 2 ساعت قبل از نمونه‌گیری، دفع ادرار نداشتند (FCU) . از مزایای انتخاب ادرار به عنوان نمونه مورد بررسی می‌توان به غیرتهاجمی بودن نمونه‌گیری و امکان جمع آوری نمونه توسط خود فرد اشاره نمود؛ ولی چون معمولاً کشت لژیونلا سخت و بسیار حساس می‌باشد و امکان آلودگی شدید دارد، نمونه ادرار برای کشت مناسب نبوده و فقط از آن برای تست‌های مولکولی و ELISA استفاده می‌شود. به‌طور کلی نمونه‌های حاصل از اندام‌های غیرتنفسی به نمونه‌های تنفسی ارجحیت دارند؛ چرا که با استفاده از این نمونه‌ها تشخیص بیماران مبتلا به ذات‌الریه خشک و بدون خلط امکانپذیر می‌باشد (1).

در پرسشنامه، اطلاعات شخصی از جمله سن، سطح تحصیلات، شغل، علایم عفونت شامل تب بالای C40، لرز مکرر، سرفه خشک، خلط، درد شکمی و سابقه اعتیاد، بیماری‌های کبدی و کلیوی، دیابت، بیماری‌های قلبی و ریوی و واکسیناسیون مورد پرسش قرار گرفت.

پس از مصاحبه وتوضیح مراحل نمونه‌گیری و اهداف مطالعه، ابتدا رضایتنامه کتبی توسط افراد تکمیل و پرسشنامه طرح از طریق مصاحبه تکمیل گردید. پرسشگر قبل از شروع کار توسط مجری طرح (متخصص بیماری‌های عفونی وگرمسیری) تحت آموزش قرار گرفت.

پس از تکمیل پرسشنامه ml15-10نمونه اول ادرار اخذ و بلافاصله تحت شرایط استاندارد (دمای C8-2)

به آزمایشگاه میکروب‌شناسی پژوهشکده فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا انتقال ‌یافت تا استخراج DNA از نمونه‌ها در همان روز انجام گیرد. استخراج DNA با استفاده از روش پروتئیناز K و رسوب با نمک (7) طبق مراحل ذیل صورت گرفت:

ml15-10 ادرار به مدت 10 دقیقه با دور g500 سانتریفیوژ شده و مایع رویی تخلیه شد. سپس ml1 بافر PBS به رسوب نمونه ادراری اضافه و پس از یکنواخت شدن رسوب آنرا به داخل میکروتیوب منتقل کرده و میکروتیوبها به‌مدت 10 دقیقه با سرعت g500 سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه مایع رویی این مرحله مجدداً تکرار شد. سپس µl300 بافر TES ، به‌همراه µl75 از SDS 10% و µl25 پروتئیناز K (mg/ml100) به رسوب اضافه شد و به‌دنبال آن پس از یکنواخت کردن رسوب در محلول، نمونه‌ها به مدت 2 ساعت در دمای  C65-55 انکوبه شدند. در مرحله بعد µl150 محلول NaCl اشباع به آن افزوده و به مدت 20 دقیقه با دور g10000 سانتریفیوژ شد. محلول فوقانی به میکروتیوب‌های جدید منقل شد و µl300 ایزوپروپانول به آن‌ افزوده و به آرامی مخلوط شد تا رشته‌های DNA ظاهر گردد. مجدداً به مدت 10 دقیقه با سرعت g10000 سانتریفیوژ و محلول رویی تخلیه و سپس رسوب حاصل در هر میکروتیوب با ml1 اتانول 70% شستشو داده شد. پس از سانتریفیوژ محلول با دور g10000 به مدت 1 دقیقه محلول رویی به‌صورت کامل خارج و نهایتاً مقدار µl200-15 بافر TE به DNA افزوده شد. DNA استخراج شده تا زمان انجام PCR در دمای oC20- نگهداری‌ گردید.

PCR اختصاصی برای لژیونلا پس از بهینه‌سازی در مخلوط واکنشی به حجم µl50 شامل بافر PCR X10 (Roche, Germany) به مقدار µl5، (mM25) MgCl2به مقدار l 3، (mM10) dNTPبه مقدار µl5/1، پرایمرهای forward وreverse (rpoB) با غلظت mM10 هر کدام به‌مقدار µl1، Tag DNA Polymerase (µl/u5)

Roche, Germany)) به مقدار µl2/0، µl3/37 آب مقطر دیونیزه وµl1 از نمونه DNA انجام گردید. سپس برنامه PCR به صورت دناتوره کردن اولیه به مدت پنج دقیقه در دمای οC94 و به‌دنبال آن برنامه اصلی در 37 سیکل شامل οC94 به مدت سی‌ثانیه، οC58 به مدت سی‌ثانیه و οC72 به مدت سی‌ثانیه و در انتها پس از اتمام سیکلها تکثیر نهایی در οC72 به مدت ده دقیقه بهینه‌سازی شد. محصول PCR روی ژل آگارز 5/1% الکتروفورز گردید. در صورت مشاهده باند bp297 محصول PCR مثبت تلقی شد. در مرحله بعد با استفاده از یک جفت پرایمر داخلی (nes rpoB) مجدداً Nested PCR مشابه با شرایط PCR اول روی نمونه‌های مثبت و منفی PCR اول انجام گرفت. در Nested PCR اگر باند bp216 مشاهده می‌شد نمونه مثبت تلقی می‌شد؛ ولی اگر باندی مشاهده نشد نتیجه با قاطعیت منفی گزارش می‌گردید.

از آنجایی که توالی حفظ شده rpoB در تمام گونه‌های لژیونلا وجود دارد و تنها سویه مورد نظر این طرح، سویه نموفیلا بود در مرحله بعد جهت تشخیص سویه نموفیلا روی محصولاتی که دارای PCR مثبت بودند RFLP انجام شد. در RFLP محصولات مثبت PCR ابتدایی و Nested PCR با استفاده از آنزیم محدودکننده Bam HI (Canada, Invitrogen) مورد برش و هضم آنزیمی قرار گرفتند. در صورتی که هریک از نمونه‌های PCR اول پس از هضم آنزیمی دارای باندهای bp 158 و bp 139 و نمونه‌های Nested PCR پس از هضم آنزیمی دارای باندهای bp 134 و bp82 نبودند احتمالاً DNA موجود در محصولات PCR آنها تا زمان انجام RFLP، دچار تغییر ماهیت شده یا گونه دیگری غیر از لژیونلا نموفیلا می‌باشد ولی در صورتیکه هریک از نمونه‌های مورد بررسی با کنترل مثبت تست (نمونهDNA استخراج شده از کلنی‌های لژیونلا نموفیلا استاندارد ATCC33152) مطابقت داشت و دارای باندهای فوق الذکر بود. تمامی مراحل RFLP به‌درستی انجام شده، نمونه قطعاً مثبت است و آلودگی با لژیونلا نموفیلا وجود دارد (شکل 1).

پرایمرهای مورد استفاده جهت تشخیص ژنوم باکتری در PCR اول دارای توالی زیر بودند (8):

rpoB-f: 5' AAGTGTTGGCGAAATGACC 3'

rpoB-r: 5' GTTGTATGTACGTCACGGA 3'

پرایمرهای مورد استفاده جهت تشخیص ژنوم باکتری در PCR Nested دارای توالی زیر بودند (8):

Nes rpoB-f:5' TCAGTTTAGAGTAGGTCTTG 3'

Nes rpoB-r: 5' CCAAGAGCTGATACACGT 3'

برای انجام تست ELISA به روش ساندویج از کیت تشخیصی لژیونلا (DRG, Germany) استفاده شد.

در مرحله بعد اطلاعات پرسشنامه‌ها همراه با نتایج تست‌های Nested PCR-RFLP و ELISA وارد نرم‌افزارSPSS (ویرایش 13) شد و با استفاده از آزمون‌های آماری t مستقل،‌ فیشر، 2، مدل لجستیک یک متغیره و مک نمار مود تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. سطح معنی‌داری، 5% در نظر گرفته شد. همچنین جهت بررسی اثر همزمان متغیرها بر نتیجه تست از مدل لجستیک چندگانه استفاده شد.

نتایج

در این مطالعه 95 خانم 41- 15 ساله باردار دارای علایم عفونت تنفسی مورد بررسی قرار گرفتند که متوسط سن آنها 08/5±89/25 سال بود. در سابقه شخصی افراد، 1/41% شرکت‌کنندگان دارای تحصیلات متوسطه و 2/82% خانه‌دار بودند. شایع‌ترین علایم بیماری در بین شرکت‌کنندگان شامل تب در 21 نفر (1/22%)، لرز 34 نفر (8/35%)، سرفه خشک 54 نفر (8/56%)، سردرد 52 نفر (7/54%)، اسهال 8 نفر (4/8%) و درد شکمی 37 نفر (9/38%) بود. هیچ یک از بیماران طی سال قبل از آزمایش واکسن نزده و طی10 روز قبل از نمونه‌گیری دارویی مصرف نکرده بودند.

از 95 خانم شرکت‌کننده در تحقیق، 21 نفر (1/22%) (1/30%- 1/14%CI=) تست مثبت PCR و 4 نفر (2/4%) (2/8%- 0/2%CI=) تست مثبت ELISA داشتند. براساس آزمون مک نمار (جدول 1) مشخص شد که تفاوت تشخیص موارد مثبت عفونت با استفاده از این دو تست از نظر آماری معنی‌دار است (001/0p<).

بیشترین شیوع بیماری برحسب PCR در فصول زمستان و تابستان به میزان 6/47%، در گروه سنی

24-20 ساله به میزان 1/57%، در افراد دارای تحصیلات متوسطه به میزان 3/33% و در افراد خانه‌دار 4/71% دیده شد.

در بین افراد PCR مثبت 15 نفر (4/71%) تب، 15 نفر (4/71%) لرز، 13 نفر (9/61%) سرفه خشک، 11 نفر (4/52%) سردرد، 13 نفر (9/61%) خلط، 8 نفر (1/38%) درد قفسه سینه در موقع تنفس، 4 نفر (0/19%) درد شکمی، 8 نفر (1/38%) درد عضلانی، 5 نفر (8/23%) تهوع و استفراغ، 11 نفر (4/52%) بی‌حالی و کسالت و

7 نفر (3/33%) بی‌اشتهایی داشتند؛ ولی هیچ موردی از اسهال، اعتیاد و یا مصرف الکل مشاهده نشد. همچنین 4 نفر (15%) ابتلای به بیماری‌های کبدی و کلیوی، 1 نفر (8/4%) دیابت و 1 نفر (8/4%) بیماری قلبی و ریوی را ذکر نمودند.

در افراد PCR مثبت، شیوع علایم تب (001/0p<)، لرز (001/0p<)، درد شکمی (05/0p<) و سابقه بیماری‌های کبدی و کلیوی (05/0p<) به‌طور معنی‌داری بالاتر از افراد PCR منفی بود. همین ارتباط بین نتیجه تست ELISA و علایم لرز (05/0p<) و تب (05/0p<) نیز وجود داشت، ولی بین سایر متغیرهای مورد بررسی با نتایج تست ارتباط معنی‌داری یافت نشد. با استفاده از مدل لجستیک یک‌متغیره نیز اثر متغیرهای مختلف برشانس ابتلا به این بیماری مورد بررسی قرار گرفت که نتایج تاییدکننده آزمون‌های قبلی بود. به‌علاوه بررسی‌های بیشتر با استفاده از مدل لجستیک چندگانه نیز همان نتایج را نشان می‌داد.

بحث

پنومونی یا عفونت‌های ریوی یکی از جدی‌ترین بیماری‌هایی است که هر ساله عده زیادی را در جهان آلوده کرده و یا به کام مرگ می‌کشد. یکی از عوامل ایجاد کننده پنومونی، لژیونلا می‌باشد که عامل بیماری لژیونلوسیس است. فراوانی لژیونلانموفیلا در بین پنومونی‌های اکتسابی از جامعه (CAP) در جهان متغیر می‌باشد. مثلاً در بررسی CAP در اسپانیا در طول سال‌های 1994 تا 1996 از میان 157 بیمار، تعداد 48 مورد گونه لژیونلا نموفیلا گزارش شد (9). همچنین پس از 3 سال بررسی و جمع‌آوری اطلاعات بوسیله CAPNetz در 3500 بیمار مبتلا به پنومونی اکتسابی از جامعه، فراوانی لژیونلا نموفیلا 3 % گزارش شد (10). همچنین در بررسی‌های CAP در چین در سال‌های 2003-2001 از تعداد 389 بیمار، 2 مورد به لژیونلا نموفیلا مبتلا بودند (11). در بررسی بیماران پنومونی اکتسابی از جامعه در اردن فراوانی لژیونلا نموفیلا 6% گزارش شد (12). در کره نیز از 126 بیمار CAP، 3 بیمار (4/2%) مبتلا به لژیونلا نموفیلا بودند (13).

در سال 2005 در مطالعه CAP در 12 مرکز در آسیا انجام گرفت از میان 1374 بیمار، فراوانی لژیونلا نموفیلا 6/6 % به‌دست آمد (14). مطالعه‌ای نیز در کویت در سال 2005 در طول یک سال بررسی در 3 بیمارستان به‌وسیله تیم بررسی پنومونی صورت گرفت که از 124 بیمار مبتلا (8%) آنها مبتلا به بیماری لژیونر بودند (15).

مطالعات عفونت با لژیونلا نموفیلا در بارداری اغلب به‌صورت گزارش موردی می‌باشد. در سال 1997 گزارشی مربوط به یک زن باردار که به مدت 3 ماه علایم عفونت تنفسی لژیونلایی را داشت ارائه شد وی تحت درمان با اریترومایسین قرار گرفته بود. این اولین گزارش در مورد درمان موفقیت‌آمیز بیماری لژیونر در زمان بارداری که حاصل آن تولد نوزادی سالم بود را بیان می‌نمود (5). گزارش دیگری در سال 2006 در مورد عفونت با لژیونلا در دوران بارداری مربوط به یک زن 36 ساله ارائه شد که در هفته 34 بارداری، لژیونلانموفیلا توسط کیت تشخیصی آنتی‌ژن ادراری الایزا تشخیص داده شد. این گزارش، یک بررسی موفقیت‌آمیز، تشخیص سریع و درمان مناسب بود (16). گزارش دیگر در سال 1999 پس از تولد یک نوزاد و مرگ وی در 4 هفته بعد از تولد ثبت شد که در سیستم وان حمام خانگی متولد شده بود. پس از 42 هفته بارداری، کودک سالم متولد شد ولی در روز هفتم علایمی از تب و تهوع نشان داد که نشانه آلودگی به لژیونلا بود و در ظهر روز بعد در اثر ایست قلبی‌ـ ریوی از دنیا رفت (17).

تشخیص آزمایشگاهی لژیونلا نموفیلا به روش‌های مختلفی صورت می‌گیرد. مطالعه‌ای در لهستان با استفاده از اطلاعات جمع‌آوری شده از 28 کشور انجام شد. با استفاده از روش جداسازی آنتی‌ژن ادراری و کشت، شیوع لژیونلوسیس 7/4% به‌دست آمد (18). در بررسی دیگری درجنوب ایتالیا با استفاده از روش جداسازی آنتی‌ژن لژیونلا و تعیین تیتر آنتی‌بادی لژیونلا، فراوانی عفونت 9/5% گزارش شد (19). تحقیقی در کره برای شناسایی و تشخیص لژیونلا نموفیلا انجام شد که تست‌های تشخیصی بکار رفته، ELISA و PCR بر روی نمونه ادرار بود و از 126 بیمار مورد بررسی، 3 بیمار (4/2%) مثبت گزارش شدند (13). در یک بررسی در نیوزلند از 28 بیمار مبتلا به پنومونی 18 نفر (64%) دارای DNA لژیونلا در ادرار بودند؛ ولی در 28 بیمار با پنومونی غیرلژیونلایی، PCR منفی بود. نتیجه این گزارش نشان داد که جداسازی DNA از ادرار بیماران مبتلا به پنومونی ابزار با ارزشی برای تشخیص سریع بیماری لژیونلانمونیا (لژیونلوسیس) می‌باشد (20). در یک بررسی در اسپانیا از 295 بیمار مبتلا به لژیونلا نموفیلا 141 نفر (8/47%) PCR مثبت بودند که 5/87% دارای پنومونی حاد و 9/37% پنومونی خفیف داشتند (21). اکنون بیان می‌شود که ELISA با حساسیت بیش از 70% و اختصاصی بودن 100-99% و طی مدت زمانی معادل 2 ساعت جزء بهترین روش‌های تشخیصی می‌باشد و اگر همراه به PCR باشد بهترین روش‌های تشخیصی محسوب می‌شوند (3). PCR-RFLP ژن rpoB برای لژیونلا روشی سریع و در دسترس و آسان و راحت می‌باشد که هم برای جداسازی جنس و هم برای تشخیص سریع گونه‌های لژیونلا مورد استفاده قرار گیرد (22).

تاکنون در ایران درباره لژیونلا مطالعات کمی صورت گرفته است. مطالعات، محدود به بررسی آب‌های مشکوک به لژیونلا در بخش‌های بیمارستانی مختلف و برج‌های خنک‌کننده بعضی کارخانجات و وزارتخانه‌ها می‌شود. به‌عنوان مثال در بررسی نمونه‌های آب سرد

و گرم بخش‌های پیوند عضو از نظر آلودگی به لژیونلا بوسیله روش کشت بیش از 22% از نمونه‌های

آزمایش شده حداقل به یک نوع لژیونلا آلوده بودند (23). تحقیقی نیز در سال 1382 توسط خسرو شاهی و همکاران برای جداسازی و تعیین هویت عوامل بیماری لژیونر از تجهیزات درمانی و منابع آب محیطی از بیمارستان‌های شهر اهواز صورت گرفت که میزان 6/6% از منابع آبی مورد بررسی آلوده به لژیونلا بودند (24). ولی تاکنون فراوانی عفونت با لژیونلانموفیلا در خانم‌های باردار مبتلا به عفونت تنفسی در ایران مورد بررسی قرار نگرفته بود.

نتیجه‌گیری

شیوع عفونت در مطالعه حاضر1/22% بوسیله PCR و 2/4% بوسیله ELISA گزارش شد که قابل مقایسه با مطالعات مشابه نمی‌باشد، ولی با مطالعات مختلفی که با هر یک از این روشها انجام شده است همخوانی دارد. اما تفاوت‌هایی بین شیوع به‌دست آمده با سایر جمعیت‌های مبتلا مشاهده شد که می‌تواند ناشی از بکارگیری روش‌های مختلف آزمایشگاهی با حساسیت و ویژگی‌های متفاوت و شرایط اپیدمیولوژیک منطقه از نظر دمای آب، وضعیت دستگاه‌های تهویه مطبوع و سایر عوامل موثر در رشد و تکثیر لژیونلا باشد. علیرغم اینکه بین عفونت با متغیرهای مورد بررسی در برخی موارد ارتباط آماری معنی‌دار بدست آمد؛ ولی می‌توان گفت که حجم نمونه جهت بررسی کلیه متغیرهای تاثیرگذار کفایت نمی‌نمود. به‌علاوه بررسی علایم عفونت براساس گزارشات بیماران و بدون انجام معاینه بالینی صورت گرفت که دقت کمتری نسبت به معاینه دارد.

در بسیاری از موارد عفونت‌های تنفسی، نقش لژیونلا به‌عنوان عامل ایجاد کننده، از نظر پنهان مانده و تأخیر در درمان مناسب منجر به ایجاد عوارض جدی در بیماران می‌شود. نتیجه مناسب با شروع به موقع درمان، مراقبت بیشتر از جنین در سه‌ ماهه آخر بارداری و سایر اقدامات مراقبتی موثر برای جنین بدست می‌آید.

به‌علاوه با توجه به محدودیت‌های موجود در استفاده از برخی آنتی‌بیوتیکها و ممنوعیت رادیوگرافی در دوران بارداری، تشخیص سریع و صحیح عفونت در این دوران از اهمیت زیادی برخوردار است. باتوجه

به حساسیت و ویژگی بالای روش PCR در تشخیص این عفونت، انجام این تست جهت شروع هرچه سریعتر درمان به‌منظور پیشگیری از عواقب وخیم جنینی و مادری ازجمله سقط و زایمان زودرس توصیه شده و پیشنهاد می‌شود به‌عنوان یکی از آزمایشات در مبتلایان به عفونت تنفسی مخصوصاً در مادران باردار به منظور

گردد.

تشکر وقدردانی

این مقاله با حمایت و پشتیبانی پژوهشکده فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاد دانشگاهی‌ ـ ابن‌سینا انجام گرفت که بدینوسیله از زحمات ایشان تشکر و قدردانی می‌گردد. ضمناً از ریاست و پرسنل سازمان تأمین اجتماعی و دانشگاه علوم پزشکی تهران صمیمانه سپاسگزاری می‌گردد.

Sohn J W, Park S C, Choi Y H, Woo H J, Cho Y K, Lee J S, et al. Atypical pathogens as etiologic agents in hospitalized patients with community-acquired pneu-monia in Korea: a prospective multi-center study. J Korean Med Sci. 2006;21(4):602-7.
Ngeow Y F, Suwanjutha S, Chantarojanasriri T, Wang F, Saniel M, Alejandria M, et al. An Asian study on the prevalence of atypical respiratory pathogens in community-acquired pneumonia. Int J Infect Dis. 2005; 9(3):144-53.
Behbehani N, Mahmood A, Mokaddas E M, Bittar Z, Jayakrishnan B, Khadadah M, et al. Significance of atypical pathogens among community-acquired pneu-monia adult patients admitted to hospital in Kuwait. Med Princ Pract. 2005;14(4):235-40.
Nagai T, Sobajima H, Iwasa M, Tsuzuki T, Kura F, Amemura-Maekawa J, et al. Neonatal sudden death due to legionella pneumophila associated with water birth in a domestic spa bath, J Clin Microbiol. 2003; 41(5):2227-9.
Montagna M T, Napoli C, Tato D, Spilotros G, Barbuti G, Barbuti S. Clinical-environmental surveil-lance of legionellosis: an experience in southern Italy. Eur J Epidemiol. 2006;21(4):325-31.
Murdoch D R, Walford E J, Jennings L C, Light G j, Schouseboe M I, Chershsky AY, et al. Use the poly-merase chain reaction to detect legionella DNA in urine and serum samples from patient with pneumonia. Clin Infect Dis. 1997;25(4):939.
Blazquez R M, Espinosa F J, Martinez-Toldos C M, Alemany L, Garcia-Orenes M C, Segovia M. Sensiti- vity of urinary antigen test in relation to clinical severity in a large outbreak of Legionella pneumonia in Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005;24(7): 488-91.
KO K S, Hong S K, Lee K H, Lee H K, Park M Y, Miyamoto H, et al. Detection and identification of legionella pneumophila by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J Microbial Methods. 2003; 54:325-337.
Murdoch D R. Diagnosis of legionella infection. Clin Infect Dis. 2003;36(1):64-9
Edelstein P H, Cianciotto N P. Legionella, Mandell G L, Dolin R, Bennette J E. 6th Editin, Published by Else-vier Churchill Livingstone, Philadelphia. 2005;p: 2239-51.
Fields B S, Benson R F, Besset R E. Legionella and Legionnaires' disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 2002;15(3):506-26.
Kim M J, Sohn J W, Park D W, Park S C, Chun B C. Characterization of a lipoprotein common to Legio-nella species as a urinary broad-spectrum antigen for diagnosis of Legionnaires' disease. J Clin Microbiol. 2003;41(7):2974-9.
Eisenberg V H, Eidelman L A, Arbel R, Ezra Y. Legionnaire's disease during pregnancy: a case presen-tation and review of the literature. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1997;72(1):15-8.
Vimercati A, Greco P, Bettocchi S, Resta L, Selvaggi L. Legionnaire's disease complicating pregnancy: a case report with intrauterine fetal demise. J Perinat Med. 2000;28(2):147-50.
Sambrook J, Russell DW. Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001;pp:6.28-6.30.
Nielsen K, Hindersson P, Hoiby N, Bangsborg J M. Sequencing of the rpoB Gene in Legionella pneu-mophila and Characterization of Mutations Associated with Rifampin Resistance in the Legionellaceae. Anti-microb Agents Chemother. 2000;44(10):2679-2683.
Sopena N, Pedro-botet M L, Sabria M, Garsia D. Comparative study of community-acquired pneumonia caused by streptococcus pneumoniae, legionella pneu-mophila or chlamydia pneumoniae. Scand J Infect Disease. 2004;36:330-334.
Welte T, Marre R, Suttorp N. What is new in the treatment of community-acquired pneumonia. Med Klin. 2006;101(4):313-20.
Huang H H, Zhang Y Y, Xiu Q Y, Zhou X, Huang S G, Lu Q, et al. Community-acquired pneumonia in Shanghai, China: microbial etiology and implications for empirical therapy in a prospective study of 389 patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2006;25(6): 369-74.
Al-Ali M K, Batchoun R G, Al-Nour T M. Etiology of community-acquired pneumonia in hospitalized patients in Jordan. Saudi Med J. 2006; 27(6):813-6.
Gaillac N, Floccard B, Ould T, Benatir F, Levrat A, Meunier P, et al. Legionella pneumophila pneumonia during pregnancy: a case report, J Infect. 2006;52(6): 63-4.
Su H P, Tseng L R, Chou C Y, Chung T C, Pan T M. Legionella pneumophila infection in the Taiwan area. J Infect Chemother. 2005;11(5):244-9.
حسینی دوست سید رضا، سیل دیوید. جداسازی لژیونلا از سیستم آب بیمارستانها (بخشهای پیوند عضو). مجله پزشکی کوثر. سال سوم(1377)، شماره سوم، صفحات150-145.
خسرو شاهی نادر، موسویان مجتبی. جداسازی و تعیین هویت عوامل بیماری لژیونر از تجهیزات درمانی و منابع محیطی، مجله دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی- درمانی قزوین. 1382، شماره 29، صفحات 74-70.