Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

The Relationship between Polymorphisms of Blood Coagulation Factor V Gene and Recurrent Pregnancy Losses

Authors
Raheleh Torabi 1
Mahyar Ostad Karampour 2
Afsaneh Mohammadzadeh 3
Soheila Arefi 3
Mohammad Keramatipour 4
Saeed Zarei 2
Hojjat Zeraati 5
Mahmood Jeddi-Tehrani 2
1 Faculty of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
3 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
4 Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran
5 Department of Epidemiology and Biostatistics, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Polymorphisms of coagulation factor V gene are the most important suspected causes of thrombophilia in women with recurrent pregnancy losses (RPL). In this study the association between three polymorphisms of factor V (FV Leiden, FV A4070G & FV A5279G) and RPL are sought in Iranian women.Materials & Methods: In this case-control study, 100 female patients with at least two recurrent abortions were selected as the cases, and 100 healthy women with a history of two successful deliveries as the controls. Peripheral blood samples were collected and DNA was extracted. PCR-RFLP method was used for genotyping the samples.Results: Regarding the prevalence of FV Leiden mutation in the cases and the controls, 13% and 4% respectively, the chances for recurrent pregnancy losses were more than 3.5 times higher in individuals with this polymorphism (OR: 3.586, 95% CI: 1.127–11.412). The frequencies of FV A4070G and FV A5279G were 14% and 37% in the case and 4% and 7% in the control groups, respectively and the chances for RPL were higher in cases with these two polymorphisms. The proportion of cases with two or three mutations in the gene in comparison with the controls, showed a significant correlation between FV Leiden and FV A4070G polymorphisms. Statistical analysis of the simultaneous effects of the three polymorphisms for RPL showed that evaluation of FV A4070G and FV A5279G could help assess the chances of the three mutations for RPL.Conclusion: The three polymorphisms in coagulation V gene are accompanied with increased risks for RPL. Evaluation for the three polymorphisms is suggested in the work up of women with RPL.
Keywords
Blood coagulation factor V
FV A4070G
FV A5279G
FV Leiden
Polymorphism
Recurrent Pregnancy Loss
Thrombophilia

زمینه و هدف

سندرم سقط مکرر خودبخودی (RPL) اغلب به صورت دو یا بیش از دو سقط متوالی پیش از هفته 20 بارداری تعریف می‌شود (1،2). سقط مکرر بر دو نوع اولیه ثانویه است. در نوع اولیه، بلافاصله چند سقط متوالی رخ می‌دهد ولی در نوع ثانویه، پس از یک بارداری موفق، سقط‌های متوالی آغاز می‌شوند (4-1). اغلب از سقط مکرر به عنوان بیماری چند عاملی نام برده می‌شود که یکی از این عوامل، ترومبوز است. به نظر می‌رسد ترومبوز می‌تواند در مویرگ‌های جفت باعث اختلال در روند گردش خون بین مادر و جنین شده و نهایتاً منجر به سقط جنین گردد. از طرف دیگر در طول بارداری، در نتیجه افزایش پیش فاکتورهای انعقادی و کاهش سطح عوامل ضد انعقادی به طور طبیعی حالت پیش انعقادی ایجاد می‌شود (3،4). اخیراً با مطالعات صورت گرفته مشخص شده که وجود زمینه ژنتیکی ترومبوفیلی با سقط مکرر ارتباط دارد. ارتباط بین سقط مکرر و ترومبوفیلی، موضوع بسیار بحث برانگیزی است که مطالعات بسیاری روی آن صورت گرفته و نتایج متناقضی در تأیید و رد آن بدست آمده است (3).

فاکتور 5 انعقادی، نقشی اساسی در تنظیم هموستاز مسیرهای انعقادی بر عهده دارد. جهش نقطه‌ای G1691A در ژن فاکتور5 انعقادی که فاکتور ترومبوفیلیک لیدن (FVL) نامیده می‌شود و باعث حذف یک جایگاه شکست در فاکتور 5 انعقادی شده و در نتیجه با اثر بر عملکرد کمپلکس ترومبیناز، باعث مقاومت فاکتور 5 انعقادی به پروتئین C فعال شده (APCR) می‌شود (29)، با سقط مکرر ارتباط دارد

(3،5). پلی‌مورفیسم FV Leiden منجر به افزایش خطر سقط جنین در افراد ناقل این پلی‌مورفیسم تا سه برابر (از 6 تا 16%) افراد سالم می‌شود (3). گرچه مطالعات بسیاری افزایش خطر سقط مکرر را در زنان دارای این پلی‌مورفیسم تأیید کرده‌اند (16-5، 3)، ولی در برخی مطالعات ارتباط این پلی‌مورفیسم با سقط مکرر رد شده است (25-17).

پلی‌مورفیسم His1299Arg فاکتور 5 انعقادی، که با نام هاپلوتیپ HR2 (R2) نیز شناخته می‌شود، در نتیجه جهش A4070G در ژن فاکتور 5 انعقادی ایجاد می‌شود. این پلی‌مورفیسم با اثر بر روی کمپلکس ترومبیناز به واسطه افزایش فرمی از فاکتور 5 انعقادی (FVa1) که به شکل محدودی به فسفولیپید متصل می‌شود، باعث کاهش فعالیت فاکتور 5 و کاهش غلظت آنتی‌ژن فاکتور 5 فعال می‌گردد (31-26، 11،23). افراد حامل پلی‌مورفیسم FV A4070G فاکتور 5 انعقادی دارای APCR و افزایش خطر ترومبوز وریدی هستند. بنابراین، اثر کلی این پلی‌مورفیسم به صورت فاکتور خطر ترومبوتیک است (32،30-26). بین پلی‌مورفیسم FV A4070G با دیگر پلی‌مورفیسم‌های فاکتور 5 انعقادی، از نظر آماری پیوستگی قابل قبول وجود دارد. در مطالعه‌ای روی بیماران مبتلا به ترومبوز وریدی، مشاهده شد که حاملان پلی‌مورفیسم FV A4070G، از سطح فاکتور 5 انعقادی در حال گردش کمتری برخوردار هستند (33). افزایش خطر ابتلا به ترومبوز وریدی در افراد حامل این پلی‌مورفیسم، تا 8/1 برابر خواهد بود (16). با این حال، به طور کلی ارتباط پلی‌مورفیسم FV A4070G با افزایش خطر ابتلا به ترومبوز وریدی و کاهش سطح فاکتور 5 انعقادی، تأیید نشده است. داشتن پلی‌مورفیسم FV A4070G

با APCR و افزایش سطح ایزوفرم ترومبوژنیک فاکتور 5 انعقادی (FV1) (فاکتور 5 انعقادی دارای دو ایزوفرم FV1 و FV2 است که متناسب با شرایط، نسبت یکی به دیگری در پلاسما تغییر می‌کند) در پلاسما نیز ارتباط دارد (26). گزارش شده که این پلی‌مورفیسم خطر

ترومبوز وریدی را در ناقلان آلل FV Leiden افزایش می‌دهد. در برخی مطالعات دیگر، ارتباطی بین پلی‌مورفیسم FV A4070G و سقط مکرر دیده نشده، ولی مشاهده شده که توارث همزمان پلی‌مورفیسم

FV A4070G و FV Leiden می‌تواند باعث افزایش خطر سقط مکرر گردد (23). در تحقیقات دیگری نیز نشان داده شده که هموزیگوت بودن برای پلی‌مورفیسم FV A4070G می‌تواند خطر سقط مکرر را افزایش‌ دهد (5).

پلی‌مورفیسم جدیدی نیز در دومین A3 در ژن فاکتور5 انعقادی به نام FV A5279G گزارش شده که باعث جایگزینی اسیدآمینه تیروزین با سیتوزین در جایگاه اسیدآمینه‌ای 1702 می‌شود (29،34). در ناقلان این پلی‌مورفیسم تغییری در بیان mRNA ژن فاکتور v ایجاد نمی‌شود ولی به دلیل این جایگزینی اسید آمینه‌ای، باعث کاهش پایداری پروتئین می‌شود و لذا دارای سطح فاکتور 5 انعقادی کاهش یافته‌اند (29). کمبود فاکتور 5 انعقادی به علت این پلی‌مورفیسم، می‌تواند منجر به ایجاد خطر ترومبوتیک در خانواده‌ها گردد (35-33، 29). مطالعاتی وجود دارند که ارتباط این پلی‌مورفیسم را با افزایش خطر ترومبوز و نقص فاکتور 5 انعقادی و سندرم سقط مکرر تأیید می‌کنند (23،32). ولی به طور کلی، مطالعات بسیار اندکی روی ارتباط دو پلی‌مورفیسم FV A4070G و FV A5279G و سقط مکرر انجام شده است. لذا با توجه به اهمیت و نقش فاکتور 5 در هموستاز انعقاد خون، اثرات پلی‌مورفیسم‌های آن در افزایش خطر ترومبوز و نیز ارتباط ترمبوز با افزایش احتمال سقط مکرر، در مطالعه حاضر ما ارتباط سه پلی‌مورفیسم فاکتور 5 انعقادی (FV Leiden، FV A4070G و FV A5279G) را با سقط مکرر بررسی و مورد مطالعه قرار می‌دهیم.

روش بررسی

1- انتخاب گروه بیماران و گروه کنترل: 100 نفر از بین زنان مبتلا به سندرم سقط مکرر خودبخودی (داشتن سابقه حداقل دو یا بیش از دو سقط مکرر) مراجعه‌کننده در سال 1385 به مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا انتخاب شدند. معیار خروج از مطالعه، وجود ناهنجاری‌های آناتومیک، اختلالات هورمونی، بیماری‌های خودایمنی و عفونت تایید شده دستگاه تناسلی بود. 100 خانم بدون سابقه سقط و دارای حداقل دو باروری موفق، به عنوان گروه شاهد انتخاب شدند. سن گروه بیماران بین 45-25 (به طور متوسط 33 سال) و تعداد سقط‌های مکرر بین 6-3

(به طور متوسط 4) بود. در انتخاب گروه کنترل سعی شده است که از نظر مشخصات دموگرافیک با گروه بیمار تفاوت چندانی نداشته باشند. تعداد بارداری‌های موفق افراد این گروه بین 4-2 (به طور متوسط 2) عدد بود. به منظور نمونه‌گیری خون و انجام طرح، از کمیته اخلاق در پژوهش‌های پزشکی پژوهشگاه فن‌آوری‌های نوین علوم پزشکی جهاد دانشگاهی‌ـ ابن‌سینا، مجوز لازم اخذ و از تمام افراد مورد مطالعه، رضایت‌نامه آگاهانه دریافت شد.

2- بررسی ژنوتیپ: از هر فرد ml5 خون در حضور ضد انعقاد EDTA دریافت و استخراج DNA به روش Salting Out با استفاده از پروتئیناز K انجام شد.

ابتدا واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) برای هر جفت پرایمر بهینه‌سازی شد (جدول 1). مواد مؤثره در هر واکنش PCR شامل µl5/2 بافر (10X) PCR (3/8pH=)، lµ1 از هر دو جفت پرایمر (Mµ10)، lµ2/0DNA Taq پلی‌مراز (lµU/5) (Roche, Germany)، lµ1 dNTP (mM10) و lµ1 DNA بود. برای هر ست پرایمر

FV Leiden، FV A4070G و FV A5279G، به ترتیب lµ4،lµ2 و lµ1، MgCl2 (mM25) در حجم نهایی lµ25

استفاده شد. سپس PCR برای هر سه جفت پرایمر برای بررسی سه پلی‌مورفیسم فاکتور 5، به ترتیب ذیل بر روی نمونه‌های DNA دو گروه بیمار و شاهد انجام شد. پس از دناتوره کردن در C94 به مدت 5 دقیقه، قطعات DNA به ترتیب ذیل تکثیر یافتند: برای پلی‌مورفیسم FV Leiden، تعداد 40 سیکل (C94 به مدت 30 ثانیه، C7/50 به مدت 30 ثانیه و C72 به مدت 30 ثانیه)، برای پلی‌مورفیسم FV A4070G، تعداد 35 سیکل (C91 به مدت 1 دقیقه، C60 به مدت

1 دقیقه و C71 به مدت 2 دقیقه) و برای پلی‌مورفیسم FV A5279G، تعداد 35 سیکل (C94 به مدت 30 ثانیه، C64 به مدت 30 ثانیه و C72 به مدت 30 ثانیه) و به دنبال آنها مرحله طویل‌سازی نهایی، C72 به مدت

7 دقیقه انجام شد.

صحت انجام PCR با انجام الکتروفورز برای محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 5/1% پس از رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید، زیر نور UV تأیید شد. RFLP بر روی محصولات PCR پرایمرهای سه پلی‌مورفیسم

FV G1691A (FV Leiden)، FV A4070G و

FV A5279G به ترتیب توسط آنزیم‌های محدودکننده Mnl1، Rsa1 و Acc1 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) انجام شد. محصول PCR برای پرایمرهای FV Leiden، باندی bp140 است که برای آلل نرمال، دو جایگاه شکست و برای آلل جهش یافته، یک جایگاه دارد. پس از RFLP توسط آنزیم Mnl1 (New England Biolabs)، آلل نرمال سه قطعه bp69، bp36 و bp35 و آلل جهش یافته دو قطعه bp69 و bp71 را ایجاد می‌کنند. در مورد FV A4070G، محصول PCR باندی bp1568 است که پس از RFLP با آنزیم Rsa1 (New England Biolabs)، آلل 4070A، ‌دو باند bp1438 و bp130 و آلل 4070G، سه باند bp862 ، bp576 و bp130 را ایجاد می‌کند. باند محصول PCR برای FV A5279G نیز bp120 بوده که در آلل جهش یافته، جایگاه شکست برای آنزیم Acc1 (New England Biolabs) از بین رفته و بدون شکست باقی می‌ماند؛ در حالی که در آلل طبیعی با ایجاد شکست، دو قطعه bp15 و bp105 ایجاد می‌شود. برای بررسی محصولات PCR پس از RFLP، از الکتروفورز بر روی ژل پلی‌آکریلامید با رنگ‌آمیزی نیترات نقره برای مقایسه دقیق طول باندها استفاده شد. با توجه به نتایج مشاهده شده بر روی ژل پلی‌آکریلامید، ژنوتیپ هر فرد برای هر پلی‌مورفیسم مشخص شد.

3- بررسی‌های آماری: اطلاعات حاصل توسط نرم‌افزار SPSS (Ver.13.0) بررسی شد. چگونگی وقوع این پلی‌مورفیسم به سه حالت نرمال، هتروزیگوت و هموزیگوت در دو گروه بیمار و شاهد با استفاده از آزمون من‌ـ‌ ویتنی بررسی شد. آزمون همبستگی اسپیرمن نیز برای بررسی امکان وجود ارتباط متقابل بین این سه پلی‌مورفیسم انجام شد. نتایج برای این دو آزمون با 05/0>p معنی‌دار تلقی گردیدند. جهت بررسی اثر هر پلی‌مورفیسم بر وقوع سقط مکرر، از مدل رگرسیون لجستیک یک متغیره استفاده شد. سپس جهت بررسی اثر همزمان موتاسیونها بر شانس وقوع سقط مکرر، از مدل رگرسیون لجستیک چندگانه به روش

پس رو بکار رفت.

نتایج

با توجه به نتایج مشاهده شده بر روی ژل پلی‌آکریلامید، افراد به سه دسته سالم، هتروزیگوت و هموزیگوت برای هر پلی‌مورفیسم تقسیم‌بندی شدند (تصاویر 3-1). در گروه بیماران برای سه پلی‌مورفیسم FV Leiden ، FV A4070G و FV A5279Gبه ترتیب 12، 12 و 36 نفر فرد هتروزیگوت و 1، 2 و 1 فرد هموزیگوت دیده شد. در مقابل در گروه کنترل تنها 4،

4 و 7 فرد هتروزیگوت مشاهده و هیچ فرد هموزیگوتی تشخیص داده نشد. فراوانی افراد واجد هر یک از سه پلی‌مورفیسم با گروه سالم، دارای تفاوت معنی‌داری بوده و هر سه پلی‌مورفیسم با افزایش خطر سندرم سقط مکرر ارتباط دارند: (022/0p-valueFV Leiden=)، (001/0>p-valueFV A5279G) و (036/0p-valueFV A4070G=) (جدول2).

همچنین با ادغام دو گروه هتروزیگوت و هموزیگوت، گروهی تحت عنوان گروه واجد موتاسیون بدون توجه به نوع موتاسیون، ایجاد شده و با استفاده از مدل لجستیک رگرسیون تک متغیره، به تفکیک هر سه موتاسیون ملاحظه شد که p-value برای هر سه معنی‌دار بوده و شانس وقوع سقط مکرر به علت حضور هر پلی‌مورفیسم محاسبه شد (جدول 3). محاسبات نشان داد شانس وقوع سقط مکرر در صورت وجود پلی‌مورفیسم FV Leiden، 56/3 برابر

(412/11-127/1, 95% CI: 56/3OR FV Leiden:)، پلی‌مورفیسم FV 4070G 273/3 برابر

(523/10-018/1,95% CI: 273/3OR FV A4070G:) و پلی‌مورفیسم FV A5279G، 803/7 برابر (603/18-273/3),95% CI: 7803/7OR FV A5279G:) می‌شود.

از 100 فرد بیمار، 10 نفر واجد هر دو موتاسیون

FV Leiden و FV A4070G، 4 نفر دارای دو پلی-‌مورفیسم FV Leiden و FV A5279G، 3 نفر دارای دو پلی‌مورفیسم FV A4070G و FV A5279G و 3 نفر واجد هر سه موتاسیون بودند. در گروه کنترل تنها 1 فرد دارای FV Leiden و FV A5279G مشاهده شد.

با استفاده از مدل لجستیک چندگانه به روش پس‌رو مشخص شد که در صورت وجود همزمان این سه پلی‌مورفیسم در یک فرد، دو پلی‌مورفیسم

FV A4070G (111/13-177/1,95% CI:928/3OR:) و FV A5279G (794/19-436/395% CI: ، 246/8OR:) هر کدام با اثری مجزا باعث افزایش ریسک وقوع سقط مکرر می‌شوند و FV Leiden (به علت ایجاد اثر همراه با FV A4070G) از مدل خارج می‌شود. بدین معنا

که شانس وقوع سقط مکرر را می‌توان با ارزیابی

دو پلی‌مورفیسم FV A4070G و FV A5279G

مشخص کرد.

براساس آزمون همبستگی اسپیرمن، تنها بین دو پلی‌مورفیسم FV Leiden و FV A4070G ارتباط متقابل دیده شد (001/0 p<)

بحث

در این مطالعه فراوانی سه پلی‌مورفیسم ژن فاکتور 5 انعقادی شامل FV G1691A (FV Leiden)،

FV A4070G و FV A5279G در زنان ایرانی مبتلا به سندرم سقط مکرر خودبخودی، مورد مطالعه قرار گرفت. این سه پلی‌مورفیسم را عامل نقص در فاکتور 5 انعقادی و ایجادکننده ترومبوفیلی می‌دانند؛ اما تنها در مورد FV Leiden نتایج مطالعات وسیعی در دسترس است. مطالعات بسیاری وجود دارند که این پلی‌مورفیسم را عامل افزایش خطر سقط مکرر معرفی کرده‌اند در حالی که گزارشات دیگری وجود دارند که ارتباط بین این پلی‌مورفیسم و سقط مکرر را نفی کرده‌اند. این اختلاف می‌تواند به علت تفاوتها در معیار انتخاب بیماران و گروه شاهد باشد.Rai و همکاران و نیز Nowak-Gottl و همکاران، با مطالعه روی زنان مبتلا به سقط مکرر، هیچ افزایش فراوانی موتاسیون فاکتور 5 انعقادی را نسبت به گروه کنترل مشاهده نکردند (19،22). به علاوه، Yamada و همکاران در یافتند که هیچ کدام از 35 زن مبتلا به سقط مکرر مورد مطالعه ناقل موتاسیونFV Leiden نیستند. اخیراً Wramsby و همکاران فراوانی 5/15% موتاسیون

FV Leiden را در بین زنان با سه یا بیش از سه سقط قبل از هفته 22 را گزارش کرده‌اند (7). پس از ارزیابی مقایسه‌ای با خارج کردن دیگر عوامل سقط مکرر، فراوانی آن به 8/27% رسید. قابل ذکر است کهRai و همکاران، فراوانی FV Leiden را با انتخاب 1000 زن مبتلا به سقط مکرر، که تاکنون بزرگترین گروه بیمار مورد مطالعه است، 3/3% در بین زنان با سقط مکرر در سه ماهه اول و 9/3% در بین زنان با سقط مکرر در سه ماهه دوم در مقایسه با فراوانی 4% در گروه کنترل را مشاهده کردند. از سوی دیگر،Rai و همکاران با ارزیابی نتایج آینده‌نگرانه بارداری‌های درمان نشده 25 زن هتروزیگوت برای آلل FV Leiden و مبتلا به سقط مکرر، در مقایسه با زنانی با همان سابقه بارداری ولی فاقد موتاسیون FV Leiden، مشاهده کرد که نرخ تولد زنده در گروه اول کمتر از گروه دوم است (5/37% در مقابل 3/69%). این نتایج نشان می‌دهد که توارث آلل

FV Leiden می‌تواند منجر به سقط مکرر شود، به خصوص اگر با ترومبوز جفت همراه باشد (19). Glueck و همکاران نیز فراوانی بالاتر آلل FV Leiden را در بین زنان مبتلا به سقط مکرر گزارش کرد (1/11%) (13). همین گروه در مطالعه‌ای از بین 16 بیمار مبتلا به سقط مکرر، در 19% آنها پلی‌مورفیسم

FV Leiden را مشاهده کردند، در حالی که تنها در 6% از گروه کنترل این پلی‌مورفیسم دیده شد (12). در گزارش دیگری، از 44 زن با سابقه بیش از سه سقط مکرر خودبخودی، 9 نفر (5/21%) دارای پلی‌مورفیسم FV Leiden بودند، در مقابل تنها 4/7% از افراد گروه کنترل واجد این پلی‌مورفیسم بودند (3). در مطالعه‌ای دیگر بر روی 49 زن مبتلا به سقط مکرر، مشاهده شد که خطر حداقل دو سقط یا مشکلات باروری دیگر، تا 2/2 برابر افزایش می‌یابد (10). در مقابل، در مطالعه‌ای بر روی 714 بیمار دارای حداقل دو سقط مکرر، افزایش فراوانی پلی‌مورفیسم FV Leiden در سقط مکرر مشاهده نشد (36). ژن فاکتور 5 انعقادی به صورت هم غالبی بیان می‌شود. 95-90% افراد دارای موتاسیون FV Leiden، هتروزیگوت و باقی هموزیگوت بودند. در مطالعه‌ای در سوئد روی 306 فرد دارای این موتاسیون، نشان داده شد که تا سن 33 سالگی 40% افراد هموزیگوت دچار عوارض ترومبوتیک شدند، در حالی که این مورد تنها در 20% افراد هتروزیگوت دیده شده است. اطلاعات بدست آمده از مطالعات ترومبوفیلی لیدن نشان داده که بیماران FV Leiden، 6/6 برابر افراد عادی در معرض خطر ترومبوز بوده و این افزایش خطـر، در افـراد هموزیگـوت به طور محسوسی بیش از

افراد هتروزیگوت دیده می‌شود (37،38).

در مطالعه حاضر، فراوانی موتاسیون FV Leiden در بین گروه بیماران 13% و در گروه کنترل 4% بود (جدول2). فراوانی این موتاسیون در مطالعه زینعلی و همکاران در جمعیت ایرانی، 5/5% گزارش شده است (39) که کمتر از فراوانی این موتاسیون در بین گروه بیماران مطالعه حاضر است. فراوانی 1/7% و 17% برای بیماران مبتلا به سقط مکرر به ترتیب در زنان برزیلی و امریکایی گزارش شده است (16). نتایج مطالعه حاضر که فراوانی 13% برای این موتاسیون را نشان داده است، نسبت به مطالعه دیگری که در بین 65 زن مبتلا به سقط مکرر در جمعیت ایرانی انجام شده و نتیجه 20% (13 نفر از 65) را مشاهده کرده، کمتر است (16). این تفاوت می‌تواند مربوط به اختلاف در تعداد افراد گروه بیمار مورد مطالعه و نیز تفاوت در معیارهای ورود به مطالعه باشد. با این حال، نتایج حاضر نیز ارتباط بین موتاسیون FV Leiden و سقط مکرر را تأیید می‌کند و نشان می‌دهد در حضور این موتاسیون، خطر ابتلا به سقط مکرر تا 56/3 برابر بیشتر خواهد شد. تعداد بسیار اندک افراد هموزیگوت مشاهده شده برای این پلی‌مورفیسم در این مطالعه (در گروه بیمار، تنها 1 نفر بوده و موردی نیز در گروه کنترل دیده نشد) و نیز مطالعات دیگر روی جمعیت ایرانی و بسیاری دیگر از مطالعات در سایر جمعیتها می‌تواند ناشی از عوارض شدید ترومبوتیک حاصل از هموزیگوسیتی برای این پلی‌مورفیسم در مادران و نیز جنین‌های آنان باشد. بدین معنا که به نظر می‌رسد هموزیگوسیتی برای

FV Leiden می‌تواند مانع رگ‌زایی صحیح برای جفت شده و لذا باعث سقط زودرس جنین دو یا سه هفته پس از لقاح شود (5،9،13،40،41). همچنین گزارشاتی وجود دارند که عدم موفقیت IVF را با هموزیگوسیتی برای این پلی‌مورفیسم مرتبط دانسته‌اند (42).

فراوانی پلی‌مورفیسم FV A4070G در بین اقوام مختلف 2/15-5/9% گزارش شده است (43). فراوانی این آلل در جمعیت ایتالیایی، 8% ذکر شده است (28). در مطالعه‌ای در لبنان در سال 2005، از 125 نفر، 13 نفر (4/10%) دارای این آلل بودند که در بین آنها 11 نفر (8/8%) هتروزیگوت و 2 نفر (6/1%) هموزیگوت بودند. در این مطالعه، فراوانی بالای این موتاسیون در این جمعیت گزارش شد (26). در مطالعه‌ای در بین جمعیت عرب در کشور کویت، درصد فراوانی این آلل در بین بیماران مبتلا، 5/16% بوده و خطر ابتلا به ترومبوز وریدی، 62/2 برابر نرخ جهانی گزارش شده است. در این مطالعه از 188 بیمار، 31 نفر (5/16%) و از 100 فرد گروه کنترل، 7 نفر (7%) حامل این آلل بودند (26).

Goodman و همکاران و Zammiti و همکاران، در دو مطالعه جداگانه، ارتباط این پلی‌مورفیسم را با سقط مکرر بررسی کردند (0001/0> p و 83/0p=) (5،11). Zammiti و همکاران، گرچه ارتباط وجود این پلی‌مورفیسم را با سقط مکرر رد کرده‌اند؛ ولی ارتباط هموزیگوسیتی آن را با افزایش خطر سقط مکرر پس از 8 هفته از بارداری را تأیید می‌کنند (0002/0p=).

در مطالعه حاضر، فراوانی 14% برای پلی‌مورفیسم

FV A4070G در بین بیماران و 4% برای گروه شاهد مشاهده شد، که به نتایج مطالعات بالا نزدیک است. براساس نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر، این پلی‌مورفیسم با سقط مکرر ارتباط داشته (047/0p=) و خطر ابتلا به سقط مکرر در حضور این موتاسیون، 273/3 برابر خواهد شد؛ که با نتایج مطالعه Goodman و همکاران همخوانی دارد.

از آن جا که پلی‌مورفیسم FV A5279G، اخیراً گزارش شده است، لذا مطالعات محدودی در مورد ارتباط و نحوه عملکرد و اثر آن بر نقص فاکتور 5 انعقادی و ترومبوز انجام گرفته است. تحقیقات انگشت‌شماری نیز در مورد ارتباط آن با سقط مکرر وجود دارد؛ بنابراین امکان کمتری برای مقایسه نتایج وجود دارد. به هرحال، در مطالعه‌ای در جمعیت ایتالیایی، ارتباط FV A5279G با افزایش خطر ترومبوز و نقص فاکتور 5 انعقادی تأیید شده است (34). در این مطالعه، ناقل بودن برای

FV A5279G در 8 بیمار مبتلا به نقص فاکتور 5، در 16 فرد مبتلا به نقص جزئی فاکتور 5 انعقادی بدون علامت و در 9 بیمار مبتلا به APCR شبه هموزیگوت بررسی شد. نتیجه بدست آمده نشان داد که

FV A5279G یکی از عوامل مهم نقص فاکتور 5 انعقادی و ترومبوز است (34). در دو مطالعه‌ای که اخیراً انجام شده، ارتباط بین این موتاسیون و سقط مکرر را تأیید نکرده‌اند (5،11)؛ در حالی که در مطالعه حاضر، فراوانی این موتاسیون 37% و افزایش خطر 803/7 برابری بدست آمد که در مقایسه با دو موتاسیون دیگر، بسیار بیشتر بود. این تفاوت می‌تواند ناشی از تفاوت ژنتیکی جمعیت ایرانی با دو جمعیت مورد مطالعه در این دو تحقیق باشد.

با توجه به مطالعات مختلف که روی جمعیت‌های متفاوتی انجام گرفته است و نتایج متفاوتی را در تأیید یا رد ارتباط این سه پلی‌مورفیسم فاکتور 5 انعقادی با سقط مکرر را گزارش کرده‌اند، ترکیب ژنی زنان ایرانی (ژنوتیپ) هم ممکن است با زنان برخی ملل متفاوت باشد، ولی این مطالعه نشان می‌دهد که ارتباط موتاسیون ژن‌های فاکتور 5 انعقادی با سقط مکرر در زنان ایرانی نیز مثل برخی از ملل دیگر است (5،11).

در این دو مطالعه، به طور همزمان این سه پلی‌مورفیسم مورد بررسی قرار گرفته‌اند. Goodman و همکاران، ارتباط دو پلی‌مورفیسم FV Leiden و FV A4070G را با سقط مکرر تأیید کرده‌اند (11)؛ در حالی که Coulam و همکاران، ارتباط هر سه پلی‌مورفیسم را با سقط مکرر رد می‌کنند (23)؛ ولی در عین حال، وجود هر سه پلی‌مورفیسم به طور همزمان در یک فرد را بر افزایش خطر سقط مکرر مؤثر نشان داده‌اند (23).

در مطالعه حاضر مشخص شد که احتمالاً به علت وجود همراهی بین دو پلی‌مورفیسم FV Leiden و

FV A4070G که در بخش نتایج به آن اشاره شد، این دو پلی‌مورفیسم با هم یک اثر همزمان را بر شانس وقوع سقط مکرر ایجاد می‌کنند. بدین معنا که در صورت وجود همزمان این دو پلی‌مورفیسم در یک فرد، تنها با بررسی پلی‌مورفیسم FV A4070G می‌توان به اثر هر دو پلی‌مورفیسم پی برد. بنابراین وجود هر سه موتاسیون با افزایش خطر وقوع سقط مکرر ارتباط دارد و لذا با بررسی دو موتاسیون FV A4070G و

FV A5279G هنوز می‌توان اثر همزمان هر سه موتاسیون فاکتور 5 انعقادی را بر شانس وقوع سقط مکرر ارزیابی کرد.

نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر، می‌توان گفت که موتاسیون‌های فاکتور5 انعقادی می‌توانند نقشی مؤثر در افزایش خطر ابتلا به سقط مکرر در زنان ایرانی داشته باشند. بنابراین می‌توان با تأیید حضور این موتاسیونها در زنان ایرانی، احتمال خطر برای سقط مکرر را مشخص کرد. لذا، بررسی این موتاسیونها در زنان ایرانی مبتلا به سندرم سقط مکرر، می‌تواند راهگشا باشد.

تشکر و قدردانی

این طرح با حمایت مالی پژوهشگاه فن‌آوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا براساس مصوبه شماره 439013 مورخ 17/10/1384 انجام گرفته است. نویسندگان این طرح، از تمامی همکاران پژوهشکده آنتی‌بادی مونوکلونال و مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا که در اجرای این پروژه و پیشبرد اهداف طرح نقش مؤثر داشته‌اند، کمال تشکر را دارد.

  1. Tulppala M, Ylikorkala O. Recurrent spontaneous abortion: where do we stand now? Ann Med. 1991; 23(6): 603-4.
  2. Tulppala M, Palosuo T, Ramsay T, Miettinen A, Salonen R, Ylikorkala O. A prospective study of 63 couples with a history of recurrent spontaneous abor-tion: contributing factors and outcome of subsequent pregnancies. Hum Reprod. 1993; 8(5): 764-70.
  3. Glueck CJ, Gogenini S, Munjal J, Tracy T, Pranikoff J, Wang P. Factor V Leiden mutation: a treatable etiology for sporadic and recurrent pregnancy loss. Fertil Steril. 2008; 89(2): 410-6.
  4. Baek KH, Lee EJ, Kim YS. Recurrent pregnancy loss: the key potential mechanisms. Trends Mol Med. 2007; 13(7): 310-7.
  5. Zammiti W, Mtiraoui N, Mercier E, Abboud N, Saidi S, Mahjoub T, et al. Association of factor V gene polymorphisms (Leiden; Cambridge; Hong Kong and HR2 haplotype) with recurrent idiopathic pregnancy loss in Tunisia. A case-control study. Thromb Haemost. 2006; 95(4): 612-7.
  6. Younis JS, Brenner B, Ohel G, Tal J, Lanir N, Ben-Ami M. Activated protein C resistance and factor V Leiden mutation can be associated with first-as well as second-trimester recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol. 2000; 43(1): 31-5.
  7. Wramsby ML, Sten-Linder M, Bremme K. Primary habitual abortions are associated with high frequency of factor V Leiden mutation. Fertil Steril. 2000; 74(5): 987-91.
  8. Wolf CE, Haubelt H, Pauer HU, Hinney B, Krome-Cesar C, Legler TJ, et al. Recurrent pregnancy loss and its relation to FV Leiden, FII G20210A and poly-morphisms of plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003; 33(3): 134-7.
  9. Pauer HU, Voigt-Tschirschwitz T, Hinney B, Burfeind P, Wolf C, Emons G, et al. Analyzes of three common thrombophilic gene mutations in German women with recurrent abortions. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003; 82(10): 942-7.
  10. Hopmeier P, Puehringer H, van Trotsenburg M, Atamaniuk J, Oberkanins C, Dossenbach-Glaninger A. Association of endothelial protein C receptor haplo-types, factor V Leiden and recurrent first trimester pregnancy loss. Clin Biochem. 2008; 41(12): 1022-4.
  11. Goodman CS, Coulam CB, Jeyendran RS, Acosta VA, Roussev R. Which thrombophilic gene mutations are risk factors for recurrent pregnancy loss? Am J Reprod Immunol. 2006; 56(4): 230-6.
  12. Glueck CJ, Wang P, Bornovali S, Goldenberg N, Sieve L. Polycystic ovary syndrome, the G1691A factor V Leiden mutation, and plasminogen activator inhibitor activity: associations with recurrent preg-nancy loss. Metabolism. 2003; 52(12): 1627-32.
  13. Glueck CJ, Pranikoff J, Aregawi D, Haque M, Zhu B, Tracy T, et al. The factor V Leiden mutation, high factor VIII, and high plasminogen activator inhibitor activity: etiologies for sporadic miscarriage. Metabol-ism. 2005; 54(10): 1345-9.
  14. Foka ZJ, Lambropoulos AF, Saravelos H, Karas GB, Karavida A, Agorastos T, et al. Factor V leiden and prothrombin G20210A mutations, but not methylen-etetrahydrofolate reductase C677T, are associated with recurrent miscarriages. Hum Reprod. 2000; 15(2): 458-62.
  15. Foka ZJ, Lambropoulos AF, Makris PE, Constan-tinidis TC, Kotsis A. High frequency of factor V Leiden and prothrombin G20210A mutations in Greek hemophiliacs. J Thromb Haemost. 2003; 1(5): 1116-7.
  16. Behjati R, Modarressi MH, Jeddi-Tehrani M, Dokoohaki P, Ghasemi J, Zarnani AH, et al. Thrombo-philic mutations in Iranian patients with infertility and recurrent spontaneous abortion. Ann Hematol. 2006; 85(4): 268-71.
  17. Yamada H, Sata F, Saijo Y, Kishi R, Minakami H. Genetic factors in fetal growth restriction and miscar-riage. Semin Thromb Hemost. 2005; 31(3): 334-45. Review.
  18. Raziel A, Kornberg Y, Friedler S, Schachter M, Sela BA, Ron-El R. Hypercoagulable thrombophilic defects and hyperhomocysteinemia in patients with recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol. 2001; 45(2): 65-71.
  19. Rai R, Shlebak A, Cohen H, Backos M, Holmes Z, Marriott K, et al. Factor V Leiden and acquired activated protein C resistance among 1000 women with recurrent miscarriage. Hum Reprod. 2001; 16(5):961-5.
  20. Pihusch R, Buchholz T, Lohse P, Rübsamen H, Rogenhofer N, Hasbargen U, et al. Thrombophilic gene mutations and recurrent spontaneous abortion: pro-thrombin mutation increases the risk in the first trimester. Am J Reprod Immunol. 2001; 46(2): 124-31.
  21. Ozcan T, Rinder HM, Murphy J. Genetic throm-bophilia mutations are not increased in patients with recurrent losses. Obstet Gynecol. 2001; 97(4 Suppl 1): S31.
  22. Nowak-G?ttl U, Sonntag B, Junker R, Cirkel U, von Eckardstein A. Evaluation of lipoprotein(a) and genetic prothrombotic risk factors in patients with recurrent foetal loss. Thromb Haemost. 2000; 83(2): 350-1.
  23. Coulam CB, Jeyendran RS, Fishel LA, Roussev R. Multiple thrombophilic gene mutations rather than specific gene mutations are risk factors for recurrent miscarriage. Am J Reprod Immunol. 2006; 55(5): 360-8.
  24. Carp H, Salomon O, Seidman D, Dardik R, Rosenberg N, Inbal A. Prevalence of genetic markers for thrombo-philia in recurrent pregnancy loss. Hum Reprod. 2002; 17(6): 1633-7.
  25. Alonso A, Soto I, Urgellés MF, Corte JR, Rodr?guez MJ, Pinto CR. Acquired and inherited thrombophilia in women with unexplained fetal losses. Am J Obstet Gynecol. 2002; 187(5): 1337-42.
  26. Strey RF, Siegemund A, Siegemund T, Schubert C, Schuster G, Wulff K, et al. Influence of factor V HR2 on thrombin generation and clinical manifestation in rare bleeding disorders. Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34(6): 279-83.
  27. Soria JM, Blangero J, Souto JC, Mart?nez-S?nchez E, Mart?nez-March?n E, Coll I, et al. Identification of a large deletion and three novel mutations in exon 13 of the factor V gene in a Spanish family with normal factor V coagulant and anticoagulant properties. Hum Genet. 2002; 111(1): 59-65.
  28. Otrock ZK, Taher AT, Shamseddeen WA, Zaatari G, Bazarbachi A, Mahfouz RA. Factor V HR2 haplotype: a risk factor for venous thromboembolism in individ-uals with absence of Factor V Leiden. Ann Hematol. 2008; 87(12): 1013-6.
  29. Castoldi E, Simioni P, Kalafatis M, Lunghi B, Tormene D, Girelli D, et al. Combinations of 4 mutations (FV R506Q, FV H1299R, FV Y1702C, PT 20210G/A) affecting the prothrombinase complex in a thrombophilic family. Blood. 2000; 96(4): 1443-8.
  30. Castoldi E, Lunghi B, Mingozzi F, Simioni P, Girolami A, Bernardi F. A highly polymorphic microsatellite in the factor V gene is an informative tool for the study of factor V-related disorders. Br J Haematol. 2001; 114(4): 868-70.
  31. Castoldi E, Brugge JM, Nicolaes GA, Girelli D, Tans G, Rosing J. Impaired APC cofactor activity of factor V plays a major role in the APC resistance associated with the factor V Leiden (R506Q) and R2 (H1299R) mutations. Blood. 2004; 103(11): 4173-9.
  32. Zammiti W, Mtiraoui N, Mercier E, Abboud N, Saidi S, Mahjoub T, et al. Association of factor V gene polymorphisms (Leiden; Cambridge; Hong Kong and HR2 haplotype) with recurrent idiopathic pregnancy loss in Tunisia. A case-control study. Thromb Haemost. 2006; 95(4): 612-7.
  33. van Wijk R, Nieuwenhuis K, van den Berg M, Huizinga EG, van der Meijden BB, Kraaijenhagen RJ, et al. Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency. Blood. 2001; 98(2): 358-67.
  34. Castoldi E, Lunghi B, Mingozzi F, Muleo G, Redaelli R, Mariani G, et al. A missense mutation (Y1702C) in the coagulation factor V gene is a frequent cause of factor V deficiency in the Italian population. Haematologica. 2001; 86(6): 629-33.
  35. Yamakage N, Ikejiri M, Okumura K, Takagi A, Murate T, Matushita T, et al. A case of coagulation factor V deficiency caused by compound heterozygous mutations in the factor V gene. Haemophilia. 2006; 12(2): 172-8.
  36. Jivraj S, Rai R, Underwood J, Regan L. Genetic thrombophilic mutations among couples with recurrent miscarriage. Hum Reprod. 2006; 21(5): 1161-5.
  37. Z?ller B, Svensson PJ, He X, Dahlb?ck B. Identifica-tion of the same factor V gene mutation in 47 out of 50 thrombosis-prone families with inherited resistance to activated protein C. J Clin Invest. 1994; 94(6): 2521-4.
  38. Koster T, Rosendaal FR, de Ronde H, Briët E, Vandenbroucke JP, Bertina RM. Venous thrombosis due to poor anticoagulant response to activated protein C: Leiden Thrombophilia Study. Lancet. 1993; 342 (8886-8887): 1503-6.
  39. Zeinali S, Duca F, Zarbakhsh B, Tagliabue L, Mannucci PM. Thrombophilic mutations in Iran. Thromb Haemost. 2000; 83(2): 351-2.
  40. Zahed LF, Rayes RF, Mahfouz RA, Taher AT, Maarouf HH, Nassar AH. Prevalence of factor V Leiden, prothrombin and methylene tetrahydrofolate reductase mutations in women with adverse pregnancy outcomes in Lebanon. Am J Obstet Gynecol. 2006; 195(4): 1114-8.
  41. Murphy RP, Donoghue C, Nallen RJ, D Mello M, Regan C, Whitehead AS, et al. Prospective evaluation of the risk conferred by factor V Leiden and thermo-labile methylenetetrahydrofolate reductase polymorph-isms in pregnancy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000; 20(1): 266-70.
  42. Azem F, Many A, Ben Ami I, Yovel I, Amit A, Lessing JB, et al. Increased rates of thrombophilia in women with repeated IVF failures. Hum Reprod. 2004; 19(2): 368-70.
  43. Castaman G, Faioni EM, Tosetto A, Bernardi F. The factor V HR2 haplotype and the risk of venous throm-bosis: a meta-analysis. Haematologica. 2003; 88(10): 1182-9.
  44. Yamada H, Kato EH, Kobashi G, Ebina Y, Shimada S, Morikawa M, et al. Recurrent pregnancy loss: etiology of thrombophilia. Semin Thromb Hemost. 2001; 27(2): 121-9. Review.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 9, Issue 4
Winter 2009
Pages 305-316