2000 1 4 4 68

Incidence and growth of uterine myoma after ovulation induction on 1100 infertile women in shahid Akbarabadi Hospital and Royan Institute 2 1 مقدمه حدود15ـ10 درصد زوجها در سنين باروري دچار مشكلات ناباروري مي باشند. و از ميان علل ناباروري ناشي از عدم تخمك گذاري از شيوع نسبتا" بالايي برخوردار (در حدود 40 درصد) است . چنانچه تنها علت ناباروري را همين مورد فرض نماييم اكثر بيماران بعد از 4ـ3 دوره تحريك تخمك گذاري باردار مي شوند (1). درنتيجه، اين امر باعث گرديده است كه پزشكان زيادي حتي بدون بررسي قبلي و تأييد تشخيص عدم تخمك گذاري، به طور بي رويه اقدام به تجويز داروهاي محرك تخمك گذاري از جمله كلوميفن وHMG و… نمايند. بدون اينكه به عوارض آنها (مانند تحريك و بزرگ شدن بيش از حد تخمدان ، چندقلوزايي، سر درد، گرگرفتگي وازوموتور، تهوع و استفراغ، علائم اختلال بينايي، خشكي يا ريزش مو، ناراحتي در پستانها و… توجهي داشته باشند (1). يكي از مواردي كه به دنبال تحريك تخمك گذاري به طور تصادفي مشاهده شده است بروز ميوم رحمي و يا رشد ميومهاي كوچك رحمي بوده است. كه اين مسئله خود عوارض خاصي مثل خونريزي، درد، و كاهش راندمان موفقيت درروشهاي باروري كمكي را به دنبال خواهد داشت و مي تواند يكي از موانع ادامه درمان توسط بيمار باشد (17). با توجه به موارد فوق ما بر آن شديم تا با مطالعه اي بر روي خانمهاي ناباروري كه در آنها تحريك تخمك گذاري صورت گرفته ، ميزان بروز و يا رشد ميوم در آنها را بررسي نماييم. شايد مقدمه اي جهت بررسي تأثير تحريك تخمك گذاري در ميزان بروز و رشد ميوم رحمي باشد و با استناد به آن بتوان گامي در پيشگيري از مواردتحريك تخمك گذاري بي مورد برداشت . هدف كلي طرح: تعيين ميزان بروز و رشد ميوم رحمي پس از تحريك تخمك گذاري در زنان نابارور اهداف ويژه : 1-بررسي ميزان بروز ميوم رحمي در خانمهاي تحت مطالعه قبل از شروع تحريك تخمك گذاري 2- بررسي ميزان بروز ميوم و يا رشد ميوم در خانمهاي تحت مطالعه بعد از تحريك تخمك گذاري 3- مقايسه ميزان بروز و يا رشد ميوم رحمي قبل و بعد از تحريك تخمك گذاري روش بررسي: اين مطالعه توصيفي به شيوه دسترسي آسان, تعداد 1100 مورد بيمار با تشخيص عدم تخمك گذاري در پژوهشكده رويان و مركز آموزشي درماني شهيد اكبرآبادي (طي سالهاي 77-76). جهت بررسي انتخاب گرديدند. كه جهت درمان حداقل 5 دوره تحت تحريك تخمك گذاري قرار مي گرفتند. داروهاي مورد استفاده جهت تحريك تخمك گذاري شامل كلوميفن, HMG و يا انواع تركيبي بود و به علت اثر شناخته شده GnRH در مهار ميوم رحمي(8)، مواردي كه داروي فوق را استفاده نمودند، ازمطالعه حذف گرديدند. تمامي اين بيماران قبل از شروع تحريك تخمك گذاري تحت سونوگرافي قرار گرفته تا وجود يا عدم وجود ميوم رحمي در آنها مشخص گردد. سپس سونوگرافي بعد از حداقل 5 دوره تحريك تخمك گذاري مجدداً به عمل آمد تا بروز ميوم رحمي يا رشد ميوم هاي قبلي مشخص گردد. اطلاعات بيمار در پرسشنامه هاي مربوطه گردآوري گرديد. بعد از جمع آوري اطلاعات فوق، تجزيه و تحليل آماري صورت گرفت. نرم افزار آماري مورد استفاده برنامه SPSS-6 تحت ويندوز بود كه برحسب مورد از آزمونهاي آماري t-student test ، chi-square، ANOVA و نيز آزمونهاي Non-Parametricاستفاده گرديد. نتايج در سونوگرافي اوليه از 1100 افراد مورد مطالعه 54 نفر داراي ميوم رحمي و 1046 نفر بدون ميوم رحمي بودند كه از اين 54 نفر، بعد از تحريك تخمك گذاري 40 نفر (1/74%) دچار رشد ميوم شدند و در 14 نفر اندازه ميوم ثابت باقي مانده بود. از ميان 1046 نفر بدون ميوم رحمي، در 71 نفر ميوم بروز نمود. در اين مطالعه در واقع ميزان درصد رشد ميوم از بروز ميوم بيشتر است (1/74%) درصد رشد ميوم در مقابل (8/6) درصد بروز ميوم. دارويي‌ كه‌ با بيشترين‌ ميزان‌ بروز ميوم‌ رحمي‌ همراه ‌بوده‌، تركيب‌ HMG و كلوميفن‌ بوده‌ است‌.(جدول شماره2) (05/0p<). دارويي‌ كه‌ با بيشترين‌ ميزان‌ رشد ميوم‌ همراه‌ بوده‌ است ‌مصرف‌ توأم‌hMG و كلوميد بوده‌ است‌. (جدول شماره3)(05/0p<). همانگونه كه در‌ دو جداول5و4‌ زير مشهود است‌، بيشترين‌ داروي‌ مصرفي‌ در سابقه‌ پزشكي گذشته بيماران‌ مورد مطالعه. كلوميد بوده‌ است‌. (05/0p<). جدول‌ شماره‌6‌ ميانگين‌ و انحراف‌ معيار سن ‌بيماران مبتلا به ميوم‌ رحمي‌ پس ازمصرف‌ داروهاي‌ محرك‌ تخمك ‌گذاري‌و موارد بدون ابتلارا نشان‌ مي‌دهد. البته تفاوت معني داري بين ميانگين سني دوگروه مشاهده نگرديد. توزيع‌ سني‌ مبتلايان به ميوم‌ رحمي‌ بدنبال مصرف‌داروهاي محرك تخمك‌گذاري‌ نيز در جدول شماره 7 نشان داده شده است. ‌ميزان‌ انحراف‌ معيار و توزيع‌ سني‌ بيماران پس از تجويز داروهاي محرك تخمك گذاري با رشد ميوم‌ رحمي‌ و بدون تغيير در رشد ميوم رحمي در جدول 9و8 آمده است. تفاوت معني داري بين ميانگين سني دوگروه مشاهده نگرديد. (05/0p>). جداول شماره 13-10 طول مدت ناباروري (برحسب سال) را در گروه هاي مختلف مورد مطالعه نشان مي دهد. بحث علل مستعد كننده پاتوژنز ميوم رحمي عبارتند از: 1- نژاد سياه (توضيح خاصي وجود ندارد) (8و 9) 2- افزايش سن قبل از يائسگي(تاخير در يائسگي) (16) 3- اولين حاملگي بعد از 30 سالگي (14) 4- چاقي (افزايش سطح استروژن سرم) 5- تحريك طولاني مدت استروژني (8 و 11) 6- افزايش بروز خانوادگي (12) 7- ناهنجاريهاي كروموزومي (11) 8- افزايش شيوع ليوميوما بعد از قاعدگي ، بزرگ شدن و رشد ليوميوما در طول حاملگي در حضور تجويزاستروئيد و درمان با كلوميفن و پس رفت آن بعد از يائسگي معرف كننده رابطه آن با استروئيدهاي تخمداني است (13). 9- رابطه مثبتي بين بروز ميوم رحمي و مصرف دوزهاي بالاي OCP وجود دارد (8). 10- بالا بودن سطوح استروژن در داخل ميوم نسبت به ميومتر همان رحم (11) 11- افزايش اتصال استراديول به ميوم در هر ميلي گرم پروتئين پلاسما حدود 20 درصد بيشتر از ميزان آن در ميومتر نرمال همان ارگان است. 12- رشد ميوم در حضور پروژسترون اتفاق مي افتد. حتي رشد ميوم در حضور پروژسترون بيشتر از تركيب استروژن و پروژسترون مي باشد (11،13). 13- عدم حساسيت ميوم به پروستاگلاندين و افزايش حساسيت آن به استروژن پاتوژنز اصلي ميوم است. 14- در محيط داخلي ليوميومها غلظت استراديول زياد بوده و ليوميومها تعداد بيشتري رسپتور استروژن و پروژسترون دارند(1). بر اساس يافته برخي مقالات نسبت رسپتور استروژن به آندروژنها افزايش يافته يعني در واقع تعداد رسپتورهاي پروژسترون و آندروژنها كاهش يافته است (15). 15- عوامل آنزيمي ـ هورموني و فاكتورهاي رشد در بروز ميوم مؤثر است (14). رابطه افزايش شيوع ميوم رحمي با تحريك تخمك گذاري بدين ترتيب است كه پاتوژنزاصلي ميوم رحمي افزايش سطح استروژن است مصرف داروهاي محرك تخمك گذاري نيز در نهايت باعث افزايش سطح استروژن مي شوند. مثلا كلوميفن از طريق مهار گيرنده استروژن در سطح هيپوفيز و هيپوتالاموس، باعث افزايش گنادوترپينها و در نهايت افزايش سطح استروژن مي شود (5). اين مسئله احتمالاً در بروز و يا رشد ميوم توسط داروهاي محرك تخمك گذاري مؤثر باشد. علاوه بر اين كلوميد اثر مستقيمي بر توليد استروژن توسط تخمدان داشته و از طريق كاهش سطح استروژن به طور ثانويه منجر به تقويت اثر فيدبكي بروي هيپوتالاموس شده و تحريك تخمك گذاري رخ مي دهد. با توجه به نكات فوق و مشاهده تأثير بيشتر تحريك تخمك گذاري بر رشد ميوم رحمي (74 درصد) در مقايسه با بروز ميوم رحمي (8/6 درصد) احتمالا وجود عوامل مستعدكننده ميوم نيز در اين مطالعه بي تأثير نبوده است. در واقع كساني كه داراي عوامل مستعد كننده بودند به تحريك تخمك گذاري بيشتر به صورت افزايش رشد ميوم رحمي پاسخ دادند. پس مي توان چنين نتيجه گرفت كه به تنهايي نقش عوامل مستعد كننده درپاتوژنز ميوم رحمي بيشتر از نقش استروژن توليد شده در اين بيماران مي باشد. نتيجه نهايي حاصل از اين مطالعه اينكه شايد رشد و بروز ميوم رحمي با تجويز داروهاي محرك تخمك گذاري و سابقه درمان قبلي رابطه اي مثبت داشته باشد ( كه نيازمند مطالعات تكميلي آتي است) اما پس از مصرف چنين داروهايي سن و طول مدت ناباروري بيمار در ميزان رشد يا بروز ميوم تفاوتي ايجاد ننموده است. شيوع كلي ميوم ، در افراد بدون تحريك تخمك گذاري در اين تحقيق 5/2% بود ولي آمار جهاني در كتب مرجع از 25ـ20% در سالهاي باروري (11) تا 50ـ40 درصد در زنان بالاتر از40 سال متغير مي باشد (8). براي تأييد نتايج فوق مطالعات ديگري نياز مي باشد. اما مي توان چنين نتيجه گرفت كه هر گاه ساير علل مستعد كننده ميوم رحمي وجود نداشته باشد حتي تحريكات استروژني (كه ما توسط روشهاي تحريك تخمك گذاري آن را به بيمار القا كرديم) نمي تواند در ايجاد و رشد ميوم رحمي تأثير زيادي داشته باشد و براي تأثير استروژن در رشد و بروز ميوم رحمي وجود علل مستعد كننده الزامي است. تقدير و تشكر از زحمات مسئولين محترم جهاد دانشگاهي واحد علوم پزشكي ايران، بويژه آقاي شاهوردي معاونت محترم پژوهشي و آقاي كاشاني، همكاران ارجمند در پژوهشكده رويان، جناب آقاي باغستاني و خانم تيموري، پرسنل زحمتكش مركز آموزشي درماني شهيد اكبر آبادي و سركار خانمها: اسكندري و سليمي كه در تهيه و تنظيم اين مقاله ما را ياري نموده اند سپاسگذاريم. 2 <p>The aim of this study was to determine the incidence and growth rate of uterine myomas in users of ovulation induction drugs. Eleven hundred in fertile women who had undagone at least 5 cycles of ovulation induction, refering to Royan Institute and Akbarabadi Hospital were selected on the basis of easy access selection method. To study presence or absence of uterine myoma, all the patients were subjected to sonograply before ovulation induction The sonography was repeated after at least 5 cycles of ovulation induction and was compared with the initial sonography. Of the 1100 patients, 54 had myoma and of the 1046 myoma–free patients, 71 (6.8%) developed myoma later and of the 54 with initial myoma, 40 (%74) showed increased growth of their myoma. This study is a beginning for studies on the effect of ovulation induction on the growth rate of uterine myomas and may be a comparison basis for the incidenee and growth rate of myomas in an age matched control group of women.</p> 11 20 Mahnaz M Ashrafi مهناز اشرفی Iran University of Medical Science Iran University of Medical Science Iran Masoumeh M Sadeghi معصومه صادقی Iran University of Medical Science Iran University of Medical Science Iran Zohreh Z Montazeri زهره منتظری Iran University of Medical Science Iran University of Medical Science Iran Shahram Sh Tavajjohi شهرام توجهی فینی Department of Epidemiology and Reproductive Health Royan Institute Department of Epidemiology and Reproductive Health Royan Institute Iran Uterine myomaInfertilityOvulation inductionAssisted Reproductive Techniques 36.pdf Speroff L, Robert H, Glass, Nathan G, Kase. Clinical Gynecologic Ednocrinology and infertility. sixth edition, Williams & Wilkins, 1999, pp:809-39.##William Warwick Dyson Bannister, Gray Anatomy, thirty seventh edition. Churchill Livinglone, 1989, pp:1442-3##Cunnigham, Hankins, Mac Donald, Clark, Leveno, Gilstrap, Cart. William obstetrics. 20th edition, Appleton & Lange, 1997, pp:581.##SG Hiller, HC Kitchener, JP Neilson. Scientific Essencial of reproductivemedicine. WB Saunders, 1996, pp:133-7.##Key Chang, Rebar Solves, Infertility Evaluation and treatment, WBSaunders. 1995, pp:127-93.##Brue R, Car, Richard E Block Well, Text Book of reproductive medicine.Second edition, Appleton & Lang. 1998, pp:442-537.##Eliy Adashi, Jhon A Roch, Zer Rosen Waks. Reproductive Endocrinologysurgery and technicology. Volum 2, Lippincott-Raven. 1996, pp:1493-634.##John A Rock, John D, thompson. Teline’s operative Gynecology. 50thAnniversary edition, Lippincott-Raven. 1996, pp:435-65.##H, Decherney, Martin. L. Pernol. Current Obstetrics & Gynecology. Eight edition, Appleton & Lange. 1994, pp:1025-36.##David W Keller, Ronald C Strickler, James C Warren Clinical infertility,1984.pp:135-75.##Kawaguchi K, Fuji S, Konishi I, Nanbu Y, Nonogakih, Mori T. Mitotic activityin uterine leiomyomas during the menestural cycle. Am J Obstet Gynecol. 1989, 160(3): 637-41.##Koutsi Lieris M, Pathophysiology of uterine leiomyomas. Biochem cell Bio 1992, 70(5): 273-8.##Tamaya T, Fujimato J, Okada H. Camparison of cellular levels of steroidreceptors in uterine leiomyoma and myometrium. Acta Obstet Gynecol scand. 1985, 64(4): 307-9.##Marshall LM, Spiegelman D, Barbieri RL, Goldman MB, Manson JE, ColditzGA, Willelt WC, Hunter DJ. Variation in the incidence of uterine leiomyomaamong premenopausal women by age and rale. pp:Obstet Gynecol. 1997, 90(6): 967-73.##Storall DW, Parrish SB, Van Voorhis BJ, Hahn SJ, Sparks AE, Syrop CH. Uterin leiomyoma redce the efficacy of assisted reproduction cycle: results of matched follow up study". Hum Reprod. 1998, 13(1):192-7.##

Evaluation of factors influencing GIFT and comparison of GIFT and IVF results at infertility center of Shariati hospital during 1376-78 2 1 مقدمه Gamete Intrafallopian Transfer) GIFT) از روشهای نسبتا جدید درمان ناباروری است كه با انتقال گامت های نر و ماده به داخل لوله های فالوپ توسط لاپاروسكوپ، لقاح در داخل بدن و در محل طبیعی آن انجام می شود. بیمارانی كه علت ناباروری آنها فاكتور مردانه خفیف ناشناخته، اندومتریوز ( با باز بودن لوله ها )، فاكتور دهانه رحم و یا اختلال تخمك گذاری می باشد با این روش قابل درمان می باشند. (1) حتی برخی سالم بودن یك لوله را برای انجام GIFT كافی می دانند (3-2(. GIFT روشی است كه بصورت جایگزین IVF (In vitro Fertilization ) استفاده می گردد و از مزایای آن بر روش IVF: اولاً لقاح در داخل بدن انجام شده و در نتیجه احتمال آثار سوء عوامل خارجی كاهش می یابد و ثانیاً هزینه سه روز نگهداری جنین در آزمایشگاه كاهش می یابد. اما از معایب آن عدم اثبات لقاح می باشد. علی رغم نتایج ظاهراً بهتر GIFT نسبت به IVF معلوم نیست كه این برتری ناشی از روش بهتر می باشد یا بیماران بهتر (7-4)، اگر بیماران را بر اساس علت ناباروری دسته بندی كنیم هر روش در افراد خاصی نتایج بهتری دارد. مثلا در اندومتریوز و ناباروری با علل ناشناخته نتایجGIFT بهتر ازIVF بوده ولی در ناباروری با علل مردانه متوسط نتایجGIFT كمتر از IVF می باشد. مواد و روشها این تحقیق ازنوع Cross Sectional و به صورت گذشته نگر می باشد. طی 18 ماه بیماران مراجعه كننده در بخش درمان ناباروری بیمارستان دكتر شریعتی تحت درمان با روشهایGIFT یا IVF مورد مطالعه قرار گرفتند. در مورد IVF تنها میزان حاملگی به ازای انتقال جنین محاسبه ولی در موردGIFT علاوه بر محاسبه میزان حاملگی به ازای انتقال تخمك، تاثیر سایر فاكتورهای مؤثر در بهبود نتایج GIFT مورد بررسی قرار گرفت. در كل130 سیكل IVF و 71 سیكل GIFT بررسی شد. متغیرهای مورد بررسی شامل سن خانم، استرادیول سرم قبل از شروع سیكل درمانی و در روز تزریقhCG علت ناباروری، نوع و مدت ناباروری، تعداد تخمك منتقل شده به لوله های فالوپ، خصوصیات اسپرم شامل درصد تحرك و تعداد اسپرم بود. اطلاعات داده شده به صورت توصیفی و تحلیلی گزارش شدند و جهت بررسی آماری از آزمونهای Chi Square و Fisher exact test و تست اختلاف نسبت در هر یك از دسته بندی ها استفاده شد. نتایج در این مطالعه بیماران از نظر سنی به 2 گروه سنی كمتر یا مساوی 35 سال و بالای 35 سال تقسیم شدند. میانگین سنی 2/30 سال و بیشترین تعداد در گروه 35 سال یا كمتر بود. میزان حاملگی به ازای انتقال تخمك در گروه سنی كمتر یا مساوی 35 سال 6/30% و در گروه بالای 35 سال 3/22% بود. از نظر آماری اختلاف معنی داری بدست نیامد (جدول1) (05/0(P>. میزان استرادیول روز شروع سیكل درمانی حداقلpg/ml 4 و حداكثر pg/ml114 با میانگین pg/ml8/43 بود. میزان موفقیت GIFTدر بیمارانی كه استرادیول زیر pg/ml 50 داشتند 4/24% و در گروهی كه استرادیول بالایpg/ml 50 داشتند 8/27% بود. این اختلاف از نظر آماری معنی دار نبود (جدول2) (7/0p<). میزان استرادیول سرم در روز تزریقhCG در پرونده 55 بیمار وجود داشت كه حداقل pg/ml 280 و حداكثر pg/ml5580 با میانگینpg/ml 1390 بود. حداكثر حاملگی در گروه با استرادیول pg/ml2000- 1001 (45%) و حداقل حاملگی در گروه با میزان استرادیول pg/ml 1000-0 بدست آمد كه این اختلاف از نظر آماری معنی دار بود. ( جدول 3) (01/0(P< در این بیماران 61 نفر ناباروری اولیه ( 9/85%) و10 نفر ناباروری ثانویه ( 1/14%)‌ داشتند میزان حاملگی در گروه بیماران با ناباروری اولیه 1/31% (19 نفر از 61 بیمار) و با ناباروری ثانویه 20% (2 بیمار از10 نفر) بود. این اختلاف از نظرآماری معنی دار نبود7/0P<. طی این بررسی كمترین مدت ناباروری 1 سال و حداكثر 20 سال با میانگین SD 2/9 سال بود بیشترین تعداد افراد دارای طول مدت ناباروری 5-1 سال بودند ( 7/35%) و حداقل حاملگی در گروه با طول مدت ناباروری بیش از 11 سال (1/19%) بدست آمد.(جدول4) (4/0(P< (در یك مورد مدت ناباروری در پرونده ذكر نشده بود). علل ناباروری در جدول (5) با ذكر تعداد و درصد موفقیت در هر گروه آورده شده است. بیشترین گروه افراد نابارور با اختلال تخمك گذاری (2/34%) و كمترین گروه افراد مبتلا به اندومتریوز و چسبندگی لگنی (9/2%) بودند. در بیشتر افراد حامله علت ناباروری اختلال تخمك گذاری و ناباروری با علت ناشناخته بود، و علاوه بر آن بیماران، دارای علل ناباروری متعدد دیگری نیز بودند. تعداد تخمك منتقل شده به لوله های فالوپ حداقل 1 و حداكثر 15 عدد با میانگین 9/7 بود. بیشترین میزان حاملگی 3/33% در انتقال 6-5 تخمك بود. ( جدول 6 ) ( صرف نظر از مواردی كه 1 یا 2 تخمك منتقل شده بود كه هر دو بیمار حامله شدند). در رابطه با پارامترهای مختلف اسپرم از نظر تعداد اسپرم حداقل 45 میلیون و حداكثر 105 میلیون و با میانگین 3/72 میلیون داشتند. در این بررسی با افزایش تعداد اسپرم میزان موفقیت و حاملگی نیز افزایش یافته بود، ولی این اختلاف از نظر آماری معنی دار نبود (جدول 7) (6/0p<). از نظر تحرك اسپرم در گروه با تحرك اسپرم 50% >میزان حاملگی 35% و در گروه با تحرك كمتر از 50% میزان حاملگی، 3/23% بود (05/0(p< از لحاظ آماری اختلاف معنی دار بود. از تعداد كل 71 نفر كه تحت درمان GIFT قرار گرفتند 21 بیمار (6/29%) حامله شده ولی در افراد تحت درمان IVF میزان حاملگی 6/14% بود. این اختلاف از لحاظ آماری معنی دار می باشد )05/0P<). بحث همانطور كه در جدول شماره 1 دیده می شود. خانم هایی كه زیر 35 سال سن دارند از میزان حاملگی بیشتری به ازای انتقال تخمك (6/30%) برخوردار می باشند. (اگر چه به علت كم بودن نمونه مورد مطالعه معنی دار بودن این اختلاف ثابت نگردید). در چندین مطالعه اثر سن بر نتایج ARTنشان داده شده است. در یك مطالعه روی 54 سیكلGIFT ، ارتباط فاكتور تحرك اسپرم ، تعداد تخمك منتقل شده و سن خانم مورد بررسی قرار گرفت (11). در این مطالعه میزان موفقیت در سه گروه زیر 34 سال، 34 تا 40 سال و بالای 40 سال به ترتیب 37% و 1/32% و 20% بود. در مطالعه دیگری با سه گروه زیر 35 سال 35 تا 40 سال و بالای 40 سال نتایج موفقیت 46% و 28% و0% حاصل گردیده است(12). در اینجا نیز همان اثر منفی افزایش سن بر میزان روش GIFT مشاهده می گردد. در مطالعه ما اختلاف آماری بین میزان موفقیت در گروههای مختلف مشاهده نكردیم كه احتمالاً به علت كم بودن تعداد نمونه باشد زیرا سیر كاهش یابنده میزان موفقیت بر اساس سن در جدول (1) مشاهده می شود. اثبات یا رد این موضوع نیازمند مطالعات بعدی با حجم نمونه بیشتر می باشد. از نظر تاثیر علل ناباروری بر میزان موفقیت GIFT علی رغم اینكه در افراد حامله شده بیشترین علت ناباروری ناشناخته می باشد معهذا بین میزان حاملگی در بین علل مختلف ناباروری اختلاف معنی داری وجود ندارد. هر چند در بعضی گروهها درصد موفقیت GIFT بیش از علل دیگر می باشد اما این فاكتور تاثیر مستقیمی بر نتیجه GIFTنداشته است . رابطه علت ناباروری و نتایجGIFT در بعضی مطالعات نشان داده شده است. در اكثر مطالعات بیماران با ناباروری با علت ناشناخته و اندومتریوز نتایج خوبی از روش درمانی GIFT می گیرند )12-5 (. در مطالعه ما تعداد بیماران مبتلا به اندومتریوز كم بوده (2 عدد) در نتیجه آمار موفقیت قابل استناد نمی باشد (50%). اما در گروه بیماران نابارور با علت ناشناخته (20 نفر) میزان حامگی30% درصد قابل قبول است. در جدول شماره (3) میزان موفقیت روش درمانGIFT در گروههای مختلف ثبت شده است در استرادیولpg/ml 2000-1001 حداكثر میزان حاملگی رخ داده است. (01/0 p<) بدین ترتیب با استفاده از پروتكل صحیح درمانی و تحریك تخمك گذاری مناسب در حدی كه استرادیول به میزان دلخواه بر حسب تعداد تخمك های بدست آمده بالا برود افزایش در موفقیت نتایجGIFT حاصل می شود. در مطالعه ای دیگر در مقایسه پروتكل HMG به همراه آگونیستGnRH كه بیماران آنها مشابه ما به دو گروه تقسیم گردیدند در گروه دوم متوسط استرادیول سرمpg/ml 10672281 بدست آمده است)13). در مطالعه دیگری در سال 1991 میزان حاملگی بر اساس سطح استرادیول روز تزریقhCG تعیین گردیده است. در گروه دارای استرادیول pg/ml 500-0 كمترین میزان حاملگی (9/0) و در گروه دارای استرادیول بالای pg/ml 2000 میزان حاملگی 26% بود كه با افزایش سطح استرادیول سرم سیر صعودی موفقیت نتایج دیده می شود )14(. در مطالعه ما این سیر صعودی تا یك مقطع خاص نشان داده نشده است بلكه در گروه بیماران ما بیشترین میزان حامگی در گروه با استرادیولpg/ml 2000-1001 مشاهده می شود (45%). در بیماران با استرادیول بالاتر ازPg/ml 2000 میزان موفقیت كاهش یافته است. صرف مقایسه میزان حاملگی با فاكتور استرادیول روز تزریق hCGتا حد زیادی درست نیست چون متغیر تعداد تخمك بدست آمده نیز در میزان استرادیول سرم نقش مهمی بازی می كند. در صورتی بحث در مورد میزان استرادیول سرم ارزش پیدا خواهد كرد كه تعداد تخمك بدست آمده و این میزان با هم در نظر گرفته شود. در مطالعات دیگری نشان داده شده است كه به ازای هر فولیكول بزرگتر از mm14pg/ml200 استرادیول تولید می شود )15). در مطالعه ما البته به نظر می رسد این نسبت وجود دارد زیرا متوسط تعداد تخمك بدست آمده 7/9 عدد و متوسط استرادیولpg/ml 1390 می باشد كه نسبت تقریبا 1 به 200 می باشد. در هر حال بررسی اثر هر فاكتور روی نتیجه موفقیت روش درمانی GIFT نیاز به مطالعات وسیعتری دارد. همانطور كه مشاهده می شود بین نتایج موفقیتGIFT و نوع و طول مدت ناباروری ارتباطی وجود ندارد اگر چه با افزایش سابقه ناباروری از میزان حاملگی كاسته شده است اما اختلاف معنی داری مشاهده نمی شود شاید علت عدم این اختلاف معنی دار كمی حجم نمونه باشد. زیرا روشهای درمانی مطالعات دیگر میزان موفقیت روشهای درمانی ART با مدت ناباروری ارتباط معكوس دارد. البته این مورد در ارتباط با خود GIFT نشان داده نشده است. اما اثر منفی افزایش مدت ناباروری بر میزان جواب به درمان نشان داده شده است )16). بین میزان حاملگی و میزان استرادیول روز شروع سیكل درمانی نیز ارتباط معنی داری بدست نیامد. در جدول شماره (6) تاثیر تعداد تخمك منتقل شده در بهبود نتایج GIFT مشاهده می شود البته اگر در گروهی كه 1 و 2 عدد تخمك منتقل شده میزان حاملگی ( هر دو حامله شدند ) را در نظر نگیریم ( زیرا تعداد یك نفر قابل اعتماد نمی باشد) مشاهده می شود كه با افزایش تعداد تخمك میزان حاملگی افزایش می یابد . همانطور كه گفته شد ارتباط تعداد تخمك بدست آمده و نتایج GIFT در سایر مطالعات نیز اثبات شده است )11(. از نظر خصوصیات اسپرم نیز تحرك اسپرم بر نتیجه GIFT مؤثر بوده است لذا در موارد ناباروری با فاكتور مردانه متوسط و شدید، استفاده از GIFT روش درمانی مناسب نمی باشد. در مطالعه نلسون و همكارانش نشان داده شد كه تنها فاكتور مؤثر بر نتایجGIFT از نظر خصوصیات اسپرم، تحرك آن است كه با نتایج ما مطابقت دارد. مطالعات دیگر علاوه بر تحرك، غلظت اسپرم نیز در میزان موفقیت مؤثر می باشد (17). احتمالاً با افزایش حجم نمونه مطالعات ما نیز این موضوع را ثابت می كرد. در مقایسه درصد موفقیت در روشIVF با روش GIFT ، موفقیت روش GIFT بهتر بوده و شاید بتوان با انتخاب صحیح این روش در بیماران مورد نظر به نتایج بهتری دست یافت. در این بررسی سعی گردید بیماران تحت درمان با روشهایGIFT و IVF انتخاب از هر نظر با هم مشابه باشند از تعداد 71 بیمارGIFT شده 55 بیمار سابقه درمان با روشهای ARTقبلی (IVF) را داشتند كه در این گروه میزان حاملگی به ازای انتقال تخمك 1/29% بدست آمد كه با نتیجه كلی 6/29% مطابقت داشت به طور مشخصی از نتایجIVF بهتر بود لازم به ذكر است بیماران فوق اولین سری بیمارانی بودند كه در این مركز تحت درمان با روشGIFT قرار گرفتند و این بررسی از شروع این روش درمانی در مركز در سال 1378-1376 انجام شده است . از میان عوامل مورد بررسی، عوامل مؤثر بر بهبود نتیجه GIFT عبارتند از سن خانم ، میزان استرادیول روز تزریق HCG، تعداد تخمك منتقل شده و خصوصیات اسپرم، علت ناباروری، طول مدت ناباروری و میزان استرادیول سرم در شروع سیكل درمانی تاثیری بر نتیجه GIFT نداشتند به هر حال بررسی اثر هر یك از فاكتورهای فوق روی نتایج موفقیت روش درمانیGIFT نیاز به مطالعات وسیع تر دارد . تشكر و قدردانی از خانم بهاره اسدی و پرسنل بخش درمان ناباروری بیمارستان دكتر شریعتی به خاطر همكاری در انجام این مطالعه تشكر و قدردانی می گردد. 2 <p>Today there are a number of methods of Assisted Reproductive Technology. The classic method of IVF has a pregnancy rate of 11-12%. GIFT is a new method with a pregnancy rate of 25–35%. In this study 71 patients were included in GIFT cycle. In our study Pregnancy rate of GIFT was 29.6% whereas in 130 cycles of IVF the pregnancy rate was 14.6%. In this study we found that female age, the number of transfered oocytes, serum estradiol on hCG injection day and sperm characteristics were influential factors affecting the outcome of GIFT.</p> 20 27 Ashraf A Alyasin اشرف آل یاسین Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Marzieh M Agha Hossinei مرضیه آقاحسینی Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Afsaneh A Khademi افسانه خادمی Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Hojjatallah H Saeidi Saeidabady حجت الله سعیدی سعید آبادی Medical Biochmistry Department, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University Medical Biochmistry Department, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University Iran GIFTIVFFemale ageEstradiolOocyte 37.pdf Dlugi AM, Mersol barg Ms, Seibel MM. Gamete intrafallopian transfer.In: Seibel MM, Infertility A Comprehensive Text. Connecticut, Appleton & Lang. 1997,pp: 687.##Corson SL, Batzer F, Eisenberg E, et al: Early experience with the GIFT procedure . J Reprod Med. 1989, 31:219.##Molloy D, Speirs A, Du Plessis Y, Mc Bain J, Johnston. A Laparoscopic approach to a program of gamete intrafallopian transfer. Fertil Steril. 1987, 47:289.##Medical Research International, the American Fertility Society Special Interest Group from the National IVF-ET registry. Fertil Steril. 1998, 49:212.##Medical Research International, Society for Assisted Reproductive Technology (SART), the American Fertility Society: in vitro ertilization–embryo transfer (IVF-ET) in the United states: 1990 results from the IVF-ET registry. Fertil Steril. 1992, 57:15.##The American Fertility Society, Society for Assisted Reproductive Technology: Assisted reproductive technology in the United States and Canada: 1991 results from the Society for Assisted Reproductive Technology generated from the American Fertility Society registry. Fertil Steril. 1993, 59:956.##The American Fertility Society, Society For Assisted Reproductive Technology: Assisted reproductive technology in the United Stated and Canada: 1992 results generated from the American Fertility Society / Society for Assisted Reproductive Technology registry. Fertil Steril. 1994, 62:1121.##Mc Gaughey RW, Nemiro JS. Correlation of estrogen levels with oocytes aspirated and with pregnancy in a program of clinical tubal transfer. Fertil Steril. 1987, 48:98.##Imodeme DAG, Wafik AA, Chan ACW. Gamete intrafallopian transfer (GIFT). the Solimon Fakeeh Hospital preliminary experience. Presented at the 5th World Congress on in vitro Fertilization and Embryo Transfer, April 1987, Norfolk, VA.##FIVNAT (French in vitro National): French national registry: Analysis of 1990 data.Fertil Steril. 1993, 59:587.##Nelson JR, Corson SL, Batzer FR, et al. Predicting success of gamete intrafallopian transfer. Fertil Steril.1993, 60:116.##Guastella G, Comaretto G, Plaermo R, et al. Gamete intrafallopian transfer in the treatment of infertility:The first series at the University of Palermo. Fertil. 1986, 46:417.##Benshushan A,et al. The effect of onadotropin–releasing hormone agonist on embryo quality and pregnancy rate following cryopreservation. Fertil Steril. 1993, 59:1065.##Dodson WC, Haney AF. Controlled ovarian hyperstimulation and intrauterine insemination for treatment of infertility. Fertil Steril. 1991, 55:457.##Franks S, Hamilton-Feirley D. Ovulation Induction. Gonadotropins. In: Adashi EY, Rock JA, Rosenwaks Z,Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology. Lippincott-Raven. 1996, pp:1207-25.##Collins JA. Unexplained Infertility. In: Seibel MM, Infertility A Comprehensive text. Connecticut, Appletion & Lange. 1997, pp:331.##Rodriguez–Rigan LJ, Ayala C, Grunert GM,et al. Relationship between the results of sperm analysis and GIFT. J Androl. 1989,10:139.##

Comparison of quality and early postoperative complications between Laparascopy and Laparotomy in 112 women undergoing tubal ligation 2 1 مقدمه مقايسه كيفيت اعمال جراحي با لاپارسكوپ و لاپاراتومي از مباحث معمول در گستره، توبكتومي مي باشد. بسياري از مؤلفين عقيده دارند كه تكنيك هاي لاپاراسكوپي به علت محل برش كوچك، كاهش عفونتهاي لگني و دوره نقاهت كوتاهتر بر اعمال جراحي لاپاراتومي ارجحيت دارد (1) بعضي مطالعات دلائل ارجحيت لاپاراسكوپي را به لاپاراتومي پذيرش بيشتر توسط افراد، كاهش مدت عمل، كاهش زمان بستري و كاهش هزينه هاي تحميلي به افراد مي دانند همچنين استفاده از لاپاراسكوپي به علت امكان مشاهده و انجام اعمال جراحي وسيع لگني و شكمي با حداقل چسبندگي و ضايعه اهميت فراواني دارد (2). علاوه بر اين در بستن لوله ها با لاپاراسكوپي برش محل عمل كمتر به چشم خورده و احتياجي به محدود كردن فعاليت جنسي نيست. Daniel در بررسي خود زمان عمل را در بستن لوله، با لاپاراسكوپ برابر يا كوتاهتر از عمل لاپاراتومي ذكر كرده است (3). اين در حالي است كه Tanerدر مطالعه خود مدت عمل را در لاپاراسكوپي حدود 35-12 دقيقه ذكر نموده كه تفاوت چنداني با مدت عمل 42-15 دقيقه در لاپاراتومي ندارد (4). در خصوص عوارض نيز مطالعات زيادي انجام شده است. شيوع عوارض در اعمال لاپاراسكوپي 28 مورد در هر 10000 نفر مي باشد كه اين عوارض با افزايش تجربه جراح كاهش پيدا مي كند. اين عوارض شامل ضايعات عروقي، پارگي احشاء، عفونت، ضايعات الكتروسرژيكال، امبولي گاز و آمفيزم زير جلدي و مدياسيتنال مي باشد(5و6) Haghes نشان داد كه عوارض توبكتومي با لاپاراسكوپي در مقايسه با توبكتومي با لاپاراتومي كمتر است. اما حاملگي و شكست توبكتومي در لاپاراسكوپي بيشتر مي باشد (7) هم چنين Humford در مطالعه خود عوارض توبكتومي را در لاپاراسكوپي 2 برابر لاپاراتومي گزارش كرد. (8). Tetchworth نيز در مطالعه خود ارجحيتي را براي لاپاراسكوپي در مقايسه با ميني لاپاراتومي ذكر نكرده است (9). هدف از اين مطالعه، مقايسه كيفيت اعمال لاپاراسكوپي و عوارض زودرس پس از آن به عنوان تكنيك برتر در مقايسه با اعمال لاپاراتومي مي باشد كه اين مقايسه در افراد داوطلب توبكتومي انجام گرفت. مواد و روشها اين تحقيق، مطالعه اي توصيفي، تحليلي است كه به طريقه آينده نگر انجام گرفته است. كل موارد توبكتومي 112 نفر بودند و اين تعداد بر اساس كل موارد انجام شده در3 سال در دو بيمارستان شريعتي وشهيد مصطفي خميني در شهر تهران گردآوري شده است. افراد مورد مطالعه خانمهاي سالم با محدوده سني 45-25 سال و حداقل صاحب دو فرزند مي باشد و داراي هيچگونه بيماري زمينه اي نبوده و BMI زير 25 را دارا بودند با استفاده از اطلاعات موجود در پرسشنامه شامل وزن و قد با فرمول محاسبه گرديد اين افراد بطور تصادفي در دو گروه مورد مطالعه قرار گرفتند. گروه اول شامل 53 نفر از افراد با لاپاراسكوپي و با كليپس و يا كوتر لوله اي آنها مسدود گرديد. گروه دوم 59 نفر از روش لاپاراتومي و با تكنيك پومروي استفاده شد. تقسيم افراد در دو گروه به طور يكسان و به صورت تصادفي بوده است. اعمال جراحي در دو گروه توسط يك تيم انجام گرفته است. و جمع آوري اطلاعات از طريق تكميل پرسشنامه بوده و پيگيري افراد تحت عمل تا يك ماه پس از عمل با مراجعه منظم به درمانگاههاي فوق ادامه داشته است. متغيرهاي مورد مطالعه در اين بررسي شامل مدت عمل، مدت بستري، دوره نقاهت، بروز عوارض در دو گروه فوق بوده است. نتايج بدست آمده با استفاده از نرم افزار SPSS با استفاده از تست آماري Student’s t-testتجزيه و تحليل شد و بررسي ارتباط متغيرها با سطح معني دار 05/0< P انجام گرديد و نتايج بصورت جدول نشان داده شد. نتايج در اين بررسي متغيرهاي مدت عمل، ميزان خونريزي، مدت بستري، عوارض زودرس و تعداد موارد بدون عارضه در دو گروه لاپاراتومي و لاپاراسكوپي تحت توبكتومي مقايسه شده اند كه نتايج در ذيل ارائه مي گردد. 1- در مقايسه مدت عمل در دو گروه تقسيم بندي زير بكار رفت: 1- مدت عمل كمتر از 20 دقيقه، 2- مدت عمل بين 30-20 دقيقه، 3- مدت عمل بيش از نيم ساعت. در بررسي يافته هاي فوق مدت عمل در گروه توبكتومي با لاپاراسكوپي به طور معني داري كوتاهتر از گروه لاپاراتومي بوده است. همانطور كه در جدول نشان داده شده 68% از افراد تحت توبكتومي با لاپاراسكوپ مدت عمل كمتر از 20 دقيقه داشته اند در حاليكه اين ميزان در گروه لاپاراتومي تنها 27% بوده است از طرفي تنها 3% افراد گروه تحت لاپاراسكوپي مدت عمل بيش از نيم ساعت داشته اند اما در گروه لاپاراتومي 64% مدت عمل 30-20 دقيقه و 9% مدت عمل آنها بيش از نيم ساعت به طول انجاميده است. (05/0< P) نمودار شماره 1 2- در بررسي مقدار خونريزي زمان عمل توبكتومي در گروههاي روش لاپاراسكوپي و لاپاراتومي، مقايسه شد، ميزان خونريزي بر اساس تخمين جراح و ميزان گازهاي مصرفي تخمين زده شد. بر اساس نتايج حاصل 5/18% از افراد تحت عمل با روش لاپاراتومي خونريزي متوسط تا شديد داشته اند در حاليكه اين ميزان در گروه با لاپاراسكوپي حدود 2/6% موارد است در نتيجه توبكتومي با روش لاپارسكوپ در مقايسه با لاپاراتومي در زمان عمل با ميزان خونريزي كمتري همراه است (05/0P<). نمودار شماره 2 3- براي بررسي مدت بستري پس از توبكتومي گروههاي زير بررسي شدند: الف- نياز به بستري به مدت 12 ساعت، ب- نياز به بستري به مدت 24-12 ساعت 3- نياز به بستري بيش از 24 ساعت. در بررسي نتايج نشان داده كه حدود 78% افراد با روش لاپارسكوپي در 12 ساعت اول قابل ترخيص مي باشند. در حاليكه 63% از افراد با روش لاپاراتومي 24-12 ساعت پس از عمل قابليت ترحيص داشته اند. لذا در بستن لوله ها با روش لاپاراسكوپي مدت بستري پس از عمل كاهش مي يابد (05/0P<). نمودار شماره 3 4- در بررسي زمان برگشت به فعاليت روزمره، افراد بر اساس توانائي در طي 3 روز، 3-7 روز و بيش از7 روز پس از عمل به فعاليت عادي و روزمره خود بازگشته اند. نتايج پيگيري افراد تا يكماه پس از عمل نشان داد كه بازگشت به فعاليت اوليه در گروه توبكتومي لاپاراسكوپي در 96% موارد قبل از 7 روز به فعاليت عادي زندگي خود باز مي گردند در حاليكه اين ميزان در گروه توبكتومي به روش لاپاراتومي حدود 68% بوده و در حدود 32% موارد در گروه لاپاراتومي دوره نقاهت بيش از 7 روز به طول انجاميده نتيجتاً ارتباط مستقيم بين روش توبكتومي با لاپارسكوپي و كاهش دوره نقاهت پس ازعمل وجود دارد(05/0 P<).نمودار شماره 4 5- در مقايسه عوارض زودرس در دو گروه نشان داد كه بين شيوع هماتوم و عفونت و با روش بستن لوله ها ارتباط معني داري وجود ندارد (05/0P>). اما درد موضعي در گروه لاپاراتومي بيش از گروه لاپاراسكوپي مشاهده گرديد (27% درگروه لاپاراتومي و 6/16% در گروه لاپاراسكوپي ) لذا از نظر آماري ارتباط معني داري بين استفاده از روش لاپاراسكوپي و كاهش شيوع درد موضعي پس از عمل وجود دارد (05/0P<). نمودار شماره 5 ارزيابي عوارض پس از عمل نشان داد كه 75% موارد استفاده از لاپاراسكوپي هيچ عارضه اي مشاهده نشده است. و در حاليكه در گروه با لاپاراتومي 4/57% بدون عارضه بوده اند. بدين ترتيب ارتباط معني داري بين روش توبكتومي و كاهش عوارض پس از عمل وجود دارد (01/0 P<). بحث در مطالعه ما مدت عمل، ميزان خونريزي ، مدت بستري و دوره نقاهت در گروه لاپاراسكوپي كوتاهتر از گروه لاپاراتومي بوده است و هم چنين مقايسه عوارض زودرس پس از عمل ( شامل عفونت، درد موضعي، خونريزي و هماتوم نشان داد كه بين شيوع عفونت، هماتوم، خونريزي پس از عمل و روش مورد استفاده ارتباط محسوسي وجود ندارد اما درد موضعي در گروه لاپاراسكوپي در مقايسه با گروه لاپاراتومي كمتر بوده است هم چنين تعداد موارد بدون عارضه در روش لاپاراسكوپي در مقايسه با روش لاپاراتومي كمتر مي باشد. در مطالعه Kuilerو همكارانش متوسط مدت عمل در به روش لاپاراسكوپي به طور متوسط 5 دقيقه كوتاهتر از روش لاپاراتومي بود (11). از طرف ديگر Levine كاهش 69% در مدت بستري و هزينه و كاهش 75% دوره نقاهت را در روش لاپاراسكوپي نسبت به روش لاپاراتومي نشان داد (12). در واقع بعضي از افراد داوطلب توبكتومي با روش لاپاراسكوپي پس از 24 ساعت به فعاليت طبيعي خود برميگردند در مطالعات قبلي بررسي عوارض نشان ميدهد كه چه در لاپاراسكوپي و چه در لاپاراتومي عوارض عمده نادر است اما عوارض مينور در لاپاراسكوپي كمتر مي باشد. بهر صورت بروز عوارض در هر دو گروه به تجربه جراح و استريل بودن وسائل مورد استفاده نيز بستگي دارد (2) همچنين يكي از مهمترين مزاياي لاپاراسكوپي در مقايسه با لاپاراتومي توانائي انجام اعمال جراحي مختلف با كمترين دستكاري شكمي است. مطالعات نشان ميدهد كه چسبندگي هاي پس از عمل، در روش هاي لاپاراسكوپي بسيار كمتر از اعمال لاپاراتومي است (13) بنابراين جمع بندي بررسي ها و شواهد قبلي و نتايج بررسي ما نشان ميدهد كه توبكتومي با استفاده از لاپاراسكوپي به عنوان يك روش، مؤثر و كم عارضه قابل تامل است. انجام اعمال جراحي مختلف توسط لاپاراسكوپي در بسياري از نقاط جهان انجام ميشود و با توجه به توانايي فراواني كه اين روش در مقايسه با روشهاي لاپاراتومي براي انجام اعمال جراحي دارد و با توجه به كيفيت بهتر عمل با روشهاي لاپاراسكوپي و نيز كاهش عوارض پس از عمل كاهش، مدت بستري، كاهش دوره نقاهت و نهايتاً كاهش هزينه هاي تحميل به فرد و جامعه استفاده از اين روش حائز اهميت است. علاوه بر اين بررسي عوارض ديررس 6 ماهه و يكساله و همچنين مقايسه موارد شكست توبكتومي و حاملگي در دو گروه نكات مهمي است كه بايد در پژوهش هاي بعدي مورد بررسي قرار گيرد. تقدير و تشكر از استاد ارجمند خانم دكتر صفدريان كه مرا در اين مطالعه راهنماي نمودند تشكر و قدرداني مي گردد. 2 <p>The aim of this study was to evaluate the quality, effective ness and the ideal method of tubal ligation with low complication, low bleeding and early recovery. In this investigation we compared the early complications and the quality of operations in two different tubul ligation techniqwes on totally 112 women who were operated in two centers in Tehran, Iran; In one group (53 women ) tubal ligation was carried out by laparascopy (with clips and cautery, whereas the other group (59 women) was operated using Pomeroy technique in laparotomy. Collection of information was done using questionare and case selection and grouping was performed randomly. The results showed that the duration of operation and hospitalization as well as the amount of bleeding were less in laparascopy group than in laparatomy group (P<0.05). Moreover, women in laparascopy group could completely retain their activity more rapidly than the other group. Hematoma and infection were only slightly higher in patients in laparatomy group (P>0.05), whereas pain occurred more aften in the laparatomy group (P<0.05). It can be concluded that complications occur less often in the laparascopy goup in compoarison with lapartony goup and tubal ligation with laparascopy can be considerd as a better and safer method.</p> 27 33 Soheila S Arefi سهیلا عارفی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Tubal LigationLaparascopyPomeroyLaparatomyClipsCouterization 38.pdf Mccann M,Cole L. Laparascopy and minilapartomy, two major advances in female sterilization. Stud Fam Plann. 1980, 11:119.##Population Information program. Minilapartomy and laparascopy: safe, effective and widely used. John Hopkins university. Population Reports. 1985, c-9.##Chick PH, Frances M, Patterson PJ. A comprehensive review of female sterilization, tubal occulusion methods. Clin Reprod Fertility. 1985, 3:81.##Daniell JF: Operative laparascopy, Fertil Steril. 1995, 41:558-562.##Taner CE, Aban M,Yilmas N,Senturk N, Toy E. Pomeroy tubal ligation by laparascopy and Minilapartomy. Adv Contracept. 1994, 10 (2):151-5.##Borten M. Laparascopic complication prevertion and Managment Toronto B.C. Deeker Inc. 1986.##Chapron C, Dubaisson J.B. Complication of Laparascopy service, Chirurgie Gyneacologique. CHU cochin.Pari, France. Human Reproduction. 2000, (15). P33##Hughes G, Liston WA. Comparison between laparascopic sterilization and tubal ligation. Br Med J. 1975,Sep, 13; 3(5984): 637-9##Mumford SD, Bhiwanid,wala PP, chi IC. Laparascopic and minilapartomy female sterilization compared in167 case. Lancet. 1980, 2(8203): 1060-70##letchworth AT, Kane JL, Noble AD. Laparascopy or Minilaprtary for stetilization of women. Obstet and Gynecol. 1980, 56,(1):119-21##Kulier R, Boulvain M, Walker D, de Candolle G, Compana A: Minilapartomy and endoscopic techniques for tubal sterilization Cochrane Database Syst Rev. 2000, (2): CD001328##Levine Rl. Economic impact of Pelvicoscopic surgery. J Rep Med. 1985, 30: 655-66##Murphy AA. Operative Laparascopy. Fertil Steril. 1987, 47:6##

Concealed Consent 2 1 مقدمه متصديان امور درماني و تحقيقات زيستي از نظر اخلاقي ملزم به جلب رضايت بيمار خود در امر درمان يا پژوهش هستند. پاره اي از نويسندگان بر اين باورند كه علاوه بر اين، آنان مكلف هستند بيمار را بطور كامل از بيماريش آگاه كرده و گونه هاي ممكن درمان را براي وي توضيح دهند. بين دو مفهوم رضايت و رضايت آگاهانه مي توان تفكيك نمود. ثمره تفكيك آن است كه آيا متصديان امور درماني به دريافت رضايت كلي از بيمار اكتفا كنند ( كه در اين صورت نيز ناچار به ارائه پاره اي آگاهيهاي كلي به وي هستند) و يا اينكه از نظر اخلاقي موظف به دريافت رضايت مبتني برآگاهي كامل بيمار به تمام جوانب مساله هستند؟ براي پاسخ به اين سوال ناگزير به بررسي مبناي اخلاقي ضرورت اخذ رضايت از بيمار هستيم ضرورت اخذ رضايت، مبتني بر اصل اخلاقي استقلال انسان مي باشد. هر انساني في نفسه موجودي است مستقل، و مي تواند براي سرنوشت خويش اتخاذ تصميم نمايد. اين اصل به ويژه در دستگاه اخلاق كانتي كه پايه آن بر غايت بودن انسان است، معناي ويژه اي مي يابد. بر اين مبنا چون هر انساني في حد ذاته يك غايت است، پس نمي توان از او استفاده ابزاري كرد. اصل منع استفاده ابزاري از انسان از نظر اخلاقي اصل منع قيموميت مآبي نسبت به انسان را به دنبال خواهد داشت. بدين تقرير كه هيچ كس از نظر اخلاقي حق ندارد قيم مآبانه براي سرنوشت ديگري تصميم گرفته و شخصيت او را ناديده بگيرد. لازمه تصميمات قيم مآبانه، استفاده ابزاري از انسان ديگر است، چه اينكه انسان را در حد موجودي بي اراده، و نه انسان مختار، تنزل مي دهد. البته بايستي به اين نكته توجه داشت كه قيموميت مآبي به معناي ناديده گرفتن منافع شخص مورد بحث نيست، بلكه آنچنان كه والدين درباره فرزندان خود ممكن است در جهت رعايت مصالح آنان اتخاذ تصميم نمايند، براي مثال پزشك نيز امكان دارد بدون توجه به نظر بيمار و در جهت رعايت مصالح او اتخاذ تصميم نمايد. لكن از آنجا كه فرض بر اين است كه انسان بايد آزادانه در مورد سرنوشت خود تصميم بگيرد، پزشكان در امور درماني مكلف هستند آگاهي هاي لازم براي اتخاذ تصميم را در اختيار بيماران خود قرار دهند. و در نتيجه مسأله درمان مبتني بر رضايت آزادانه و آگاهانه فرد باشد. طبيعي است عدم ارائه اطلاعاتي كه مي توانند در تصميم گيري بيمار مؤثر باشند، خود برخوردي غير صادقانه با اعتماد بيمار به پزشك مي باشد. بطور خلاصه ، ملاك عمل، رضايت آگاهانه بيمار است، و از آن جايي كه در مسائل پزشكي بدليل پيچيدگي و تخصصي بودن آنها، بيمار به طور معمول از طريق پزشك خود ( و نه از طريق مطالعه شخصي) مي تواند آگاهيهاي ضروري را براي اتخاذ تصميم دريافت دارد، روشن است كه پزشك مي تواند حتي با نحوه اطلاع رساني، در تصميم گيري و اظهار رضايت و يا عدم رضايت بيمار مؤثر باشد. بنابراين پزشكان از نظر اخلاقي مكلف هستند كه راه تصميم گيري آگاهانه بيمار را هموار سازند. پيش از پرداختن به تبيين انواع رضايت و بررسي مسأله رضايت مكنون ذكر اين نكته ضروري بنظر مي رسد كه نگارنده در اين مختصر به بررسي جنبه هاي اخلاقي موضوع مي پردازد. بديهي است كه اين موضوع مي تواند از منظر حقوق بشر، حقوق موضوعه و حتي فقه مورد بررسي قرار گيرد كه اميد است پژوهشگران و متخصصين حقوق بيوتكنولوژي و اخلاق پزشكي به تحليل و بررسي جنبه هاي ديگر اين موضوع بپردازند. انواع رضايت در يك تقسيم بندي متعارف، رضايت به دو نوع رضايت آشكار و رضايت ضمني تقسيم مي شود. اما نويسنده اين سطور مايل است نوع سومي كه آن را رضايت مكنون (concealed consent) مي نامد مورد بررسي قرار دهد. رضايت آشكار (Expressed consent) در موردي كه بيمار به پيشنهاد پزشكي به صورت روشن و صريح پاسخ مثبت داده و موافقت خود را بر انجام عمليات پزشكي ابراز مي دارد، با يك رضايت آشكار روبرو هستيم. البته رضايت آشكار الزاماً به صورت رسمي (formal) و مكتوب نيست. بلكه مي تواند به صورت شفاهي نيز ابراز شود. در حقيقت در اغلب مواردي كه بيماران به وسيله پزشكان مورد درمان قرار مي گيرند ابزارهاي اخذ رضايت رسمي وجود ندارد و موضوع در حد رضايت شفاهي و يا حداكثر رضايت كتبي ساده برگزار مي گردد. حتي لازم نيست تقارن زماني و يا موردي بين پيشنهاد پزشك و رضايت بيمار باشد، يعني ممكن است پزشك بصورت عام، نسبت به بيماري خاصي درمان ويژه اي پيشنهاد كرده باشد، حال اگر ماهها بعد بيماري به درمانگاه مراجعه نموده و موافقت خود را با آن نوع درمان ابراز دارد، رضايت صريح واقع مي شود. همچنين در موردي كه نوعي از درمان رايج و متعارف بوده و بيمار به درمانگاه مراجعه و تقاضاي آن نوع درمان را داشته باشد، براي مثال در روش درمان ناباروري GIFT مي توان گفت ما با يك رضايت صريح روبرو هستيم پس هر گاه فردي مراجعه كرد و خود خواستار استفاده از چنين روشي گرديد، بدان معناست كه بيمار مزبور آگاهي مقدماتي ولازم نسبت به اين نوع درمان داشته و رضايت خود را برآن ابراز نموده است. چنانچه گذشت حتي در رضايت صريح، ملاك عمل رضايت آگاهانه بيمار است. بنابراين مؤسسه درماني و يا پزشك مربوطه مكلف است آگاهي بيمار از نحوه درمان را احراز كند. رضايت ضمني (Implied consent) در مواردي كه بيمار به طور صريح اظهار نظر نكرده باشد، اين سؤال مطرح خواهد شد كه آيا مي توان از رفتار و اعمال او رضايت وي را استنباط كرد يا خير؟ در اين كه آيا از عمل بيمار مي توان كشف رضايت نمود دو ديدگاه غالب وجود دارد. يك ديدگاه معتقد است مفهوم رضايت ضمني مفهومي نادرست و غير واقعي است و چه اينكه هرگز نمي توان از رفتار شخص كشف رضايت آگاهانه نمود. ديدگاه ديگر بر اين باور است كه عمل حتي صريح تر از گفتار، نظر شخص را منعكس مي كند و لذا اگر بيمار با عمل خود نشان دهد نسبت به درمان رضايت دارد، حتي اگر به صورت صريح و زباني آن را بيان نكرده باشد، نشان دهنده رضايت او است. مثلاً وقتي بيمار با پيشنهاد پزشك بر روي تخت دراز مي كشد و آستين خود را براي تزريق بالا مي برد، اين خود به وضوح نشان ميدهد كه نسبت به درمان پيشنهادي رضايت دارد. نويسنده بر اين باور است كه در مواردي عمل بيمار مي تواند معرف نظر او باشد. با اين وجود، در قلمرو درمان هاي ناباروري با توجه به ماهيت مسأله و تكنيك هاي موجود، رضايت ضمني نمي تواند جايگاهي داشته باشد. به استثناء موارد اضطراري كه عمدتاً در سقط جنين ممكن است پيش آيد و امكان عملي اظهار رضايت صريح براي بيمار نباشد، در تمام روشهاي موجود درمان ناباروري بيمار ميتواند در يك فرآيند شفاف و روشن با آگاهي كامل اظهار نظر كند. رضايت مكنون (Concealed consent) رضايت مكنون مفهومي است كه نگارنده در يك برخورد اجمالي با موارد درمان ناباروري در مورد آن انديشيده است. از آنجا كه محور اصلي نوشتار حاضر حول اين موضوع است، با ذكر مثال به توضيح آن مي پردازم. فرض كنيد زوج جواني به درمانگاه مراجعه مي كنند پزشك يا مددكار درمانگاه ، متوجه مي شود نداشتن فرزند، آنها را از لحاظ روحي به شدت رنج مي دهد. گر چه اين زوج علاقمند به ادامه زندگي مشترك هستند اما بي فرزندي، زندگي مشترك آنها را به خطر انداخته است. بحران ناشي از بي فرزندي از يك سو، و علاقه شديد به ادامه زندگي مشترك از سوي ديگر، به حدي است كه زندگي آنها را تيره و تار كرده است. راه حل پيشنهادي پزشك، استفاده از اهداء تخمك، اسپرم و يا جنين فردي ديگر است. پزشك و يا مددكار درمانگاه معتقدند بدليل ملاحظات اجتماعي، فرهنگي و … بيمار حاضر به اظهار رضايت صريح براي تن دادن به چنين راه حل هايي نيست، ليكن اگر بدون اطلاع او اقدامي صورت گيرد و بصورت كاملاً محرمانه باشد، رضايت قلبي خواهد داشت. به ديگر سخن، بيمار نمي خواهد بداند كه چه درماني بر روي او صورت مي گيرد، فقط مي خواهد مشكل حل شود و خوشحال خواهد بود كه پزشك بدون آگاه كردن او، خود اقدام لازم را معمول دارد. چنين رضايتي، البته در صورت امكان اثبات آن، رضايتي است كه نگارنده آن را رضايت مكنون ناميده است. مورد ديگري كه براي رضايت مكنون مي توان تصور كرد شبيه رضايت ضمني است. با اين توضيح كه اگر بيمار اطلاعات پزشك را در مورد مسأله مورد نظر مي دانست، حتماً رضايت ميداد. در حقيقت پزشك در اين مورد خود را به جاي بيمار مي نشاند و به صلاح او عمل مي كند. صلاح بيمار در تن دادن به چنين درماني است حتي اگر به صورت صريح يا ضمني رضايت خود را اظهار نكرده باشد. نگارنده بر اين باور است كه هيچكدام از دو حالت فوق نمي تواند مستند عمل پزشك قرار گيرد. در مورد اول اصولاً به لحاظ علمي امكان احراز رضايت مكنون و در عين حال آگاهانه بيمار وجود ندارد، زيرا از ديدگاه روانشناسانه نمي توان ادعاي معقول وعلمي نسبت به مكنونات ذهني افراد داشت. به ديگر سخن، حتي با روانكاويهاي باليني هم نمي شود با قاطعيت و يا حتي احتمال نزديك به قطع اظهار داشت كه چه درذهن افراد مي گذارد. بنابراين امكان قابل استنادي بر كشف رضايت مكنون، ولي آگاهانه بيمار وجود ندارد. در مورد دوم، اصولاً تصميم گيري ها براي انسان بالغ عاقل به بهانه خيرخواهي و مصلحت انديشي كه به معني قيمومت است، از نظر اخلاقي مذموم بوده و نمي تواند مورد پذيرش قرار گيرد. قيم مآبي از نظر اخلاقي غير موجه و ناپسند مي باشد، زيرا تهديدي بر عليه استقلال فرد و آزادي انتخاب است. قيم مآبي نه تنها عقل متعالي انسان را ناديده ميگيرد، بلكه «من» انساني انسان را مورد بي حرمتي قرار ميدهد. نتيجه گيري گر چه پزشك گاه ممكن است از پاره اي رفتارها و گفتار بيمار گمان برد كه وي راضي به دريافت درماني خاص مي باشد، اما با توجه به پيچيدگي ساختار ذهني انسان از يك سو، و همچنين عدم وجود اضطرار پزشكي در بكارگيري روشهاي درمان ناباروري، هرگز نمي توان به استناد رضايت ضمني و يا رضايت مكنون بيمار هيچ گونه درماني بر روي او انجام داد، و تنها رضايت صريح، روشن و آگاهانه بيمار است كه مي تواند مستند اخلاقي براي هر گونه درمان باشد. تشكر و قدرداني با تشكر از اعضاي محترم گروه حقوق بيوتكنولوژي اخلاق پزشكي پژوهشكده ابن سينا جناب آقاي دكتر نوري، جناب آقاي دكتر جعفرزاده، و سركار خانم درخشان نيا كه ضمن بازخواني اين نوشته تذكرات عالمانه اي به راقم اين سطور ارائه دادند. 2 <p>The issue of consent is an old and controversial question in the field of medical ethics. Nowadays, informed consent is widely considered as a fundamental element in carrying out any medical treatments on a person. Yet some aspects of the issue are blurred and need to be studied more carefully. In the present, article after dealing with three concepts of Expressed Consent, Implied Consent and Concealed Consent, it will be concluded that expressed consent is the sole way to reveal and determine the consent of the person in the field of ART. The main contribution of this article is to discuss the concept of the concealed consent. It is discused that concealed consent is a fiction and thus may not be considered in medical treatments on a person.</p> 33 38 Seyyed Mohammad SM Seyed Fatemi سید محمد سید فاطمی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran ConsentInformed consentExpressed consentImplied consentConcealed consentMedical ethicsPaternalismMedical paternalism 39.pdf Fletcher N. and Holt J. Ethics. Law and Nursing, Manchester University press, Manchester, UK, (1995)pp:35-6##Kant I., (Translated by) Ellington J.M. Grounding for the Metaphysics of Morals, 3rd. ed. Hackett Publishing Company, INC. Cambridge (1993), pp:39-43##kennedy I, and Grubb A, Medical Law, Text with Materials, 2nd ed. Butterworths , UK. (1996), pp:101##Bedau, H.B. “Paternalism” in Oxford Companion to Philosophy, (1995) pp:47.##Berlin I, “Two Concepts of Liberty” (1969), reprinted in Goodwin,R.and Pettit Contemporary Philosophy an Anthology (1997), Blackwell Publishers, Political USA, pp:408##kennedy I, and Grubb A., 2nd. ed. Butterworths, (1996), pp:101##

The role of acrosin in reproduction 2 1 مقدمه در آكروزوم اسپرم پروتئين هاي متعددي وجود دارد كه براي برخورد اسپرم با تخمك و ورود اسپرم به داخل تخمكحائزاهميتمي باشند.اكثراين پروتئين ها آنزيم هاي هيدروليتيك بوده كه خاصيت هضم كنندگي دارند. يكي از اين آنزيم ها سرين پروتئازي است كه آكروزين (EC 3.4.21.10) نام گرفته است. در تمامي پستانداران آكروزين شامل سه قسمت زيموژن، قسمت كاتاليتيك و قسمت انتهايي مي باشد (1). قسمت انتهاي آميني (زيموژن) و قسمت كاتاليتيك در پستانداران مختلف داراي شباهت نسبي بوده و داراي توالي هاي اختصاصي خانواده سرين پروتئازها مي باشند. قسمت انتهاي كربوكسيلي (قسمت انتهايي) از لحاظ پرولين غني بوده و داراي شباهت چنداني در پستانداران مختلف نمي باشد. اين قسمت مختص آكروزين بوده و در پروتئازهاي ديگر يافت نمي گردد. آكروزين در ابتدا بصورت غير فعال پروآكروزين توليد گرديده و در هنگام واكنش آكروزمي و آزاد شدن اين آنزيم، با شكسته شدن قسمت ابتدايي آن به شكل فعال خود، آكروزين تبديل مي گردد. براي آكروزين تا بحال چند نقش در رابطه با لقاح فرض گرديده است. از آنجا كه آكروزين يك آنزيم است. يكي از نقشهاي آكروزين هضم زوناپلوسيدا مي باشد (2). از ديگر نقشهاي اكروزين اتصال اختصاصي اسپرم به زوناپلوسيدا مي باشد (2). تا كنون چند سيستم آزمايشگاهي جهت بررسي نقش آكروزين در فرآيند لقاح راه اندازي شده است (3) يكي از اين سيستم ها ايجاد موش هايي است كه فاقد آكروزين باشند. در اين موشها كه بوسيله تكنيك هدف گيري ژني يا نوتركيبي همگون توليد مي شود ژن خاصي را بطور اختصاصي از كار انداخته (4) و با از كار انداختن آن از سنتز پروتئين مربوطه جلوگيري مي نمايند. سپس با انجام آزمايشهايي در روي موشهاي فاقد پروتئين فوق نقش آن پروتئين مورد بررسي قرار ميگيرد. در تحقيقات ارائه شده در اين مقاله ژن آكروزين موش بوسيله هدف گيري ژني از كار انداخته شده و نقش آكروزين در باروري مورد بررسي قرار گرفته است. مواد و روشها 1- ساخت ژن نوتركيب قطعه اي از cDNA آكروزين موش جهت جداسازي قطعات ژنوميكي مورد استفاده قرار گرفت. كلون كاسميدي حاوي ژن آكروزين موش انتخاب و پس از هضم بوسيله آنزيمهاي EcoRI/KpnI قطعه اي از ژن در وكتور بلواسكريپت كلون گرديد. با استفاده از اين، ژن نوتركيبي حاوي نئومايسين و تيميدين كيناز ساخته شد (شكلA1) . در اين ژن نوتركيب قسمتهايي از اكسون 5 ژن آكروزين با ژن نئومايسين مورد تعويض قرار گرفته است. اين ژن نوتركيب بوسيله آنزيم NotI خطي شده و براي وارد كردن در سلولهاي بنيادي مورد استفاده قرار گرفت. 2- كشت سلولهاي بنيادي جنيني (ES) و توليد موشهاي كايمر (Chimer) دودمان سلولهاي بنيادي جنينيR1 بعد از كشت براي وارد نمودن ژن نوتركيب PA مورد استفاده قرار گرفت (4). مقداري از اين سلولها پس از تريپسينه كردن با50 ميكروگرم از ژن نوتركيب PA مخلوط شده و بوسيله الكتروپوراسيون در شرايط V250 وF500 به داخل سلولهاي ES وارد گرديد. سلولها در يك محيط غير انتخابي بر روي لايه اي از سلولها فيبروبلاست مقاوم در برابر G418 كشت داده شدند. بعد از كشت محلول حاوي G418 به مقدار g/ml350 و گانسي كلوير به مقدار g/ml2 به سلولها اضافه شده و سلولهايي مقاوم كه در برابر G418 و حاوي ژن نوتركيب بطور همگون مورد انتخاب قرار گرفتند. براي بررسي بهتر اين سلولها، بعد از تخليص DNA، اين DNA با آنزيم EcoRI مورد هضم قرار گرفت و پس از الكتروفورز بر روي غشاي نيتروسلولز منتقل شدند. اين بلات با قطعه اي از DNA آكروزين نشاندار بوسيله 32P (شكل A1) جفت (hybrid) شدند و پس از گذاشتن فيلم بر روي اين غشاء و ظاهر نمودن آن سلولهايي كه داراي ژن نوتركيب بصورت همگون بودند داراي دوباند و بقيه داراي يك باند بودند (شكل B1). از اين سلولها پس از تزريق به بلاستوسيست جهت توليد موشهاي كايمر استفاده شد. موشهاي كايمر بعد از جفت گيري با موشهاي معمولي براي توليد موشهاي هتروزيگوت و موشهاي هتروزيگوت براي توليد موشهاي هموزيگوت مورد استفاده قرار گرفتند موشهاي فاقد آكروزين در هر دو آلل PRR-/- نام گرفتند. 3- آناليز (Northern Blot)RNA براي تخليص RNA از كيت RNA NOW (ITC Biotechnology) استفاده شد. RNA تخليص شده از بيضه موشهاي هموزيگوت پس از جداسازي در ژل آگارز حاوي فرمالدئيد بر روي غشاء نايلون منتقل شدند. اين غشا براي هيبريديزاسيون بايك قطعه cDNA نشاندار شده آكروزين مورد استفاده قرار گرفت. 4- تست باروري پنج موش مذكر كه فاقد آكروزين بودند با 5 موش ماده معمولي جفت زده شدند بعد از حاملگي و تولد نوزادان، تعداد موشها مورد شمارش قرارگرفتند. براي لقاح خارج رحمي (IVF) از موشهاي فاقد آكروزين استفاده شد پس از جداسازي اسپرم از ناحيه دم (cauda) اپي ديديم اسپرمها در محيط آزمايشگاهي در تخمكهاي معمولي قرارگرفتند. لقاح پس از زمانهاي مشخص با شستن تخمكها در محلول M16 متوقف شده و حضور پيش هسته هاي پدري و مادري (PN) 6 ساعت بعد از توقف لقاح مورد بررسي قرار ميگرفت روز بعد نيز تعداد دوسلولي ها مورد شمارش قرار مي گرفت. 5- سخت نمودن لايه زوناپلوسيدا براي سخت نمودن زوناپلوسيدا، سلولهاي تخمك به مدت 30 دقيقه در معرض DMSO به غلظت هاي 6/0، 8/0، 1 و 2/1 مولار قرار گرفتند. اين تخمكها سپس براي لقاح خارج رحمي مورد استفاده قرار گرفتند. برخي از تخمكها نيز به مدتهاي متفاوت بعد از تزريق HCG كشت داده شدند و سپس براي لقاح خارج رحمي مورد استفاده قرار گرفتند. نتايج و بحث در تحقيق حاضر ژن آكروزين موش بوسيله روش هدفگيري ژني از كار انداخته شد و وظيفه آكروزين در باروري در اين موشها مورد مطالعه قرار گرفت. DNA تخليص شده از يك بانك ژنوميك موش 129/Sv جهت ساخت ژن همجوش مورد استفاده قرار گرفت، ابتدا ژن نئومايسين در اگزون 5 جاگذاري شده و سپس ژن تيميدين كيناز (TK) هرپس سيمپلكس در قسمت انتهاي 5 ژن همجوش قرار داده شد. اين ژن همجوش (PA) جهت هدفگيري ژني در سلولهاي بنيادي جنيني (R1)بكار گرفته شد. اتصال هدفدار به داخل ژنوم بوسيله DNA قسمت انتهاي 3 در ساترن بلات مورد بررسي قرار گرفت. در صورت هضم DNA بوسيله آنزيم EcoR1 ، لوكوس طبيعي kb 5/13 و لوكوس نوتركيب kb 2/15 مي باشند (شكل B1). سه كلون بطور نوتركيبي همگون، ژن همجوش در آنها متصل گرديد. اين كلونها براي تزريق در بلاستوسيست مورد استفاده قرار گرفت از اين تزريق 2 موش كايمر بدست آمد كه هر دو ژن نوتركيب مورد نظر را به نسل بعد انتقال مي دادند. از جفتگيري اين دو موش با موشهاي طبيعي موشهاي هتروزيگوت توليد شدند (B1). از جفتگيري موشهاي هتروزيگوت با هم، موشهاي هموزيگوت توليد شدند. موشهاي هتروزيگوت و هموزيگوت نر و ماده هيچگونه اختلالي را نشان نداده و بطور طبيعي بارور بودند. جهت بررسي بيان ژن آكروزين در بيضه موشهاي هتروزيگوت و هموزيگوت ، از بيضه اين موشها RNA كل تخليص گرديد و در نورترن بلات مورد تحليل و بررسي قرار گرفت. در موشهاي طبيعي ((+/+ آكروزين بصورت عادي و در موشهاي هتروزيگوت (+/-) بصورت كاهش يافته بيان مي گرديد. موشهاي هموزيگوت (-/-) كه ژن آكروزين در آنها از كار افتاده است، فاقد بيان ژن آكروزين در بيضه مي باشند (شكل 1C). جهت بررسي دقيقتر بيان ژن آكروزين نتيجه حاصل از نورترن بلات در RT-PCR مورد بررسي قرار گرفت. بيان ژن آكروزين در موشهاي هموزيگوت (-/-) مشاهده نگرديد. اين نتايج نشان مي دهد كه موشهاي هموزيگوت فاقد mRNA براي آكروزين مي باشند. در بررسي قسمت باروري، تمامي اين موشها بارور بوده و هيچگونه اختلالي را نشان نمي دادند. بدين جهت براي بررسي دقيق تر اسپرم موشهاي حاصل از روش لقاح خارج رحمي (IVF) استفاده گرديد. همانطور كه شكل (2) نشان مي دهد اسپرم موشهاي فاقد آكروزين (PRR-/-) 3 ساعت پس از افزودن اسپرم بطور معني داري تعداد كمتري از تخمكها را بارور مي كنند.(05/0P<) اين تغيير پس از 4 ساعت بسيار كمتر گرديد. اين نتايج نشان مي دهد كه اسپرمهاي فاقد آكروزين بطور آهسته تري تخمك را بارور مي نمايند. علاوه بر اين پس از سخت شدن زوناپلوسيدا بوسيله DMSO اسپرمهاي فاقد آكروزين تعداد كمتري از تخمكها را بارور مي نمايند (05/0P<) (شكل 3). تخمكهايي كه بيشتر در محيط آزمايشگاهي كشت داده شدند به ميزان كمتري توسط اسپرمهاي فاقد آكروزين بارور مي شوند (05/0P<) (شكل 4). بررسي بافت شناسي بيضه و مورفولوژيك اسپرم موشهاي فاقد آكروزين نشانگر اين مطلب است كه بيضه و اسپرم اين موشها تفاوتي نسبت به موشهاي طبيعي نشان نمي دهند. نتايج مذكور نشان ميدهد كه آكروزين به تنهايي در باروري تخمك داراي نقش اساسي نمي باشد. البته اين اسپرمها در لقاح خارج رحمي تاخير نشان مي دهند. اگر اسپرمهاي داراي آكروزين با اسپرمهاي فاقد آكروزين با يكديگر مخلوط گردند و در لقاح خارج رحمي (IVF) بكارگرفته شوند، تنها اسپرمهاي داراي آكروزين قادرند تخمك را بارور نمايند. اين مطلب ناشي از تاخيري است كه اسپرمهاي فاقد آكروزين از خود نشان ميدهند.در اين حالت اسپرمهاي طبيعي تخمك را بارور نموده و مانع بارور شدن تخمك بوسيله اسپرمهاي فاقد آكروزين مي گردند. البته در انسان در برخي مطالعات در انسان نشان مي دهد كه كمبود آكروزين باعث ناباروري مي گردد (7-5). در مواردي نيز كمبود آكروزين ناباروري ايجاد نمي كند. اين مطلب نشانگر اين است كه كمبود آكروزين همراه با فاكتورهاي ديگر مي تواند ايجاد ناباروري نمايد. بر اساس يافته هاي تحقيق حاضر سخت شدن زوناپلوسيدا همراه با كمبود آكروزين مي تواند ايجاد ناباروري نسبي نمايد. در انسان نيز برخي تخمكها كه داراي زوناپلوسيداي سخت يا قطورتر از زوناي معمولي مي باشند، در لقاح خارج رحمي داراي ميزان باروري كمتري مي باشند (10-8). البته احتمال دارد كه در غياب آكروزين آنزيم هاي ديگري در آكروزوم نقش آنرا بر عهده گرفته ودرنتيجه تاثيري در باروري ديده نمي شود. بر اساس اين نتايج آكروزين همراه با فاكتورهاي ديگر در باروري موثر بوده و كمبود يا اختلال عملكرد آن مي تواند ايجاد ناباروري تركيبي نمايد. تشكر و قدرداني پروژه حاضر در انستيتو ژنتيك انساني گوتينگن وابسته به دانشكده پزشكي شهر گوتينگن و با همكاري پژوهشكده ابن سينا انجام گرفته است. مخارج پروژه از طرف سازمان پژوهشهاي آلمان بوسيله طرح ويژه شماره 271 (SFB271) تامين گشته است. 2 <p>Acrosin, an endoprotease with trypsin-like substrate specificity, is localized in the acrosomal matrix as an enzymatically inactive zymogen, proacrosin, that is then converted into the active form as a consequence of the acrosome reaction. The physiological role of acrosin in fertilization has long been believed to be the limited proteolysis of the zona pellucida. Using homologous recombination, we have previously successfully produced male mice carrying a disruptive mutation in the acrosin gene and found that the mouse sperm lacking acrosin protease activity still penetrate zona pellucida and normally fertilize the egg .These Results provide evidence, that acrosin is not essential for sperm penetration of the zona pellucida. However, mouse sperm lacking acrosin showed a delay in penetration of the zona pellucida solely at the early stage after insemination .To elucidate the role of acrosin in fertilization, we have examined the involvement of acrosin in fertilization of zona pellucida after hardening and agining. We used DMSO for the hardening of zona pellucida. We observed that sperm lacking acrosin showed a reduced fertilitzation of eggs after zona pellucida hardening and aging. These data suggest the role of acrosin in combined infertility, which male and female factors are involved</p> 38 44 Karim K Nayernia کریم نیرنیا Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Ibrahim I Adham ابراهیم ادهم Institute of Human Genetics, University of Gothingen Institute of Human Genetics, University of Gothingen Germany Rahman R Shamsedin رحمان شمس الدین Institute of Human Genetics, University of Gothingen Institute of Human Genetics, University of Gothingen Germany Wolfgang W Engel ولفگانگ انگل Institute of Human Genetics, University of Gothingen Institute of Human Genetics, University of Gothingen Germany AcrosinGene targetingCombined infertilityAcrosome reaction 40.pdf Klemm U, Muller Esterl W, Engel W. Acrosin. the peculiar sperm-specific protease. Hum-Genet. 1991,87: 635-64.##Urch UA. Biochemistry and function of acrosin. In : Wasserman PM (ed.), Elements of Mammalian Fertilization. CRC Press. 1991, 234-48.##Bartoov B, Reichart M, Eltes F, Lederman H,Viedem P. Relation of human sperm acrosin activity and fertilization in vitro. Andrologia. 1994,26:9-15.##Joyner AL. Gene targeting : A practical approach. Oxford, New York, Tokyo. IRL Press.1996, pp:##Agarwal A, Loughlin KR. Measurement of acrosin activity in a group of patients with unexplained infertility. Prog Reprod Biol Med. 1992, 15:57-61.##Blackwell J, Kaminski JM, Bielfeld P, Mack SR, Zaneveld LJD. Human sperm acrosin: Further studies with clinical assay and activity in a group of presumably fertile men. J Androl. 1992, 13: 571-8.##Reichart M, Lederman H, Har-Even D, kedem P, Bartoov B. Human sperm acrosin activity with relation of semen parameters and acrosomal ultrastructure. Andrologia. 1993, 25:59-66.##Bertrand E, Van de Bergh M,Englert Y. Does zona pellucida tickness influence the fertilization rahte?Hum Reprod. 1995, 10:1189-93.##Familiari G, Nottola SA, Micara G, Aragoua C, Motta PM. Is the sperm binding capability of the zona pellucida linked to its surface structure ? J in vitro Fert Embryo Transfer. 1988, 5:134-43.##Nogues C, Ponsa M, Vidal F, Boala M,Egozcue J. Effects of aging on the zona pellucida surface of oocyte . J in vitro Fert Embryo Transfer. 1988, 5:225-9.##

Accuracy of ultrasonographic parameters in detection of growth restricted foetuses 2 1 مقدمه امروزه تشخيص حاملگيهاي پر خطر يكي از مسائل مهم در علم آبستني و زايمان مدرن به شمار مي رود. تشخيص جنين هاي IUGR نا متقارن يكي از اين موارد مي باشد. IUGR نا متقارن ناشي از نارسائي عروق خوني جفتي، يكي از علل مهم مرگ و مير جنين ها و نوزادان و نيز از علل معلوليت هاي جسمي و ذهني نوزاد پس از تولد مي باشد ( 1و2و3). امروزه روش معتبري جهت شناسائي اين جنين هاي در رحم وجود ندارد. روشهاي متفاوتي براي تشخيص IUGR نا متقارن ارائه شده است از جمله بهترين آنها استفاده از سونوگرافي مي باشد. بهر صورت پس از مشكوك شدن به عدم رشد جنين ( در سه ماهه سوم) يك مطالعه دقيق سونوگرافيك انجام مي گيرد كه اين مطالعه شامل اندازه گيري AC ، FL ، BPD ، HC ، AFI و در مواردي كه دستگاه سونوگرافي مجهز به داپلر باشد نسبتS/D در عروق بند نافي نيز اندازه گيري مي شود. اگر چه پارامترهاي ياد شده جزء پارامترهاي روتين در اندازه گيري رشد جنين به حساب مي آيند ولي تعداد انگشت شماري از مطالعات موجود مي باشد كه به طور مستقيم اين پارامترها را با هم مقايسه كرده باشند علاوه بر آن در مورد اعتبار اين پارامترها اتفاق نظر وجود ندارد و نسبتهاي متفاوتي از SE ، SP ، PPV ، NPU براي اين پارامترها عنوان شده است. در اكثر مطالعات انجام شده بر روي جنين ها اصطلاح IUGR به جنين هايي اطلاق مي شود كه وزن آنها كمتر از دهمين صدك نرمال نسبت به سن حاملگي باشد (6و5و4). امروزه اين روش، جهت تشخيص مناسب نبوده زيرا بسياري از جنين ها داراي وزن كم مي باشند ولي واقعاً دچار اختلالات رشدي نبوده و بطور ژنتيكي كوچك مي باشند، از طرفي ممكن است تعدادي از جنين هاي با وزن بالاي دهمين صدك نرمال وجود داشته باشند هر چند وزن طبيعي دارند ولي به آن حد پتانسيل رشد خود نرسيده اند. در اين تحقيق به جاي استفاده از وزن جنين به عنوان عامل تعيين كننده رشد مناسب جنين داخل رحم از PI استفاده شده است كه نسبت وزن جنين (گرم) به مكعب قد جنين ( سانتي متر) مي باشد. PI= 100* معمولاً نوزاداني كه در دوران جنيني مبتلا به نارسايي جفتي بوده اند قد نرمال و وزن كمتر از حد معمول دارند (9و8و7). Chang, Yau در يك مطالعه كه با هدف مقايسه فاكتورهاي مختلف تغذيه اي مانند PI، شاخصهاي توده بدن (BMI) و نسبت وزن به قد نوزاد و اندازه گيري دور بازو به دور سر نوزاد نشان دادند كه P1 و نسبت وزن به قد جنين بهترين پارامترهايي بودند كه با ضخامت چربي زير پوست ( كه نشاندهنده مناسب بودن تغذيه جنين در دوران بارداري است) ارتباط داشتند از اين جهت مي توان از اين فاكتور به عنوان يك شاخص نشان دهنده سوء تغذيه داخل رحم استفاده نمود . مواد و روشها اين مطالعه به صورت تصادفي و آينده نگر انجام شد. نمونه براي اين تحقيق شامل دو گروه خانمهاي باردار ايراني و استراليايي بودند. نمونه ايراني شامل 306 خانم باردار بود كه جهت معاينات سونوگرافيك به دو مركز تشخيص پلي كلينيك صدري و مراكز سونوگرافي بيمارستان امام در شهرستان شاهرود مراجعه نمودند سپس نوزادان اين خانمها در بيمارستان فاطميه بين مهر ماه 1377 تا تيرماه 1378 پيگيري شدند. به طور متوسط تعداد زايمانهاي شهرستان شاهرود حدود 3000 زايمان در سال مي باشد كه تقريباً تمامي زايمانها در تنها زايشگاه اين شهر در بيمارستان فاطميه صورت مي گيرد. خانمهاي بارداري كه خصوصيات زير را دارا بودند در گروه نمونه انتخاب شدند: 1- داشتن حاملگي يك قلو 2- داشتن قاعدگيهاي منظم و دانستن LMP 3- توانايي ديدن تمام اندازه گيريهاي مورد نياز براي تحقيق خانمهاي بارداري كه جنين هاي آنها ناهنجاري خاصي همانند آژنزي كليه داشتند و همچنين خانمهاي باردار با پارگي زودرس كيسه آب و خانمهاي حامله مبتلا به ديابت از گروه مطالعه حذف شدند. از 306 خانم مورد مطالعه 10 نفر بعلت عدم توانائي سونوگرافي در تعيين اندازه هاي AC و HC حذف شدند. پارامترهاي سونوگرافيك مورد مطالعه جنين ها عبارت بود از AC، HC، BPD، FL، AFI و پارامتر نسبت S/D در داپلر از عروق بندنافي نيز در جنين هاي استراليايي اندازه گيري شد. اندازه گيري اين پارامتر در جنين هاي ايراني بعلت مجهز نبودن دستگاه به داپلر ممكن نبود. جمع آوري اطلاعات در خانمهاي باردار ايراني توسط دستگاههاي سونوگرافي Hitachi,Ffsonic مجهز به ترانسديوسرMHZ 5/3 صورت گرفت نمونه مربوط به خانمهاي باردار استراليايي از بيمارستان شهر و لونگونگ در ناحيه Illawarra در كشور استراليا انتخاب شدند. تعداد نمونه 200 خانم باردار بودند كه در سه ماهه سوم حاملگي مورد معاينه سونوگرافيك قرار گرفتند. تمام پارامترهاي سونوگرافيك ذكر شد. براي نمونه ايراني در اين نمونه نيز اندازه گيري شد پارامترهاي سونوگرافيك در اين نمونه بوسيله دستگاه ATL 200 كه داراي ترانسديوسر MHZ 5/3 وMHZ 7 بود مورد ارزشيابي قرار گرفت. Inter,Intra-observer variablity براي سونوگرافرهاي جمع آوري كننده اطلاعات محاسبه گرديد كه در حد قابل قبولي بود. تعاريفي كه براي اندازه گيري پارامترهاي پيشنهادي مورد استفاده قرار گرفت عبارتند از: BPD: براي اين پارامتر برش عرضي سر در حالتي كه تالاموس ها قابل ديدن بود، مورد اندازه گيري قرار گرفت و سپس فاصله بين دو استخوان پاريتال از قسمت خارجي جمجمه به قسمت داخلي پاريتال طرف مقابل اندازه گيري شد. AC: ابتدا مقطع عرضي شكم جنين در ناحيه كبد مشخص گرديد. به طوري كه عروق پورت كبدي در اين مقطع ديده شوند سپس دور شكم در اين ناحيه اندازه گيري شد. FL: ابتدا استخوان فمور جنين مشخص شد و سپس ترانسديوسر به طوري چرخانده شده كه قسمت ديافيز استخوان فمور به طور كامل ديده شود سپس از قسمت شصت تا قسمت انتهايي فمور اندازه گيري شد دقت لازم بعمل آمد كه اپي فيزديستال استخوان فمور اندازه گيري نشود. AFI: بزرگترين مقطع با بيشترين حد مايع آمنيوتيك در هر يك از چهار گوشه بالائي و پائيني شكمي اندازه گيري شد و سپس مجموع اين اندازه گيريها محاسبه گرديد. AFI كمتر از 7 مشخص كننده اليگوهيدرآمنيوس و ميزان 25< AFI <7 طبيعي در نظر گرفته شد. نسبت S/D: S/D براي داپلر از عروق بند ناف بيش از SD3 بالاتر از حد طبيعي با توجه به سن حاملگي غير طبيعي در نظر گرفته مي شد. در جنين هاي استراليايي در مقايسه اندازه گيريهاي سونوگرافيك بدست آمده با جداول نرمال از جداول تهيه شده براي پارامترهاي مختلف AC و HC و FL و BPD و AFI و نسبت S/D استفاده شد. براي جنين هاي ايراني در اين تحقيق جداول خاص تهيه شد (توسط محققين اين تحقيق) در صورتيكه پارامترهاي سونوگرافيك SD2 پائين تر از حد نرمال براي آن سن حاملگي خاص بودند، آن پارامتر غير طبيعي (جنين IUGR) در نظر گرفته شد. براي انجام تست آماري از Package آماري STATISTICA مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از تست آماري Z تفاوت بين پارامترهاي سونوگرافيك مورد مطالعه در هر دو نمونه مقايسه گرديد. ميزان SE و SP و PPU و NPV هر پارامتر درتشخيص جنين هاي IUGR محاسبه گرديد. نتايج جدول 1 و 2 خصوصيات دموگرافيك هر دو نمونه ها را نشان مي دهند همانطور كه در جدول 1 مشاهده ميشود در گروه مادران ايراني جنين هاي نرمال جوانتر از مادران جنين هاي IUGR بودند و هر دو نمونه وزن جنين هاي IUGR كمتر از جنين هاي طبيعي مي باشد. دور سر جنين هاي IUGR نيز از جنين هاي نرمال كوچكتر مي باشد. SEو SP و PPU و NPVبراي تمام پارامترهاي ذكر شده در PI، دهمين صدك نرمال اندازه گيري شد مقادير مربوط به هر پارامتر در جدول 3 و 4 نشان داده شده است. در مقايسه اعتبار پارامترهاي متفاوت در تشخيص جنين هاي IUGR نا متقارن AC و HC بالاترين حساسيت را در گروه استراليايي دارا مي باشند، همچنين AC بالاترين حساسيت را در تشخيص IUGR در جنين هاي ايراني دارد. همانطور كه در جداول 3و4 مشاهده مي شود ارزش پيشگويي كننده مثبت تقريباً براي همه پارامترها پائين است. ميزان حساسيت AFI در گروه استراليايي 39% بود كه بسيار كم مي باشد. بحث و نتيجه گيري ميزان مرگ و مير و عوارض جنيني در جنين هاي IUGR حدود 4 تا 6 برابر بيش از جنين هاي نرمال مي باشد. عوارض كوتاه مدت ناشي از IUGR در زندگي آينده جنين عبارتند از پلي سيتمي، هيپوگليسمي و آسپيراسيون مكونيوم و عوارض بلندمدت، شامل مشكلات در يادگيري و مشكلات قلبي – عروقي مي باشند (2و1). تشخيص به موقع و صحيح IUGR و سعي در زايمان زودرس جنين در صورت نامساعد بودن محيط داخل رحمي بهترين راهكار جهت كاهش ميزان مرگ و مير و عوارض ناشي از IUGR نامتقارن هستند. در بررسي اعتبار پارامترهاي اولتراسونوگرافيك، AC و HC حساسيت و ارزش پيشگويي كننده مثبت و منفي يكساني در تشخيص جنين هاي IUGR دارند ولي SPE آنها كمي با هم متفاوت است. ميزان حساسيتSE و ويژگي SP براي AC در نمونه استراليايي مشابه حساسيت و ويژگي گزارش شده AC در مطالعات انجام گرفته شده توسط Brown مي باشد (17). ميزان ارزش پيشگوئي كننده مثبت در اين مطالعه براي پارامتر AC حدود 9% بوده كه كمي كمتر از اين ارزش در مطالعه بر روي جنين هاي استراليايي (11/0) مي باشد بالا بودن PPU در مطالعه ما احتمالاً مربوط به بالا بودن شيوع IUGR در جنين هاي استراليايي است در مطالعه Nielson در تشخيص IUGR نامتقارن نيز حساسيت در AC حدود 93% است (18)، AC بعنوان بهترين پارامتر پيشگوئي كننده IUGR در ساير مطالعات نيز گزارش شده است (5و4و19و20). حساسيت BPD در تشخيص جنين هاي IUGR در نمونه استراليائي حدود 75% و در نمونه ايراني 78/0 مي باشد. در مطالعات ديگر صحت BPD در تشخيص IUGR حدود 70-35% گزارش شده است (21و22). مسلماً ارزش BPD از HC كمتر بوده زيرا BPD يك اندازه گيري يك بعدي از سر جنين است و در مواردي كه تغيير شكل سر به صورت دو ليكوسفالي ( دراز بودن سر جنين) و يا براكي سفالي ( گرد بودن جنين) را داشته باشيم BPD جزء پارامترهاي مناسب تشخيص دهنده IUGR نمي باشند. نسبت S/D در مطالعات داپلر از عروق بندنافي درگروه استراليائي از حساسيت و ارزش پيشگويي كننده مثبت پائيني برخوردار است. و اين مشابه نتايج برخي از مطالعات گذشته است (24و33). از آنجا كه در اكثر مطالعات جنين داراي IUGR ، وزن آن كمتر از دهمين صدك نرمال براي سن حاملگي در نظر گرفته مي شود بنابراين جاي تعجب نخواهد بود، اگر نسبت S/D درعروق بند ناف نتواند پيشگوئي كننده اندازه جنيني باشد مسلماً در اين موارد استفاده از پارامترهاي بيومتريك پيشگويي بهتري را نسبت به داپلر دارند. نكته مهم قابل توجه در بررسي اعتبار يك تست اين است كه آن تست از ارزش پيشگوئي كننده مثبت بالايي برخوردار باشد. يعني هنگامي كه تست تشخيصي مثبت مي باشد واقعاً جنين IUGR وجود داشته باشد همانطور كه در جداول 3و4 مشاهده مي شود ارزش پيشگوئي كننده مثبت هيچيك از پارامترها مورد مطالعه بالا نمي باشد نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد كه اگر چه AC بهترين پارامتر سونوگرافيك در تفكيك جنين هاي IUGR از طبيعي مي باشد ولي چون ارزش پيشگوئي مثبت آن پايين مي باشد روش معتبري جهت تشخيص قطعي IUGR نيست. در حقيقت در صورت مثبت بودن هر يك از پارامترهاي ذكر شده، جنين به احتمال بيشتري طبيعي در نظر گرفته مي شود به طور كلي استفاده از پارامترهاي سونوگرافيك به طور انفرادي روش تشخيص خوبي نبوده و به نظر مي رسد كه استفاده از يك شاخص تشخيص كه تركيبي از پارامترهاي سونوگرافيك وساير عوامل خطرزاي IUGR باشد وسيله بهتري جهت تشخيص IUGR است. صحت اين ادعا در تحقيق ديگري كه توسط محققان اين مطالعه انجام گرفته است، نشان داده شده است. تقدير و تشكر: از همكاري دكتر Warren Davis در بيمارستان دلونگونگ و ساير پرسنل در بخش تشخيص قبل از تولد و نيز از همكاران خانم دكتر فريده حلاجي و آقاي دكتر حسن امير خليلي در بيمارستان امام شاهرود جهت كمك در جمع آوري اطلاعات كمال قدرداني و تشكر را داريم. اين مقاله در سال 2000 در سيدني در كنفرانس Australian Institate of Medical Scientist ارائه شده است. 2 <p>The main objective of this study was to review the diagnostic accuracy of different single ultrasonographic parameters in predicting intrauterine growth restricted foetuses as defined by Ponderal Index at birth. The study sample composed of two sets of data from Iran and Australia. The Iranian samples consisted of 296 Iranian women. All the study women received prenatal care and delivered at Fatemieh Hospital in Shahrood, Iran. The data from 200 Australian fetuses were obtained from the ultrasound section at the Wollongong Hospital in Australia. Ultrasonographic measurements of Biparietal diameter (BPD), femur length (FL), head circumference (HC), abdominal circumference (AC), amniotic fluid index (AFI) and Doppler from umbilical arteries (S/D ratio) were obtained. Only those pregnancies were included in which the estimated date of delivery (EDD) by LMP (last menstrual period) agreed within 14 days with the estimated date of delivery determined by the initial ultrasound examination. Sensitivity (SE), specificity (SP), positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) were calculated for single proposed ultrasound parameters in the both Iranian and Australian samples. When different variables are compared, with a cut off point at or below the 10th percentile, AC and HC had the highest sensitivities in the Australian sample while AC was the most sensitive parameter for IUGR detection in the Iranian sample. BPD has a reasonably high sensitivity at this threshold. The AFI ratio had the lowest sensitivity in predicting IUGR in the Australian sample. Positive predictive values were low in all of the parameters in both the Iranian and Australian samples. Our results indicate that reduced AC was the best single parameter in discriminating between IUGR and non-IUGR fetuses with the highest sensitivity among the proposed parameters in the both Iranian and Australian sample. However the positive predictive value of this parameter is low. This means that a high number of false positive cases is detected using each parameter which reduces the usefulness of identification. Other ultrasound obstetrical parameters may also have a reasonable level of sensitivity, however the positive predictive value of all parameters is low. On the whole our results show that although the examined ultrasonographic criteria may detect a group of fetuses that need close antepartum surveillance, none of these parameters is appropriate enough to be used in isolation in clinical practice. Using single ultrasound parameters does not have high sensitivity and positive predictive values in detection of fetal growth restriction. This limits both accuracy and utility of these tests in the detection of IUGR fetuses.</p> 4 11 Parvin P Niknafs پروین نیک نفس Obstetrics ultrasound, Shahrood University of Medical Sciences. Obstetrics ultrasound, Shahrood University of Medical Sciences. Iran John J Sibbald جان سیبالد Midwifery and Physiology, Wollongong University Midwifery and Physiology, Wollongong University Australia PregnancyUltrasonographic parametersIUGRFetus growth 35.pdf Divon MY, Foetal growth restriction,1st edn. Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia. 1997, pp:1-50.##Barker D, Bull AR, Osmond.C, Simmonds SJ. Foetal and placental size and risk of hypertension in adult life. BMJ. 1990, 301: 259-301.##Cater J, Gill M. The follow up study, medical aspects, in low birth weight, a medical, physiological and social study, First edn. Illsely R Mitchell RG (eds.), San Francisco, Chilchester. 1984, 191:205.##Owen P, Khan K. Foetal growth velocity in the prediction of intrauterine growth retardation in a low risk population, .Br J Obstet Gynaecol. 1998, 105:536-40.##James D, Parker M, Smoleniec JS, Karlson L. Comprehensive foetal assessment with three ultrasonographic characteristics. Am J Obstet Gynecol. 1992, 166:1487-95.##Skovron MI, Berkovitz GS, Lapinski R, Persson LH. Evaluation of early third trimester ultrasound screening for intra-uterine growth retardation. J Ultrasound Med. 1991, 10:153-9.##Villar J, Deonis M, Kestler E. The difference neonatal morbidity of the intra-uterine growth retardation syndrome, Am J Obstet Gynaecol. 1990, 163:151-7.##Guashino S, Spillino A, Stola E, Ramakers A. The significance of the Ponderal index as a prognosis factor in low birth weight population. Biol Research Pregnancy. 1986, 7:121-7.##Khoury M, Berg C J, Calle E. The Ponderal index in term newborn siblings. Am J of Epidemiol. 1990, 132:576-83.##Yau K I, Chang M. Weight to length ratio-a good parameter for determining nutritional status in preterm and full term newborns. Acta Paediatr. 1993, 82:427-9.##Deter RL, Harrist RB, Hadlock FP, Carpenter R J. Foetal head and abdominal circumferences, a clinical re-evaluation of the relationship to menstrual age. J Clin Ultrasound. 1982, 10:365-72.##Hadlock FP, Deter RL, Harris RB, Park SE. Foetal biparietal diameter, Rationale choice of plane of section for sonographic measurement. Am J Roentgenology. 1982, 138:181-4.##Warda AH, Deter RL, Rossavik I, Gohari P. Foetal femur length, a critical re-evaluation of the relationship to menstrual age, Obstet Gynecol. 1985, 66:69-75.##Hadlock FP, Deter RL, Harrist RB, Park SK. Foetal biparietal diameter: A critical re-evaluation of the relationship to menstrual age by means of real time ultrasound. J Ultrasound Med. 1982, 1:97-104.##Moore TR, Cayle G E. The amniotic fluid index in normal pregnancy, Am J Obstet and Gynecol. 1990, 162: 1168-73.##Fogarty P. Continuous wave Doppler flow velocity waveforms from the umbilical artery in normal pregnancy. J Paediat Med. 1990, 18:51-3.##Brown HL, Miller JM Gabert HA, Kissling G. Ultrasonic recognition the small-for gestational fetus. Obstet Gynecol. 1987, 60: 693-6.##Nielson JP, Munjanja SP, Whitfield CR Screening for small for dates fetuses: A controlled trial. Br M J. 1984, 289:1179-83.##David M, Tagliavini G, Pilu G, Rudenholz A. Receiver-operator characteristic curves for the ultrasonographic prediction of small-for gestational age fetuses in low risk pregnancies, Am J Obstet Gynaecol. 1996, 174:1037-42.##Meyer WJ, Gauthier D. Ramakrishnan V, Sipos J. Ultrasonographic detection of abnormal foetal growth with the gestational age-independent, transverse cerebellar diameter/abdominal circumference ratio. Am J Obstet Gynaecol. 1994, 171: 1057-63.##Crane JP, Kopta M.M. Comparative newborn antropometric data in symmetric versus asymmetric intra-uterine growth retardation. Am J Obstet Gynecol. 1980, 138: 518-22.##Bewley S, Cooper D, Campbell S. Doppler investigation of uteroplacental circulation in the second trimester. Br J Obstet and Gynecol. 1991, 98: 871-873.##Newnham JP, O’dea MR, Reid K, Diepeveen DA. Doppler flow velocity waveform analysis in high risk pregnancies: A randomised controlled trial. Br J Obstet Gynaecol. 1991, 98:956-63.##Miller JM, Gabert HA. Comparison of dynamic and Doppler ultrasonography for the diagnosis of the small for gestational age fetus. Am J Obstet and Gynaecol. 1992, 166:1820-26.##

Production and characterization of a murine monoclonal antibody recognizing a conformational epitope on hCG 2 1 مقدمه هورمون hCG تنها عضو خانواده هورمون هاي گليكوپروتئيني است كه توسط جفت ترشح مي شود. ساير هورمون هاي اين خانواده شامل FSH,LH و TSH از غده هيپوفيز ترشح مي شوند (1). هر يك از اعضا اين خانواده از دو زير واحد آلفا و بتا تشكيل شده اند كه زير واحد آلفا در تمام اين هورمون ها يكسان و از 92 اسيدآمينه ساخته شده است ولي زير واحد بتاي هر هورمون با هورمون ديگر متفاوت است. با اين وجود بين زير واحد بتاي هورمون hCG (hCG) و بتاي هورمون hLH (hLH) بيش از 80 درصد همولوژي وجود دارد. در حقيقت تنها تفاوت اساسي hCG و hLH وجود يك قطعه پپتيدي واقع در انتهاي كربوكسيل زير واحد hCG بنام hCG-CTP است كه شامل اسيدهاي آمينه 145-115 مي باشد. اين قطعه فقط درزير واحد hCG وجود دارد و زير واحد hLH فاقد آن است (2و1). hCG و ساير هورمون هاي گليكوپروتئيني ملكول هاي غني از پيوندهاي دي سولفيدي بوده، بطوريكه زير واحدهاي آلفا و بتاي هورمون hCG به ترتيب داراي 5و6 پيوند دي سولفيدي در ساختمان خود هستند (3و2). اخيراً مقالات مروري در مورد انواع اشكال متابوليكي، ضرورت و اهميت باليني اندازه گيري، روش هاي سنجش ايمونولوژيكي هورمون hCG و متابوليت هاي آن به چاپ رسيده است (5و4). سنجش و تشخيص ايمونولوژيكي hCG با آنتي سرم يا آنتي بادي پلي كلونال داراي مشكلات زيادي است كه مهمترين آن وجود واكنش متقاطع بين اعضاء خانواده هورمون هاي گليكو پروتئيني است كه بنوبه خود مربوط به يكسان بودن زير واحد آلفا در اين هورمون ها و شباهت نسبي زير واحدهاي بتا است. يكي از راههاي بالقوه در جهت برداشتن اين مشكل توليد آنتي بادي منوكلونال عليه اپي توپهاي اختصاصي براي اين هورمون ها است. اين اپي توپها ممكن است بصورت خطي و پيوسته (Continuous) و يا بطور غير پيوسته (Discontinuous) باشد (9). اپي توپهايي نيز شناخته شده اند كه اسيدهاي آمينه سازنده آنها قسمتي بر روي يك زير واحد و قسمتي بر روي زير واحد ديگر هورمون وجود دارد. اينگونه اپي توپ ها را كه وابسته به ساختمان سوم و چهارم پروتئين هستند، اصطلاحاً اپي توپ هاي فضايي (Conformational) مي نامند. به استثناء دو اپي توپ پيوسته و خطي كه در ناحيه انتهاي كربوكسيلي مولكول hCG (hCG-CTP) و بخشي از دو جايگاه آنتي ژني كه در زير واحد آلفا وجود دارد، اپي توپ هايي كه درمولكول hCG وجود دارند از نوع غير پيوسته و وابسته به ساختمان سوم و چهارم ملكول hCG و زير واحدهاي آن است (7و6). در اين پژوهش يك آنتي بادي منوكلونال موشي عليه هورمون hCG توليد شده و خصوصيات اين آنتي بادي مورد بررسي قرار گرفته است. مواد و روشها - ايمونيزاسيون: ايمونيزاسيون بروي موش هاي ماده نژاد Balb/C با سن 8-6 هفته انجام و hCG تخليص شده از منبع ادراري به عنوان ايمونوژن استفاده شد. تزريق hCG به اين موش ها در سه نوبت انجام گرفت، در نوبت اول 40 ميكروگرم آنتي ژن با ادجوانت كامل فروند U.S.A) Sigma,) بداخل صفاق موش تزريق شد. تزريقات دوم وسوم با فاصله 3 هفته و مقدار 20 ميكروگرم آنتي ژن به همراه ادجوانت ناقص فروند U.S.A) Sigma,) و بصورت داخل صفاقي انجام گرفت. حدود 2 تا 3 هفته پس از سومين تزريق از موشها خونگيري به عمل آمد و حيوان داراي بيشترين تيتر آنتي بادي براي انجام فيوژن انتخاب و سه روز قبل از فيوژن 20 ميكروگرم از آنتي ژن محلول در بافر سالين بصورت داخل وريدي به حيوان مورد نظر تزريق شد. - تكثير و آماده سازي سلول هاي ميلوما: يك هفته قبل از فيوژن سلول هاي ميلوماي موشي با نام SP2/O در محيط كشت كامل حاوي محيط DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle's Medium,Gibco,U.S.A) حاوي 10 درصد سرم جنين گاو (Fetal bovine serum,Gibco,U.S.A)FCS و آنتي بيوتيكهاي پني سيلين G (U/L 100000 ) و استرپتومايسين (mg/L 100) (U.S.A Sigma,) و اسيدآمينه ال- گلوتامين، در انكوباتور 37 درجه با 5 درصد CO2 و رطوبت اشباع، تكثير شدند. هنگاميكه رشد سلول ها به فاز لگاريتمي رسيد و تعداد سلولهاي زنده به بيش از 95 درصد رسيد از آنها براي فيوژن استفاده شد. - فيوژن وتوليد سلول هاي هيبريدوما: سلولهاي طحال موش ايمن شده بيرون آورده شد و با استفاده از پلي اتيلن گليكول (, Sigma, U.S.A 50% (PEG 1000 با سلول هاي ميلوماي موشي SP2/0 بانسبت 1:7 با روش استاندارد ادغام شدند (10). سلول هاي بدست آمده از اين فيوژن در محيط كشت كامل DMEM حاوي 20 درصد سرم جنين گاو قرار داده شد و سپس سلول ها با پي پت هم زده شد تا بطور يكنواخت پراكنده شود. اين سلول ها در پليت هاي 96 حفره اي (Nunc,Denmark) تقسيم شدند. پليت ها در انكوباتور با 5 درصد Co2 و حرارت 37 درجه سانتيگراد و رطوبت اشباع به مدت يك روز قرارگرفتند. سپس50 ميكروليتر از محيط انتخابي HAT حاوي هپيوگزانتين3-10*5 مولار، آمينوپترين 5-10×2 مولار و تيميدين4-10×8 مولار Sigma,U.S.A) HAT,50X,) به آنها اضافه شد. حفرات سلولي به فاصله چند روز يكبار با محيط انتخابي HAT تعويض محيط شدند. - غربالگري و كلونينگ هيبريدها: محلول رويي (سوپرناتانت) پليت 96 حفره اي حاوي سلول هاي هيبريد در حال رشد از نظر توليد آنتي بادي مورد آزمون قرار گرفت. سلول هاي هيبريد مثبت، پايدار و مولد آنتي بادي با استفاده از روش رقت محدود كننده (Limiting dilution) چند مرتبه كلون شدند و هر بار بهترين حفرات از نظر توليد آنتي بادي و تراكم سلولي انتخاب و تا حصول اطمينان از تك كلون شدن هيبريدها، عمل كلونينگ ادامه داده شد. تك كلون انتخابي تكثير و از پليت 96 حفره اي به پليت 24 حفره اي (Nunc,Denmark) وسپس فلاسك هاي 50 ميلي ليتري (Nunc,Denmark) انتقال داده و به تعداد كافي جمع آوري و در ازت مايع نگهداري شد. - تعيين مشخصات آنتي بادي منوكلونال: تعيين مشخصات آنتي بادي منوكلونال با استفاده از روشهاي الايزا و ايمونوبلاتينگ مورد بررسي و مطالعه قرار گرفت. يك مجموعه از هورمونهاي بسيار خالص و نيز شكل نوتركيب آنها شامل hCG طبيعي CG-B,Sigma,U.S.A)) و hLH طبيعي (Seradyn,U.S.A ) و هورمونهاي نوتركيبhCG,hCG,hCG,TSH hCG-CTP, (Sigma,U.S.A) وFSH طبيعي (Seradyn, U.S.A) در اين بررسي مورد استفاده قرار گرفت. 1- آزمون الايزا براي تعيين ويژگي آنتي بادي منوكلونال ترشحي ضد hCG ابتدا محلول حاوي 2 ميكروگرم در ميلي ليتر هر آنتي ژن را در بافر PBS 15/0 مولار و 2/7=pH تهيه كرده و 50 ميكروليتر از آن را به حفرات ميكروپليت الايزا(Maxi sorp,Nunc,Denmark) اضافه شد. پليت هاي مذكور 90 دقيقه در انكوباتور 37 درجه سانتي گراد قرار گرفتند و سپس با بافر شستشو ](بافر PBS حاوي 05/0 درصد توئين 20 (Merck,Germany)[ سه مرتبه شسته شدند. در لايه دوم از 50 ميكروليتر سوپ روئي سلول هاي مولد آنتي بادي يا 50 ميكروليتر از آنتي بادي تخليص شده با غلظت 4-2 ميلي گرم در ميلي ليتر استفاده شد و پس از 90 دقيقه انكوباسيون در37درجه سانتي گراد و شستشوي پليت ها با بافر شستشو، براي آشكار كردن آنتي باديهاي منوكلونال متصل به آنتي ژن از كونژوگه پراكسيد از ضدايمونوگلوبولين موش (HRP-Sheep anti mouse-Ig) (Sigma, U.S.A) با رقت 1:1000 استفاده شد. پس از 90 دقيقه انكوباسيون و شستشوي مجدد از سوبستراي O-Phenylenediamine(OPD, Sigma, U.S.A)به منظور توليد رنگ استفاده شد. پس از 15-10 دقيقه واكنش با اسيد سولفوريك 20 درصد متوقف و (Optical Density)OD حاصل با استفاده از دستگاه (Organon Teknika, Reader 210 ,Austria) Elisa Reader در طول موج 492 نونامتر تعيين و نتايج ثبت شد. 2- آزمون الايزا براي تشخيص ايمونوگلوبولين ترشحي موش : سوپ حفرات حاوي هيبريدهاي در حال رشد از نظر توليد مجموع آنتي باديهاي موشي با روش الايزا مورد بررسي قرار گرفت. ابتدا 50 ميكروليتر آنتي بادي تصفيه شده گوسفند ضد ايمونوگلوبولين موش ( توليد شده در آزمايشگاه آقاي دكتر شكري) با غلظت 10 ميكروگرم در ميلي ليتر در بافر PBS 15/0 مولار و 2/7=pH در حفرات الايزا قرارگرفت. پس از شستشوي حفرات با بافر شستشو ، 50 ميكروليتر از سوپ حفرات سلول هاي هيبريد به پليت اضافه شد. ادامه آزمون الايزا مشابه روش ذكر شده در قسمت قبل انجام گرفت. 3- بررسي تاثير مهاري پپتيد hCG-CTP بر اتصال hCG به آنتي بادي منوكلونال: ابتدا 50 ميكروليتر از هورمون hCG نوتركيب با غلظت 2 ميكروگرم در بافر PBS در حفرات الايزا تثبيت شد. سپس كونژوگه پراكسيد ازآنتي بادي منوكلونال توليد شده عليه hCG با رقت 1:750 موارد فوق باشد. اضافه شد ( اين كونژوگه بروش پرآيودات در آزمايشگاه دكتر شكري توليد شده است). قبل از اضافه كردن كونژوگه؛ به مدت 2 ساعت اين كونژوگه با پپتيد (Sigma,U.S.A)hCG-CTP با غلظت هاي 10،5،5/2،25/1و61/0 ميكروگرم در ميلي ليتر در دماي 37 درجه انكوبه شد. در حفرات كنترل كونژوگه مورد نظر بدون مجاورت با پپتيد استفاده شد و ميزان مهار آنتي بادي توسط هورمون hCG با استفاده از فرمول زير محاسبه شد: 4- تعيين ايزوتيپ آنتي بادي منوكلونال بروش الايزا: ابتدا آنتي بادي هاي ضد زير كلاس هاي IgA,IgG3,IgG2b,IgG2a,IgG1 و IgM موشي كه از بز تهيه شده اند Sigma, U.S.A)) با رقت مناسب در پليت الايزا تثبيت شدند. سپس سوپ مربوط به آنتي بادي منوكلونال به همه حفرات اضافه شد.شرايط آزمون الايزا و ادامه آزمون مشابه مراحل مورد 1 در بالا مي باشد. 5- ايمونوبلاتينگ: فعاليت و ويژگي آنتي بادي منوكلونال با استفاده از روش استاندارد ايمونوبلاتينگ (11) مورد ارزيابي قرار گرفت. بطور خلاصه ابتدا آنتي ژن هاي طبيعي خالص ويا نوتركيب با روش الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد (SDS-PAGE) با استفاده از ژل 5/12 درصد الكتروفورز شد. اين آنتي ژنها قبل از الكتروفورز به دو گروه تقسيم شدند. گروه اول بدون احياء پيوندهاي دي سولفيدي موجود در ساختمان آنها و گروه دوم همان آنتي ژنها با احياء پيوندهاي دي سولفيدي به كمك تركيب احياء كننده 2- مركاپتواتانول 2ME)) الكتروفورز شدند. هر دو گروه آنتي ژن ها در بافر Tris-Hcl يك مولار و pH=7 حاوي SDS و رنگ بروموفنل بلو و ساكاروز 80 درصد حل شدند. و قبل از الكتروفورز به مدت 3-2 دقيقه جوشانيده شده و سپس به چاهك هاي ژل الكتروفورز منتقل و الكتروفورز با جريان حداكثر و ولتاژ 150 ولت انجام شد. پس از الكتروفورز، پروتئين ها از داخل ژل به كاغذ نيترات سلولز (Schleicher & Schuell,Germany) منتقل شد. عمل انتقال با استفاده از دستگاه الكتروبلاتينگ (شركت اختريان ، ايران) و در طول شب با ولتاژ ماكزيمم و شدت جريان 60 ميلي آمپر انجام گرفت. با رنگ آميزي كاغذ نيترات سلولز بارنگ پانسو-S (Ponceau S stain,Gelman,U.S.A) با غلظت 5/0 گرم در ليتر، در بافرPBSمحل انتقال باندها مشخص و رديف هاي مربوط به هر آنتي ژن با تيغ بريده و شمارگذاري شد. سپس رنگ پانسو S با بافر PBS شسته شد. به منظور بلوكه كردن نواحي فاقد پروتئين در ورقه نيترات سلولز و پيشگيري از واكنش غير اختصاصي از شير خشك فاقد چربي (Skim Milk,Merck,Germany) با غلظت 5/2 گرم درصد استفاده شد سپس آنتي ژنهاي روي كاغذ نيترات سلولز بمدت 120 دقيقه باسوپ حاوي آنتي بادي منوكلونال بر روي شيكر مجاور شدند. پس از 5 بار شستشو با PBS هر بار به مدت 5 دقيقه روي شيكر، كاغذهاي نيترات سلولز با كونژوگه پراكسيد از ضد ايمونوگلوبولين موش (Sigma, U.S.A. (HRP-Sheep anti mouse-Ig, با رقت 1:500 به مدت90 دقيقه مجاور و سپس 5 بار با PBS شسته شدند. تشكيل اتصال آنتي ژن- آنتي بادي با استفاده از 25 ميلي گرم سوبستراي دي آمينوبنزيدين (DAB hydrochloride.Sigma, U.S.A.) در 50 ميلي ليتر با فرTris – Hcl 05/0 مولار و 6/7 =PH بهمراه 150 ميكروليتر محلول 3 درصد H2O2 ظاهر شد. پس از ظهور باندها و اكنش با شستشوي كاغذ نيترات سلولز با آب مقطر متوقف گرديد. - تهيه آسيت و تشخيص آنتي بادي منوكلونال با روش الكتروفورز استات سلولز: 4-3 ميليون از سلول هاي هيبريدوماي مولد آنتي بادي را با 5/0 ميلي ليتر از محيط DMEM بدون سرم مخلوط كرده و بداخل صفاق موش Balb/C تزريق گرديد. موشها يك هفته قبل از تزريق سلول 5/0 ميلي ليتر ماده پريستين (Pristane,Sigma,U.S.A.) بطور داخل صفاقي دريافت كرده بودند. 15-10 روز پس از تزريق سلول ها، مايع آسيت در زير صفاق موش جمع شد كه پس از كشتن موش در شرايط استريل از صفاق خارج و به داخل لوله استريل منتقل و پس از سانتريفوژ، مايع رويي بعنوان مايع آسيت كه منبع غني از آنتي بادي است جمع آوري و در 20- درجه سانتيگراد نگهداري شد. سلول هاي تكثير شده در صفاق موش نيز فريز و نگهداري شدند. مايع آسيت با استفاده از روش استاندارد الكتروفورز استات سلولز، الكتروفورز شد. بطور خلاصه نمونه مايع آسيت بروي كاغذ استات سلولز (Helena,U.S.A) قرار گرفت و با استفاده از منبع تغذيه و تانك الكتروفورز (شركت اختريان ، ايران) و بافر باربيتال سديم 03/0 مولار و 6/8=PH با ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقيقه عمل الكتروفورز انجام شد. سپس كاغذ استات سلولز به مدت 10 دقيقه در رنگ پانسو-S قرار گرفت و بعد از آن سه مرتبه هر بار 2 دقيقه در داخل محلول رنگبر (اسيد استيك 5 درصد) رنگ آن حذف گرديد. در مرحله بعد كاغذ استات سلولز بمدت 5 دقيقه در متانول خالص آبگيري شد و سپس 10 دقيقه در محلول شفاف كننده(Clearaid, Helena,U.S.A.) قرار گرفت و بالاخره كاغذ استات سلولز در انكوباتور 60-50 درجه سانتيگراد خشك شد. -تعيين تيتر آنتي بادي منوكلونال در مايع آسيت با روش الايزا: مشابه آزمونهاي قبل hCG با غلظت 2 ميكروگرم در ميلي ليتر در پليت الايزا تثبيت شد. سپس مايع آسيت در رقت هاي متوالي از 1:250 تا 1:106 به حفرات پليت اضافه و به مدت 90 دقيقه در دماي 37 درجه سانتي گراد انكوبه گرديد. همزمان از سرم موش ايمن نشده با رقت هاي متوالي از 1:50 تا 1:2000 به عنوان كنترل منفي استفاده شده است مشابه روش الايزا در قسمتهاي قبل ادامه آزمون انجام گرفت. نتايج - ايمونيزاسيون حيوانات: تيتراسيون سرم موش هاي ايمن شده با hCG طبيعي نشان داد كه تمام حيوانات پس از دريافت سومين دوز آنتي ژن، آنتي بادي با تيتر مناسب توليد كرده اند. منحني تيتراسيون سرم يكي از موش ها در مقايسه با موش ايمن نشده در شكل (1) نشان داده شده است. شكل (1): منحني تيتراسيون سرم موش ايمن شده با هورمون hCG و مقايسه آن با موش ايمن نشده - توليد و انتخاب هيبريدوماي مولد آنتي بادي ضد hCG پس از غربالگري اوليه، از بين هيبريدهاي در حال رشد يكي از آنها كه با hCG و اكنش مثبت قوي نشان داده و با پروتئين هاي ادراري UP)) واكنش نداشت انتخاب و پس از كلون و ساب كلون كردن ويژگي آن مورد بررسي بيشتر قرار گرفت. سوپ كلون مورد نظر با يك سري كامل از آنتي ژن هاي خالص وهمچنين اشكال نوتركيب هورمونهاي گليكوپروتئيني با آزمون الايزا و ايمونوبلاتينگ مورد بررسي قرارگرفت و نتايج حاصل در جدول (1) آمده است. - بررسي ويژگي آنتي بادي منوكلونال ضد hCG با آزمون الايزا نتايج الايزا نشان داد كه آنتي بادي منوكلونال بدست آمده با hCG تخليص شده از منبع ادرار و hCG نوتركيب بيشترين واكنش را دارد و با ساير هورمونهاي گليكوپروتئيني به استثناء hLH واكنش نمي دهد (جدول 1). پاسخ اين آنتي بادي منوكلونال با هورمون FSH و شكل نوتركيب TSH تقريباً صفر است. از طرفي آنتي بادي منوكلونال بدست آمده با زير واحدهاي آلفا و بتاي نوتركيب هورمون hCG به تنهايي پاسخ نمي دهد. - تعيين ايزوتيپ آنتي بادي منوكلونال: آزمون الايزا مربوط به تعيين ايزوتيپ آنتي بادي توليد شده نشان داد كه اين آنتي بادي داراي زير كلاس IgG1 مي باشد (جدول 2). - بررسي اثرمهاري hCG-CTP بر واكنش هورمون با آنتي بادي منوكلونال نتايج مربوط به بررسي اثر مهاري پپتيد hCG-CTP بر اتصال hCG به آنتي بادي منوكلونال توليد شده نشان داد كه انكوباسيون اين قطعه پپتيدي در غلظت هاي متفاوت با كونژوگه پراكسيداز آنتي بادي منوكلونال تاثير مهاري برواكنش هورمون hCG با آنتي بادي منوكلونال ندارد (جدول 3). مطالعه ويژگي آنتي بادي منوكلونال ضد hCG با روش ايمونوبلاتينگ: آنتي ژنهاي اصلي بكار رفته در آزمون الايزا، در ايمونوبلاتينگ نيز مورد استفاده قرارگرفتند. نتايج ايمونوبلاتينگ نشان ميدهد كه آنتي بادي منوكلونال بدست آمده در گروه اول آنتي ژن ها كه شامل هورمونهاي احياء نشده است، فقط با شكل دايمر hCG و hLH طبيعي و hCG نوتركيب واكنش مي دهد. اين آنتي بادي منوكلونال هيچگونه واكنشي با فرم احياء شده هورمونها نشان نداده است (شكل 2). شكل 2- الگوي ايمونوبلاتينگ آنتي بادي منوكلونال ضد hCG با اشكال احياء نشده (رديف هاي 1 الي 6 ) و احياء شده( رديف هاي 7 الي 11) هورمونهاي گليكوپروتئيني كه به ترتيب شامل : 1- UP (پروتئين هاي ادرار)،2- hCG تخليص شده از ادرار، 3- hCG نوتركيب، 4- hLH طبيعي، 5- FSH طبيعي، 6- TSH نوتركيب، 7- hCG تخليص شده از ادرار،8- hCG نوتركيب،9- hLH طبيعي،10- FSH طبيعي، 11- TSH نوتركيب - تشخيص وجود آنتي بادي منوكلونال در مايع آسيت و تتراسيون آن: با تزريق 6 ميليون سلول به 2 موش Balb/C حدود 3 ميلي ليتر مايع آسيت بدست آمد. الگوي الكتروفورز استات سلولز مايع آسيت وجود باند قوي مربوط به آنتي بادي منوكلونال را در ناحيه گاما نشان ميدهد (شكل 3). تيتراسيون مايع آسيت باآزمون الايزا نشان داد كه مايع آسيت تا رقت 106 :1 قادر است جذب نوري نسبتاً خوبي ناشي از اتصال آنتي بادي با آنتي ژن داشته باشد كه بيانگر غلظت و آفينيتي بالاي آنتي بادي در مايع آسيت است. الگوي الكتروفورز استات سلولز آسيت در ناحيه ايمونوگلوبولين ها نيز يك باند قوي را نشان ميدهد (شكل 4) كه نتايج تيتراسيون مايع آسيت را تائيد مي كند. شكل 3- الگوي الكتروفورز استات سلولز پروتئين هاي مايع آسيت حاوي آنتي بادي منوكلونال ضد hCG شكل 4- منحني تيتراسيون مايع آسيت موش بحث چنانچه پروتئين بيگانه اي در معرض سيستم ايمني قرار گيرد، همة اجزاء و اپي اتوپهاي آن مي توانند مورد شناسايي قرار گرفته و عليه آنها آنتي بادي توليد شود. بنابراين تمركز توليد آنتي بادي عليه بعضي از شاخصهاي آنتي‏ژنيك بر روي يك مولكول پروتئين كه اصطلاحاً آنها را اپي‏توپهاي غالب مي‏نامند، مطلق نبوده و بستگي به ساختار پروتئين و زمينه‏هاي ژنتيكي حيوان پاسخ دهنده دارد (12). اين اصل كلي در مورد هورمونهاي گليكوپروتئيني نيز مصداق دارد و آنتي‏باديهاي مونوكلونال مختلفي عليه اين هورمونها توليد و از آنها جهت مطالعه جايگاههاي آنتي‏ژني و تهيه نقشه جغرافيايي اپي‏توپهاي اين هورمونها استفاده شده است (13،9،6). اين مطالعات نشانداده است كه سه نوع اپي‏توپ اصلي در تمام هورمونهاي گليكوپروتئيني انسان قابل شناسايي است. گروهي از اپي‏توپها فقط در زير واحد آلفاي اين هورمونها قرار دارد و از آنجائيكه زير واحد آلفا در تمام اين هورمونها مشترك است، آنتي‏باديهاي مونوكلونال توليد شده عليه اين اپي‏توپها با ساير هورمونهاي اين خانواده واكنش متقاطع دارند. گروه دوم، اپي‏توپهايي هستند كه منحصراً در زير واحدهاي بتاي اين هورمونها قرار دارند و لذا آنتي‏باديهاي توليد شده عليه اين اپي‏توپها غالباً اختصاصي بوده و با ساير هورمونهاي اين خانواده واكنش متقاطع ندارند. گروه سوم اپي‏توپهايي هستند كه قسمتي از آنها در زير واحد آلفا و قسمتي در زيرواحد بتاي اين هورمونها قرار دارد و يا اينكه كلاً بروي يك زير واحد قرار داردولي بروز آنها نياز به شكل فضايي طبيعي آن زير واحد و يا اتصال دو زير واحد آلفا و بتا دارد و به همين دليل به اپي‏توپهاي فضايي معروف هستند (13، 8-6). كليه اپي‏توپهاي فوق‏الذكر بروي هورمون hCG نيز مطالعه و شناسايي شده است. اخيراً در مطالعاتي كه توسط Nagy و همكارانش (13) انجام گرفته چندين آنتي‏بادي مونوكلونال عليه hCG و زيرواحدهاي آن توليد شده است. اين آنتي‏باديها بر اساس نوع اپي‏توپ مورد شناسايي به گروه هاي متفاوتي تقسيم‏بندي شده‏اند كه شامل آنتي‏باديهاي مونوكلونال عليه زيرواحد آلفا، زيرواحد بتا، و شكل دايمر و يا آنتي‏باديهاي كه بطور مشترك فرم دايمر و آلفا و يا فرم دايمر و بتا را شناسايي مي‏كنند. اين دانشمندان با استفاده از روش ايمونوبلاتينگ نشان دادند كه در اثر احياء hCG با ماده 2-مركاپتواتانل (2ME) باندهاي دي‏سولفيدي در هر دو زيرواحد آلفا و بتا باز شده و آن گروه از آنتي‏باديهاي منوكلونالي كه اپي‏توپهاي فضايي را شناسايي مي‏كنند قدرت شناسايي خود را از دست داده و قادر به اتصال به هورمون احياء شده نيستند. اين يافته‏ها قبلاً توسط دانشمندان ديگر نيز گزارش شده است (18،17). از طرفي اپي‏توپهاي خطي و فضايي متفاوت و گاهي منحصر بفردي توسط محققين مختلف شناسايي و گزارش شده است كه در بازشناسي ساختار هورمون و تعيين نقشة جغرافيايي اپي‏توپهاي آن بسيار مفيد و مؤثر بوده است (9-6). در اين پژوهش ويژگي يكي از آنتي باديهاي منوكلونال انتخابي كه برعليه هورمون hCG توليد شده و اپي توپ فضايي جالب توجهي را شناسايي مي كند مورد مطالعه قرارگرفته است. نتايج مربوط به الايزا نشان داد كه اين آنتي بادي منوكلونال با فرم دايمر hCG طبيعي و نوتركيب واكنش قوي دارد ولي با هيچكدام از زير واحدهاي الفا و بتاي هورمون به تنهايي واكنش نمي دهد. بنابراين اولين نتيجه منطقي در مورد اين آنتي بادي اين است كه يك اپي توپ وابسته به ساختمان سوم و چهارم پروتئين را شناسايي مي كند. از طرفي نتايج الايزا نشانداده است كه اين آنتي بادي با FSH طبيعي و TSH نوتركيب هيچگونه واكنش متقاطعي ندارد، لذا دومين نتيجه منطقي اين است كه زير واحد آلفا به تنهايي در شكل فضايي خود براي شناسايي اين آنتي بادي منوكلونال كافي نيست و حضور هر دو زير واحد آلفا وبتا (شكل فضايي دايمر) ضروري است. از طرفي اين آنتي بادي منوكلونال با هورمون hLH واكنش متقاطع دارد (جدول 1). اين مسئله نشان ميدهد كه چون تنها اختلاف hLH و hCG وجود قطعه پپتيدي واقع در انتهاي كربوكسيل زير واحد hCG است، لذا اپي توپ مربوط به اين آنتي بادي منوكلونال احتمالاً در ناحيه hCG-CTP قرار ندارد، چرا كه اگر اپي توپ مورد شناسايي در اين ناحيه قرار مي گرفت آنتي بادي منوكلونال بدست آمده با hLH واكنش متقاطع نداشت (16-14). نتايج بدست آمده از الايزاي مربوط به اثر مهاري قطعه پپتيدي انتهاي كربوكسيل (hCG-CTP) بر اتصال آنتي بادي منوكلونال به hCG در جدول (3). اين استنتاج را تائيد كرده است. نتايج اين الايزا نشان ميدهد كه حتي غلظت هاي بالاي پپتيد hCG-CTP تا 10 ميكروگرم در ميلي ليتر تاثيري در مهار واكنش آنتي ژن – آنتي بادي ندارد. مطالعات قبلي نشانداده است كه اپي توپ هاي موجود در ناحيه hCG-CTP فقط از نوع خطي و پيوسته بوده و ساير اپي توپ هاي hCG عموماً از نوع غير پيوسته هستند (8-6). عدم واكنش اين آنتي بادي با قطعه پپتيدي حاوي اسيدهاي آمينه 119-109 كه مربوط به قسمت انتهايي كربوكسيل هورمون hCG است نيز اين نظر را تائيد مي كند (جدول 1). اپي توپهاي مشتركي كه بروي هر دو مولكول hCG و hLH بروز مي يابند نيز قبلاً توسط دانشمندان ديگر شناسائي گزارش شده است (18). نتايج مربوط به ايمونوبلاتينگ، نتايج آزمون الايزا را تائيد و برصحت نتيجه گيريهاي فوق تاكيد ميكند. نتايج ايمونوبلاتينگ نشان ميدهد كه آنتي بادي منوكلونال بدست آمده با آنتي ژن hCG و hLH احياء نشده پاسخ داده و باندهاي قوي در ايمونوبلاتينگ ايجاد ميكند اما هورمونهاي فوق هنگاميكه با استفاده از تركيب 2ME احياء ميشوند وباندهاي دي سولفيدي درون ملكولي از هم گسستهميشود و شكل فضايي هورمون از بين مي رود ديگر با آنتي بادي منوكلونالتوليد شده واكنشي نمي دهند. عدم وجود واكنش با هورمونهاي FSH طبيعي و TSH نوتركيب و پروتئين هاي ادراري (UP) نيز در ايمونوبلاتينگ تائيد شده است. استفاده از پروتئين هاي ادراري بدين منظور انجام شده است تا احتمال واكنش غير اختصاصي آنتي بادي باپروتئين هاي ناخالص درهورمون هاي hCG و FSH كه از ادرار تخليص شده اند منتفي گردد. شباهت زياد بين ساختمان اول هورمونهاي hCG و hLH منجر به شباهت بين اشكال طبيعي اين دو هورمون نيز شده است بطوريكه براي هر دو هورمون فوق يك نوع گيرنده وجود دارد. بنابراين اثرات بيولوژيكي اين دو هورمون بسيار بهم شبيه بوده به همين دليل در درمان اختلالات ناباروري مربوط به كمبود LHو يا در القاء تخمك گذاري(LH surge) از داروي hCG استفاده مي شود. با توجه به چنين شباهت ساختماني از آنتي بادي منوكلونال توليد شده مي توان در پيشگيري از اتصال هورمون به گيرنده و در نتيجه خنثي نمودن اثرات بيولوژيكي مربوط به اين دو هورمون در تحقيقات پيش گيري از اثرات هورمون hCG در بارداري و موارد مشابه استفاده كرد. از طرفي به دليل وجود مقادير بسيار جزئي hCG در سرم افراد طبيعي و خانم هاي غير باردار مي توان اين آنتي بادي را در سنجش هورمون hLH نيز بكار گرفت. از آنتي بادي هاي منوكلونال عليه hCG در تشخيص هاي باليني متعددي نظير تشخيص بارداري و اختلالات مربوط به آن ، بيماريهاي تروفوبلاستيك و نيز تشخيص انواع سرطانها و تومورهاي غير تروفوبلاستيك مي توان استفاده كرد (19). از طرفي در تشخيص به موقع بارداريهاي نابجا و تشخيص قبل از تولد سندرم دان و بيماريهاي متعدد ديگر اين آنتي باديها قابل استفاده هستند (21و20). در خاتمه نتايج بدست آمده در مورد آنتي بادي منوكلونال توليد شده در اين پژوهش بشرح زير جمع بندي مي شود: 1- اين آنتي بادي منوكلونال اختصاصاً هورمون hCG راشناسايي نموده و به استثناء هورمون hLH با ساير هورمونهاي گليكو پروتئيني وپروتئين هاي ادراري واكنش متقاطع ندارد. 2- اين آنتي بادي منحصراً شكل دايمر هورمون hCG و hLH را شناسايي كرده و با زير واحدهاي هورمون به تنهايي واكنشي ندارد. 3- اين آنتي بادي يك اپي توپ غير پيوسته و فضايي وابسته به زير واحد بتا را در ملكول hCG شناسايي نموده كه بروز آن به حضور هر دو زير واحد آلفا و بتاي هورمون بطور همزمان نياز دارد. تشكر و قدرداني از راهنمائيها و ارشادات سركار خانم دكتر فاطمه كرمي تهراني و پيشنهادات و انتقادات سازنده جناب آقاي دكتر جواد رسايي ازگروه بيوشيمي دانشگاه تربيت مدرس سپاسگزاري مي نمايد. همچنين از استاد ارجمند جناب آقاي دكتر محمود جدي تهراني از پژوهشكده ابن سينا و سركار خانم قرگزلو، جناب آقاي خشنودي و سركار خانم روحي از بخش ايمونولوژي دانشكده بهداشت دانشگاه علوم پزشكي تهران بدليل ارائه كمك هاي علمي و عملي ارزنده صميمانه تشكر و قدرداني مي نمايد. بخش عمده اي از هزينه هاي مالي اين مطالعه توسط معاونت پژوهشي وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي تأمين شده است. كه بدينوسيله از آن معاونت محترم سپاسگزاري مي نمايد. از زحمات خانم سليمي و خانم اسكندري از واحد نشريات پژوهشكده ابن سينا نيز تشكر و قدرداني مي شود. 2 <p>Human chorionic gonadotropin hormone (hCG) belongs to glycoprotein hormones family. Other members of this family include follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and thyroid stimulating hormone (TSH). All these hormones consist of a common alfa and a distinct beta subunit. There is a strong similarity between the members of these hormones. Therefore, detection and quantitative measurment of these hormones require production of monoclonal antibodies specific for non-overlapping epitopes on the beta chain or a conformational epitope specific for each hormone. In this study a murine monoclonal antibody against the hCG dimer molecule was produced by hybridoma technology. The specificity of the antibody was assessed by ELISA and Immunoblotting using a panel of highly purified and recombinant forms of glycoprotein hormones including: native hCG and hLH, recombinant hCG, hCG, hCG, hCG carboxyl terminal peptide covering amino acid residues 109-145 (hCG-CTP), recombinant TSH and native FSH, as well as urine proteins (UP). It was found that the monoclonal antibody reacted with, dimer recombinant and urine purified hCG and hLH, but not with the reduced form of the hormone, nor with recombinant hCG, hCG, TSH, native FSH and UP. Using hCG-CTP fragment with different concentrations to monitor inhibition of hormone – monoclonal antibody interactions, no interference was observed. This implies that the epitope recognized by the monoclonal antibody is different from that presented by hCG–CTP. These results suggest that the monoclonal antibody recognizes a conformational epitope located at the dimer form of hCG molecule and closely associated with the beta subunit of the hormone.</p> 44 55 Ali Akbar AA Sabooryaraghi علی اکبر صبور یراقی Department of Biochemistry, Medical Faculty, Tarbiat Modarres University Department of Biochemistry, Medical Faculty, Tarbiat Modarres University Iran Roya R Ghods رویا قدس Department of Immunology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Department of Immunology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Iran Fazel F Shokri فاضل شکری Department of Immunology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Department of Immunology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Iran Glycoprotein hormonesHCGMonoclonal antibodyEpitope mapping 41.pdf Cole L.A. hCG, its free subunits and its metabolites, roles in pregnancy and trophoblastic disease. J Reprod Med. 1998, 43: 3-10.##Pierce JG, parsons TF. Glycoprotein hormones: structure and function. Ann Rev Biochem. 1981, 50:465-95.##Lapthorn A J, Harris DC, et al. Crystal structure of human chorionic gonadotropin. Nature. 1994, 369:455-61.##Sturgeon CM, McAllister, EJ. Analysis of hCG: Clinical applications and assay requirement. Ann Clin Biochem.1998, 35:460-91.##Cole LA. Immunoassay of human chorionic gonadotropin, its free subunits, and metabolites, Clin Chem. 1997, 43:2233-43.##Berger P, Bidart, J M, et al. Immunochemical mapping of gonadotropins, Mol Cell Endocrinol. 1996, 125:33-43.##Berger P, Klieber R, et al. Monoclonal antibodies against the free subunits of human chorionic gonadotropin. J Endocrinol. 1990, 125: 301-9.##Venketesh N, Krishnaswamy, S, et al. Epitope analysis and molecular modeling reveal the topography of the C-terminal peptide of the ?-subunit of human chorionic gonadotropin. Eur J Biochem. 1999, 265:1061-6.##Bidart JM. Functional mapping of proteins with monoclonal antibodies. In: Gosling, J. P. and Reen, D.J(eds). Immunotechnology, portland press, U.K. 1993, 77-89.##Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antiboby of predefined specificity. Nature. 1975, 256:495-7.##Gharagozloo S, Sharifian RA, et al. Analysis of the expressed immunoglobulin variable region heavy chain gene products in paraproteins from Iranian patients with multiple myeloma, Pathol Oncol Res. 2000, 6:185-90.##Benjamin DC, Berzofsky JA, et al. The antigenic structure of proteins: A Reappraisal. Ann Rev Immunol. 1984, 2:67-101.##Nagy AM, Vanbellinghen AM, et al. Epitope mapping on intact, heated and reduced molecular variants of human chorioric gonadotrophin. Mol Cell Endocrinol. 1996, 122:51-7.##Caraux J, Chichehian B, et al. Non cross-reactive monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin generated after immunization with a synthetic peptide. J Immonol. 1985, 134:835-40.##Bidart JM, Bellet DH, et al. The immune response to a synthetic peptide analogous to the 109-145 ?hCG carboxyl terminus is directed against two major and two minor regions. Mol Immunol. 1987, 24:339-45.##Bellet D, Bidart JM, et al. A monoclonal antibody against a synthetic peptide is specific for the free native human chorionic gonadotropin ?- subunit. Endocrino. 1984, 115:330-6.##Bidart JM, Tralen F, et al. Immunochemical mapping of a specific domain on human choriogonadotropin using anti-protein and anti-peptide monoclonal antibodies. J Biol Chem. 1987, 262:15483-9.##Ehrich PH, Mostapha Z, et al. Characterization and relative orientation of epitopes for monoclonal antibodies and antisera specific for human chorionic gonadotropin. Am J Reprod Immunol Microbiol. 1985, 8:48-54.##Alfthan H, Stenman U. Pathophysiological importance of various molecular forms of human choriogonadotropin. Mol Cell Endocrinol. 1996, 125:107-120.##Ankum WM. Diagnosing suspected ectopic pregrancy.Biomed J. 2000, 321:1235-6.##Kornman LH, Morssink LP, et al. Maternal urinary ?- core hCG in chromosomally abnormal pregnanies in the first trimester. Prenat Diagnos. 1997, 17:135-9.##

Serum and follicular fluid IL-6 and sex steroid hormone levels and their correlation of undergoing IVF-ET with endometriosis and pregnancy rate in women 2 1 مقدمه فعاليت داخلي تخمدان توسط عوامل مختلف هورموني و فاكتورهاي موضعي تنظيم مي گردد (1). سيتوكاين ها از مهممترين عوامل تنظيم كننده فعاليت تخمدان ها بوده كه بصورت پاراكرين و اتوكرين تنظيم كننده فرآينده هاي داخلي تخمدان مي باشند. اين فاكتورها توسط لكوسيت هاي داخل تخمدان و يا سلولهاي غير سيستم ايمني همچون سلولهاي گرانولوزا و تك داخلي و سلولهاي ديگر بطور مداوم يا در اثر تحريكات خاص توليد و ترشح مي شوند. نيمه عمر اين فاكتورها كوتاه بوده و غلظت آنها سريعاً تغيير مي كند. فاكتورهاي فوق بر اساس نوع سلول هدف و واكنش هاي موضعي با ديگر سيتوكاين ها، اثرات بسيار اختصاصي دارند (2و1). مطالعات فراوان نشان داده است كه سيتوكاين ها بعنوان يك تنظيم كننده مهم براي توليد استروئيدها، فوليكوژنز و توليد گامت ها محسوب مي شوند. همچنين استروئيدها و گنادوتروپين ها نيز به نوبه خود قادر به تنظيم توليد و ترشح سيتوكاين ها مي باشند. استروژن سبب مهار سيتوكاين هاي IL-1 و INF شده و پروژسترون و آندروژنها نيز سبب مهار IL-1 بوسيله سلولهاي تك هسته اي مي شوند (4و3). گنادوترويين ها همچنين مي توانند سبب افزايش بعضي از سيتوكاين ها شوند. گزارش شده است كه در سندرم تحريك بيش از حد تخمدان ميزان IL-6 در مايع فوليكولي افزايش مي يابد (5). با توجه به واكنش هاي بين سيستم اندوكرين و سيتوكاين ها در تخمدان و نيز بروز عوارض پاتولوژيك در پي تغيير در غلظت سايتوكينها، بررسي سيتوكاين ها و هورمون هاي موجود در مايع فوليكولي و نقش آنها در نتايح IVF و بيماريهاي مختلف ( از جمله اندومتريوز به عنوان يكي از علل ناباروري) از دهه 1980 مورد مطالعه قرار گرفته است. IL-6 بعنوان يكي از عوامل تنظيم كننده فرآينده هاي داخلي تخمدان اخيراً مورد توجه پژوهشگران قرارگرفته است. IL-6 فاكتور مترشحه از لنفوسيت هاي T بوده كه بطور اختصاصي سبب تمايز لنفوسيت هاي B به پلاسما سل (توليد كننده آنتي بادي) مي شود (6). IL-6 يك گليكوپروتئين (kDa 26) بوده كه توسط سلولهاي خون ساز و غير خون ساز توليد و ترشح مي شود (7و8). مطالعات ايمنوهيستوشيمي بر روي تخمدان انسان نشان داده است كه IL-6 از جسم زرد و سلولهاي تك داخلي ترشح مي شود و آنرا در مايع فوليكولي بيماران تحت درمان IVF مشاهده كرده اند (9). IL-6 سبب فوليكوژنزو استروئيدوژنز در سلولهاي گرانولوزا مي شود (2). IL-6 و با افزايش توليد و ترشح VEGF سبب كمك به رگ سازي جديد در تخمدان انسان مي شود (10). بنابراين افزايش بيش از حد آن مي تواند سبب عارضه پاتولوژيك سندرم تحريك بيش از حد تخمدان شود (11). همچنين گزارش شده است كه غلظت IL-6 در مايع فوليكولي خانمهاي نابارور مبتلا به اندومتريوز افزايش مي يابد (12). لذا اين سيتوكاين مي تواند داراي نقشي در پاتوژنز ناباروري ناشي از اندومتريوز محسوب شود. لذا با توجه به نقش IL-6 در تنظيم فعاليت داخل تخمدانها و افزايش آن در بيماري اندومتريوز، در اين مطالعه به بررسي ميزان سرمي و مايع فوليكولي IL-6 و هورمونهاي استروژن ، پروژسترون وFSH در بيماران تحت درمان با IVF در زمان جمع آوري تخمكها پرداخته و ارتباط اين فاكتورها با نتايج حاصله از IVF را مورد بررسي قرار دهيم. بعلاوه، رابطه ميزان سرمي و فوليكولي اين فاكتورها با بيماري اندومتريوز نيز بررسي گرديده است. مواد و روشها بيماران: تعداد 80 بيمار انتخابي براي درمان IVF كه در فاصله چهار ماه به بخش درمان ناباروري بيمارستان زنان دانشگاه كيل مراجعه كردند جهت اين بررسي انتخاب شدند. دامنه يا محدوده سن آنها 40-27 سال و ميانگين (MSD) 3/41/34 سال بود. لاپاراسكوپي در تمام بيماران جهت تشخيص اندومتريوز انجام شد. و بر اساس Revised American Fertility Society Score (13) درجه بندي انجام شد. بيماران بدون اندومتريوز و مبتلا به اندومتريوز minimal تا mild در اين مطالعه مورد بررسي قرار گرفتند. تمام بيماران داراي سيكل قاعدگي منظم بوده و حداقل دو سال سابقه ناباروري داشتند. و در طي يك سال گذشته هيچ گونه درمان داروئي يا جراحي براي درمان اندومتريوز دريافت نكرده بودند. پروتكل تحريك تخمك گذاري براي IVF: درمان بيماران با يك تزريق منفرد عضلاني آمپول دكاپپتيل (آگونيست GnRH) در روز 21 سيكل و قبل از تحريك شروع و پس از اولين سونوگرافي در روز دوم سيكل بعدي تا بالغ شدن فوليكولها (رسيدن قطر فوليكولها به 16 ميلي متر يا بيشتر) تحريك تخمك گذاري با تزريقHMG يا گونال (Pure FSH)F ادامه يافت. از روز ششم سيكل با اندازه گيري روزانه استراديول (E2) سرم و قطر فوليكولها توسط سونوگرافي ترانس واژينال ميزان رشد فوليكولها بررسي ميگرديد. زماني كه قطر دو فوليكول حداقل به 16 ميلي متر رسيد،HCG بصورت داخل عضلاني تزريق و بعد از 36-34 ساعت محتويات فوليكولها تخليه و تخمك ها جدا گرديد. جمع آوري مايع فوليكولي و سرم: محتويات فوليكولهاي بيماران در مرحله تخليه فوليكولها در داخل لوله هاي استريل جمع آوري گرديد. تخمكها بعد از تشخيص برداشته و مايع فوليكولي به مدت 15 دقيقه در C4 و دور g×900 سانتريفوژ و مايع رويي تا زمان اندازه گيري هورمونها و IL-6 در دماي C70- نگهداري شد. به همين ترتيب قبل از گرفتن تخمك puncture)) حدود ml5 خون از بيماران اخذ و پس از جدا سازي سرم، نمونه ها در دماي C70- حفظ گرديدند. از مجموع 80 بيمار در 36 مورد انتقال جنين(ET) صورت گرفت. بيماران تحت ET بعد از دو هفته از نظر حاملگي ارزيابي گرديدند. اندازه گيري هورمونها و IL-6: هورمونهاي جنسي (FSH، استراديول و پروژسترون ) با استفاده از سيستم تمام اتوماتيك RIA، (Serono Diagnostics, Freibuyg, Germany) و IL-6 با روش ELISA با حساسيت بالا (Elisa: Cytoscreen US) (ultrasencysitive) مورد بررسي قرار گرفت. نتايج: سطح فوليكولي هورمونهاي جنسي ) FSH، استراديول و پروژسترون ) در بيماران تحت IVF-ET برحسب ميزان حاملگي در جدول شماره يك نشان داده شده است. طبق جدول فوق بيماران به سه گروه: 1- حامله 2- غير حامله بدون اندومتريوز 3- غير حامله مبتلا به اندومتريوز تقسيم شدند. آناليز آماري نتايج حاصله نشان داد كه اختلاف معني داري بين آنها وجود ندارد. چنانكه از نمودار شماره (1) بر مي آيد ميزان IL-6 در سرم و مايع فوليكولي در بيماران حامله و غير حامله بعد از ET يكسان بوده و اختلاف معني داري بين آنها وجود ندارد. (05/0P>) . سطح سرمي و مايع فوليكولي IL-6 در دو گروه بيماران مبتلاء به اندومتريوز و بدون اندومتريوز در نمودار شماره (2) نشان داده شده است. آناليز آماري تغيير معني داري بين ميزان IL-6 در مايع فوليكولي دو گروه نشان داد. با اين حال در سرم ميزان اين سيتوكاين در هر دو گروه تقريباً يكسان مي باشد. بر اساس نمودار شماره (3) سطح IL-6 در مايع فوليكولي بيماران غير حامله مبتلا به اندومتريوزي خيلي بيشتر از بيماران غير حامله بدون اندومتريوز و بيماران حامله بعد از ET مي باشد. در آناليز آماري فقط بين بيماران حامله و بيماران غير حامله مبتلا به اندومتريوز اختلاف معني داري بود (05/0P<). بحث تخمك گذاري فرآيندي تنظيم شده بوده كه پس از تخمك گذاري بدنبال پاره شدن فوليكول بوسيله سيتوكاينهاي التهابي (IL-8,IL-6) و واكنش هاي مهار التهابي (interleukin 1-receptor antagonist) با واكنش هاي التهابي همراه مي باشد (2و1). اين مطالعه نشان داد كه IL-6 در مايع فوليكولي و سرم تمام بيماران تحت درمان با داروهاي محرك تخمك گذاري يافت ميشود. با توجه به اينكه IL-6 يك سيتوكاين التهابي بوده و تخمك گذاري بدنبال پاره شدن فوليكول ها با فرآيند هاي التهابي همراه مي باشد. لذا وجود IL-6 درمايع فوليكولي مي تواند قابل توجيه باشد بعلاوه بالا بودن ميزان IL-8 در مايع فوليكولي (حدود 30 برابر پلاسما) كه داراي خاصيت شيموتاكتيك براي نوتروفيل ها مي باشد (15و14). مي تواند عامل ديگري براي حضور و توليد IL-6 درمايع فوليكولي باشد. در ضمن نبايد وجود ماكروفاژها كه حدود 5-15% سلولهاي تخمدان را تشكيل داده و قادر به توليد IL-6 مي باشد و يا ساير سلولهاي غير سيستم ايمني مانند سلولهاي گرانولوزا را ناديده گرفت (16). بنابراين با توجه به حضور IL-6 در مايع فوليكولي، اين سيتوكاين مي تواند در حوالي زمان تخمك گذاري واكنش هاي بين سلولي در فوليكولها دخالت نموده و نقش مهمي را در فرآيند تخمك گذاري بازي نمايد. اين مطالعه نشان داد كه IL-6 درسرم خانمهاي تحت درمان با داروهاي محرك تخمك گذاري نيز يافت مي شود مؤيد يافته هاي Hock و همكاران مي باشد (17). همچنين Hock وهمكاران نشان دادند غلظت IL-6 در سرم اين خانمها بيش از غلظت آن در سرم خانمهاي بدون درمان باداروهاي تخمك گذاري مي باشد اگر چه اين افزايش معني دار نبوده است اين مطالعه نشان داد كه ميزان IL-6 در تمام گروههاي مورد مطالعه در سرم كمتر از مايع فوليكولي مي باشد. با توجه به نيمه عمر حدود 3 دقيقه IL-6 درخون (16)، ارزش پيش آگهي اندازه گيري غلظت IL-6 درسرم نسبت به ميزان آن درمايع فوليكولي بطور مشخص متفاوت مي باشد. مطالعات فراواني وجود دارد كه بيان كننده ارتباط بين سيستم اندوكرين و سيتوكاين ها مي باشد. Buscher وهمكاران در سال 1999 نشان دادند كه ميزان IL-6 در مايع فوليكولي بيماران تحت درمان با داروهاي محرك تخمك گذاري بيش از بيماران بدون دريافت داروهاي محرك تخمك گذاري مي باشد و اين افزايش به نوع پروتكل هاي تحريكي نيز ارتباط دارد (9). بعلاوه Chen و همكاران در سال 2000 نشان دادند كه غلظت IL-6 در مايع فوليكولي بيماران مبتلا به سندرم تحريك بيش از حد تخمدان بسيار بيشتر مي باشد (18). ما در همراهي با نتايج مطالعات قبليWang & Norman در سال 1992 (19) و Buscher در سال 1999 (9) هيچ ارتباط معني داري بين غلظت IL-6 و غلظت استراديول و پروژسترون نيافتيم (9و19). مطالعات فراوان نشان داده اند كه سيتوكاين ها نه فقط تنظيم كننده فرآيندهاي فيزيولوژيك مي باشند بلكه مي توانند عامل واكنش هاي ايمنوپاتولوژيك نيز باشند. Motro در سال1990 گزارش نمود كه mRNA مربوط به IL-6 در طي رگ سازي جديد فوليكولي توليد مي شود و نقش بالقوه اي در تشديد نفوذ پذيري عروق در زمان تخمك گذاري بازي مي كند (20). Chen در سال 2000 نشان داد كه ميزان IL-6 درمايع فوليكولي بيماران سندرم تحريك بيش از حد تخمدان در زمان جمع آوري تخمكها افزايش پيدا مي كند (18). بنابراين با توجه به اينكه روشهاي مرسوم تشخيص OHSS (مانند غلظت سرمي استراديول در روز تزريق HCG و تعداد تخمكهاي بدست آمده) قادر به پيش بيني دقيق آن نمي باشند. غلظت IL-6 مايع فوليكولي در زمان جمع آوري تخمكها مي تواند بعنوان يك عامل پيش آگهي دهنده زود هنگام براي اين سندرم محسوب شود. مكانيسم ناباروري ناشي از اندومتريوز بدون چسبندگي واضح لگني بطور دقيق شناخته شده نيست. در اين رابطه مكانيسم هاي احتمالي زيادي از قبيل تغيير در فوليكوژنز، اختلال در تخمك گذاري، افزايش پرولاكتين سرم، اختلال فازلوتئال، اختلال انتقال گامت، فاگوسيتوزاسپرم، اختلال در لقاح، وجود مواد امبريو توكسيك عليه تكامل اوليه جنين، نقص لانه گزيني و عامل متعدد ديگري را مورد توجه قرار دارند (12). از آنجا كه مطالعه اخير نشان داد كه ميزانIL-6 در مايع فوليكولي افراد مبتلا به اندومتريوز بطور معني داري نسبت به افراد غير مبتلا بيشتر مي باشد و اين افزايش همراه با كاهش ميزان لانه گزيني جنين در اين بيماران مي باشد لذا اين تئوري مطرح مي شود كه اين سيتوكاين قادر است از طريق دو مكانيسم احتمالي، شامل اختلال در تكامل اوليه جنين واختلال در پذيرش اندومتر، سبب كاهش لانه گزيني شود. از آنجا كه Simon در سال 1994 و Sung در سال 1997 نشان دادند زنان با اندومتريوز كه تحت درمان با اهداء تخمك قرار گرفتند شانس لانه گزيني مشابه با بيماران بدون اندومتريوز دارا مي باشند (21و22). لذا اختلال در پذيرش اندومتر و محيط داخلي اندومتر در بيماران با اندومتريوز، نمي تواند سبب اين كاهش لانه گزيني شود. در صورتيكه مطالعات ديگر نشان داده است مراحل اوليه تكامل جنين در اندومتريوز بيشتر دچار توقف شده و بيان كننده اين موضوع است كه اختلال در كيفيت جنين مي تواند مسئول كاهش ميزان لانه گزيني جنين محسوب شود (23). تشكر و قدرداني نويسندگان مقاله از همكاري پرسنل درماني، پرستاري، و آزمايشگاه مركز نازايي دانشگاه علوم پزشكي تبريز و مركز درمان ناباروري دانشگاه كيل آلمان تشكر و قدرداني مي نمايد. 2 <p>Cytokines Not only do regulate physiological processes, but also play important roles in immunopathological reactions. The aim of this study was to evaluate the correlation between IL-6 and sex hormone levels with endometriosis and pregnancy rate at the time of oocyte retrieval. In infertile women undergoing IVF-ET Eighty patients received ovulation induction drugs and underwent IVF-ET. IL-6 levels in serum and follicular fluid (FF) were measured by ELISA and FSH, estradiol and progesterone by RIA. In 36 out of 80 patients embryos were transferred and pregnancy rate were evaluated after two weeks. The result showed no significant correlation between serum and FF levels of estradiol, progesterone and FSH with pregnancy rate in IVF patients. Similar levels of IL-6 in serum and FF of pregnant and non pregnant patients after embryo transfer were observed (P>0.05). However there was a significant correlation between FF levels of IL-6 in pregnant and non pregnant endometriosis patients (P<0.05). These results indicate that increase of FF levels of IL-6 may be accompanied by pregnancy rate reduction in endometriosis patients.</p> 55 63 Mohammad M Nouri محمد نوری Biochemistry Department, Tabriz Univarsity of Medical Sciences Biochemistry Department, Tabriz Univarsity of Medical Sciences Iran Maerefat M Ghaffari معرفت غفاری نوین Biochemistry Department, Tabriz Univarsity of Medical Sciences Biochemistry Department, Tabriz Univarsity of Medical Sciences Iran Ali A Salmasi علی سلماسی Infertility Center, Kiel University Infertility Center, Kiel University Germany Alieh A Ghasemzadeh عالیه قاسم زاده Department of Obstet . and Gynecol . of Tabriz University of Medical Science Department of Obstet . and Gynecol . of Tabriz University of Medical Science Iran IL-6Follicular fluidSex hormoneEndometriosisPregnancy rateIVF-ET 42.pdf Mandrup-Poulsen T, Nerup J, Reimers JI, Pociot F, Andersen HU, Karlsen A, Bjerre U, Bergholdt R. Cytokines and the endocrine system. I. The immunoendocrine network. Eur J Endocrinol. 1995, 133(6):660-71.##Adashi EY. The potential relevance of cytokines to ovarian physiology: the emerging role of resident ovarian cells of the white blood cell series. Endocrinol Rev. 1990, 11(3):454-64.##Vinatier D, Dufour P, Tordjeman-Rizzi N, Prolongeau JF, Depret-Moser S, Monnier JC. Immunological aspects of ovarian function: role of the cytokines. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1995, 63(2):155-68.Review.##Hu SK, Mitcho YL, Rath NC. Effect of estradiol on interleukin 1 synthesis by macrophages. Int J Immunopharmacol. 1988, 10(3):247-52.##Polan ML, Loukides JA, Honig J. Interleukin-1 in human ovarian cells and in peripheral blood monocytes increases during the luteal phase: evidence for a midcycle surge in the human.Am J Obstet Gynecol.1994, 170(4):1006-7.##Hirano T, Taga T, Nakano N, Yasukawa K, Kashiwamura S, Shimizu K, Nakajima K, Pyun KH, Kishimoto T. Purification to homogeneity and characterization of human B-cell differentiation factor (BCDF or BSFp-2). Proc Natl Acad Sci. 1985, 82(16):5490-4.##Akira S, Hirano T, Taga T, Kishimoto T. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL 1 and TNF). FASEB J. 1990, 4(11):2860-7.##Van Snick J. Interleukin-6: an overview. Annu Rev Immunol. 1990, 8:253-78.##Buscher U, Chen FC, Kentenich H, Schmiady H. Cytokines in the follicular fluid of stimulated and non-stimulated human ovaries; is ovulation a suppressed inflammatory reaction? Hum Reprod. 1999, 14(1):162-6.##Cohen T, Nahari D, Cerem LW, Neufeld G, Levi BZ. Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 1996, 271(2):736-41.##Loret de Mola JR, Flores JP, Baumgardner GP, Goldfarb JM, Gindlesperger V, Friedlander MA.Elevated interleukin-6 levels in the ovarian hyperstimulation syndrome: ovarian immunohistochemical localization of interleukin-6 signal. Obstet Gynecol. 1996, 87(4):581-7.##Garrido N, Navarro J, Remohi J, Simon C, Pellicer A. Follicular hormonal environment and embryo quality in women with endometriosis. Hum Reprod Update. 2000, 6(1):67-74.##The American Fertility Society. Revised American Fertility Society classification of endometriosis. Fertil Steril. 1985, 43:351-2.##Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, Elner SG, Strieter RM. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science. 1992, 11:258(5089):1798-801.##Arici A, Oral E, Bukulmez O, Buradagunta S, Engin O, Olive DL. Interleukin-8 expression and modulation in human preovulatory follicles and ovarian cells. Endocrinology. 1996, 137(9):3762-9.##Keck C, Rajabi Z, Pfeifer K, Bettendorf H, Brandstetter T, Breckwoldt M. Expression of interleukin-6 and interleukin-6 receptors in human granulosa lutein cells. Mol Hum Reprod. 1998, 4(11):1071-6.##Hock DL, Huhn RD, Kemmann E. Leukocytosis in response to exogenous gonadotrophin stimulation.Hum Reprod. 1997, 12(10):2143-6.##Chen CD, Chen HF, Lu HF, Chen SU, Ho HN, Yang YS. Value of serum and follicular fluid cytokine profile in the prediction of moderate to severe ovarian hyperstimulation syndrome. Hum Reprod. 2000, 15(5):1037-42.##Wang LJ, Norman RJ. Concentrations of immunoreactive interleukin-1 and interleukin-2 in human preovulatory follicular fluid. Hum Reprod. 1992, 7(2):147-50.##Motro B, Itin A, Sachs L, Keshet E. Pattern of interleukin 6 gene expression in vivo suggests a role for this cytokine in angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990, 87(8):3092-6.##Simon C, Gutierrez A, Vidal A, de los Santos MJ, Tarin JJ, Remohi J, Pellicer A. Outcome of patients with endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation. Hum Reprod. 1994, 9(4):725-9.##Sung L, Mukherjee T, Takeshige T, Bustillo M, Copperman AB. Endometriosis is not detrimental to embryo implantation in oocyte recipients. J Assist Reprod Genet. 1997, 14 (3): 152-6.##Pellicer A, Oliveira N, Ruiz A, Remohi J, Simon C. Exploring the mechanism(s) of endometriosis-related infertility: an analysis of embryo development and implantation in assisted reproduction.Hum Reprod. 1995, 10 Suppl 2:91-7.##