2011 12 2 47 126

Cloning and Interfering Factors 2 1 زمینه و هدف پس از تولد خارق‌العاده دو گوسفند به نام‌های Moran و Megan تو به دنبال تحقیقات Campbell و Wilmute در سال 1995، Wilmute و همکاران در جولای 1996 موفق به تولد دالی، اولین گوسفند شبیه‌سازی شده با استفاده از سلول سوماتیک کاملاً بالغ و تمایز یافته، شدند که موجب تحسین و تعجب سایر محققین گردید (1،2). طی 15 سال اخیر تغییرات شگرف و پیشرفت‌های قابل توجهی در روند شبیه‌سازی تحقق یافته و محققین به منبع وسیعی از سلول‌های دهنده هسته دست یافته و شبیه سازی در بسیاری از گونه‌ها نظیر موش، خرگوش، خوک، اسب، قاطر، موش صحرایی، میمون، گربه، سگ، گاو، گوسفند، بز و ... با موفقیت به انجام رسیده است (3). علیرغم پتانسیل بالا و گستره وسیع کاربرد شبیه سازی در حوزه‌های مختلف، معایب عدیده پیرامون این فناوری و پیآمد‌های منفی حاصل از آن، کاربرد آن را از بعد کارایی به چالش ‌کشانده است. در خصوص کاربرد، مزایا و معایب شبیه سازی می‌توان به طور اجمال به موارد ذیل اشاره نمود. مزایای شبیه‌سازی 1- حفظ گونه‌های جانوری در معرض خطر انقراض: از جمله گاو وحشی هندی (4)، گاو نژاد Han Woo (5)، گاومیش (6)، گاو کوهان‌دار (7) قوچ کوهی مفلون (8) و گربه وحشی آفریقایی (9). 2- احیا گونه‌های جانوری منقرض شده: با توسعه تکنیک شبیه سازی و دست یابی به دانش شبیه سازی بین گونه‌ای، محققین موفق به تولید مجدد برخی گونه‌های منقرض شده از جمله گرگ قرمز ، گرگ سیاه حبشی و گرگ خاکستری شده‌اند (10،11). ایده تولید جنین شبیه سازی بین گونه‌ای از گونه‌های منقرض شده با تولد موفق گرگ خاکستری با استفاده از تخمک سگ و سلول‌های سوماتیک گرگ مرده (چند ساعت پس از مرگ) در ذهن محققین قوت گرفت (5). به طوریکه امروزه تفکر احیای گونه‌های منقرض شده از جمله برخی از حیوانات منقرض شده مانند ماموتها، دایناسورها و ... با استفاده از این تکنیک در برخی محافل علمی مورد توجه قرار گرفته است (8). 3- تولید یک گونه ‌جدید جانوری: از طریق دستکاری‌های ژنوم، ژن‌درمانی، حذف خصوصیات نامطلوب و یا اضافه نمودن برخی خصوصیات ویژه به ژنوم (1،2). 4- افزایش سرعت تکثیر ژن‌های برتر، تسریع روند تغییرات ژنتیکی (12،13) ودر نهایت تولید و تکثیر سریع نژادهای مقاوم به برخی از بیماریها (1). 5- تولید انبوه حیوانات ممتاز ژنتیکی با مقاصد اقتصادی (14،15). 6- انتخاب جنسیت حیوان از طریق انتخاب نوع سلول دهنده (14،16). 7- درک بهتر تعاملات پایه‌ای سیتوپلاسم تخمک با هسته سلول سوماتیک و بررسی مکانیسم‌های کنترل کننده روند تکاملی جنین و چگونگی شکل گیری بیماری‌های ژنتیکی. 8- پیشگویی سریعتر، ارزانتر و بهتر وضعیت سلولی- بیولوژیکی موجود زنده بواسطه ‌تولید کپی‌های ژنتیکی تقریباً مشابه از آن (1،2). 9- توسعه تکنیک‌های درمانی جدید (شبیه سازی درمانی) و ایجاد مدل‌های سلولی جدید از بیماری‌های انسانی با تولید انبوه جنین (قبل از لانه گزینی) و تهیه منابع کافی و مناسب از سلول‌های بنیادی جنینی (17). 10- کمک به درک صحیح دینامیسم ‌سلولی در سرطانها و آشکار شدن پتانسیل‌های سلول‌های بنیادی جنینی (13). 11- تسهیل تولید حیوانات تراریخته به منظور تولید پروتئین‌های دارویی: به دلیل قابلیت و سرعت تکثیر بسیار بالای سلول‌های دهنده می‌توان تعداد نامحدودی از سلول‌های حامل ژن الحاقی را تولید و همچنین جنسیت حیوان تراریخته را نیز مشخص نمود (16,15). در روش شبیه سازی مشکلات مطرح در خصوص احتمال موزائیسم و نقص در موقعیت استقرار کروموزومها که در روش تزریق DNA به داخل پرونوکلئوس تخمک لقاح یافته بسیار شایع است، منتفی می‌گردد (17). 12- انجام مطالعات وسیع در زمینه برنامه ریزی مجدد ژنوم ، نقش پذیری ژنی ، بررسی عملکرد ژنها و ژن درمانی (15). معایب شبیه‌سازی 1- ایجاد درجات مختلفی از اختلالات کروموزومی از آنپلوئیدی تا تغییرات ساختاری شدید کروموزومی(9): این قبیل اختلالات کروموزومی به دلیل عدم همزمانی سیکل سلولی سلول‌های دهنده و تخمک به خصوص در گونه‌هایی که اولین چرخه‌سلولی در آنها کوتاه می‌باشد، رخ می‌دهد مانند دوزیستان (Xenopus, Rana به ترتیب با طول چرخه 1 و 3 ساعت) و برخی از پستانداران نظیر موش. فراوانی این اختلالات در پستانداران بسیار کمتر از دوزیستان (19) است به طوریکه این میزان در گاو، گوسفند و موش به ترتیب 64، 40 و 93 درصد گزارش شده است (18). 2- عدم بیان و یا بیان ناقص ژنها: بروز این مشکل را می‌توان در پستانداران از طریق مجاورت سلول‌های دهنده با ترکیبات القاء کننده مناسب در محیط کشت قبل از انتقال مرتفع نمود (20). اختلالات مشاهده شده در فنوتیپ حیوانات شبیه‌سازی شده، از الگوی بیان ژنها نشأت ‌گرفته و این تنوع حتی قبل از لانه‌گزینی بسته به نوع سلول دهنده متفاوت است (21). 3- کاهش میزان آبستنی: درصد آبستنی و بقاء آن بسته به نوع سلول دهنده متفاوت می‌باشد. به عنوان مثال آبستنی و زایمان موفق جنین‌های شبیه‌سازی شده با استفاده از سلول‌های کومولوس، سلول‌های گرانولوزای جداری بالغ و سلول‌های اپیتلیال اویداکت بالا و میزان سقط جنین بسیار پایین گزارش شده است. در حالی که درصد آبستنی با جنین‌های حاصل از سلول‌های فیبروبلاست بسیار پایین است و اکثر جنینها در نیمه‌اول آبستنی سقط می‌گردند (24-22، 15،18). مع‌الوصف درصد آبستنی جنین‌های شبیه سازی شده در مقایسه با جنین‌های حاصل از IVF بسیار پایین‌تر می‌باشد (23،25). 4- کاهش تولد نتاج زنده: احتمال زنده ماندن جنین‌های شبیه‌سازی شده بدون توجه به گونه، بسیار پایین و بین 10-1% و حتی در مورد برخی سلول‌های دهنده کمتر از 1% گزارش شده است (2،16،19،24،26). 5- تولد جنین با نقایص تکاملی: عدم بازسازی تلومرهای کروماتین سلول دهنده، بیان نادرست ژن‌های اختصاصی در مراحل ابتدایی تکامل جنین و زمان تشکیل جفت یا جنین، الگوی نادرست تغییرات اپی ژنتیک (متیله شدن DNA، تغییرات پروتئین هیستون از قبیل استیله شدن، فسفوریله شدن و...)، کاربرد محیط‌های کشت مختلف، روش‌های مختلف خارج سازی هسته ، الحاق و کشت جنین زمینه ساز بروز نقایص تکاملی در جنین می‌باشند. بیشترین احتمال بروز این اختلالات در مراحل ابتدایی رشد و تکامل جنین (مورولا و بلاستوسیت) می‌باشد (5،25). 6- افزایش میزان سقط جنین: در گوسفند، قسمت اعظم آبستنیها در نیمه اول، بین روزهای 60-35 (26،29) و یا 35-21 (29) خاتمه می‌یابند. در حالیکه در گاو، بیشترین میزان سقط بین روزهای 60-30 آبستنی به خصوص روز 40-30 آبستنی (26،30) و یا پس از روز 90 آبستنی (23،27) رخ می‌دهد. شایعترین علل سقط، اختلالات و نارسایی‌های جفت به ویژه ادم، وجود پلاسنتوم‌های بزرگ و محدود (31،32)، هیدروآلانتوئیس (16،26)، خونریزی کارنکولی (30) و کاهش تعداد و اندازه ‌کوتیلدونها (30،33) عنوان شده است. از دیگر علل سقط در جنین‌های شبیه سازی شده می‌توان به نارسایی‌های تنفسی و ریوی (26,16)، اختلالات متابولیکی نظیر دیابت ملیتوس (24،26)، اختلالات ادراری‌ـ تناسلی، نارسایی‌های کلیوی به خصوص در بره‌ها (31) و نارسایی‌های کبدی (24) اشاره نمود. علیرغم مزایا و کاربردهای گسترده شبیه سازی و درصد تولید قابل قبول بلاستوسیست‌های حاصل از Sematic cell Nuclear Transfer (SCNT)، لیکن بازده این روش از نظر تولید نتاج زنده و پایدار همچنان کمتر از حد انتظار می‌باشد. با توجه به معایب و مشکلات عدیده مذکور، هدف از پژوهش حاضر تشریح عوامل تاثیرگذار بر روند شبیه سازی، معرفی تغییرات اپی‌ژنتیک و روش‌های دستکاری این تغییرات با تاکید بر اهمیت و لزوم شناخت شاخص‌های اپی‌ژنتیک دخیل در رشد و تکامل جنین‌های شبیه سازی شده، می‌باشد. روش بررسی منابع این نوشتار با جستجو در پایگاه‌های اطلاع رسانی الکترونیک، شامل Scopus, PubMed, ScienceDirect جمع‌آوری گردید. در فرایند جستجوی اینترنتی از کلید واژه‌های epigenetic modification and SCNT (215 مقاله)، Nuclear reprogramming and SCNT (299 مقاله) و Reconstructed oocyte and SCNT (232 مقاله) بهره گرفته شد. برای آغاز جستجو هیچ دامنه زمانی در نظر گرفته نشد و روند بروز رسانی تا زمان ارسال مقاله پیگیری شد. بحث تاکنون علل متعددی برای پایین بودن درصد تولید بلاستوسیست و وقوع بالای اختلالات عملکردی سیستم‌های حیاتی در جنین‌های شبیه سازی شده، عنوان شده است که از مهمترین آنها می‌توان به ناهمگونی و ناسازگاری پروتئین‌های تخمک با پروتئین‌های سلول دهنده، هتروپلاسمی میتوکندریایی، عدم برنامه ریزی کامل و مناسب ژنوم هسته انتقال داده شده، الگوی نامناسب تغییرات اپی ژنتیکی سلول دهنده (به ویژه متیلاسیون ژنوم و متیلاسیون و استیلاسیون غیرطبیعی هیستون)، بیان نامناسب (عدم بیان و یا بیان ناقص) ژن‌های جنینی و نقص در رونوشت‌برداری ژن‌هایimprinting در سلول‌های جفتی اشاره نمود. عوامل موثر در روند شبیه‌سازی عوامل موثر در کسب موفقیت در روند شبیه‌سازی را می‌توان به عوامل مرتبط با سلول دهنده ، سلول تخمک، همزمانی سیکل سلولی سلول دهنده و تخمک، روش خارج سازی هسته، روش فعال‌سازی تخمک پس از انتقال هسته، تغییرات اپی ژنتیک هسته سلول دهنده و هتروپلاسمی میتوکندریایی طبقه بندی نمود. 1- عوامل مربوط به سلول دهنده 1- 1- نوع سلول سوماتیک: انتخاب نوع سلول دهنده یکی از عوامل موثر و تعیین کننده درصد موفقیت در روند SCNT می‌باشد. تاکنون از سلول‌های مختلفی به عنوان سلول دهنده در روند SCNT استفاده شده که به ترتیب اهمیت شامل: سلول‌های فیبروبلاست جنینی، فیبروبلاست بالغ (جدا شده از پوست، عضله، رحم، اویداکت و ریه)، کومولوس ، گرانولوزی جداری ، بلاستومر، سلول‌های بنیادی جنینی، سلول‌های ستیغ تناسبلی ، سلول‌های ژرمینال جنینی ، سلول‌های ژرمینال اولیه ، سلول‌های اپی‌تلیال غدد پستانی، سرتولی نابالغ، لکوسیت‌های بالغ Tو B، ماکروفاژ، لنفوسیت، مونوبلاست، سلول‌های عضلانی، کبدی، تیروئیدی و طحال می‌باشند. 1-1-1- سلول‌های فیبروبلاست جنینی: پس از تولد دالی، قسمت عمده‌تحقیقات صورت گرفته در زمینه شبیه‌سازی به خصوص در نشخوار کنندگان معطوف به استفاده از این سلولها بعنوان سلول دهنده شده است. علت اصلی این انتخاب، سرعت رشد و تکثیر بالای این سلولها و پتانسیل بالای آنها در انجام تقسیمات متوالی تا رسیدن به مرحله پیری و مرگ می‌باشد (14،22،34،35). مهمترین عیب این سلولها، اندازه ‌نسبتاً کوچک آنها (mµ20-12) است. هر چه اندازه‌سلول دهنده کوچکتر باشد احتمال تماس مؤثر سلولها (دهنده و گیرنده) کمتر و بالطبع درصد الحاق سلولها کمتر خواهد بود. از طرف دیگر برداشتن حجمی از سیتوپلاسم، هر چند کوچک، در زمان خارج سازی هسته، سبب افزایش فضای بین زوناپلوسیدا و غشاء پلاسمایی تخمک شده بنابراین در صورت استفاده از سلول‌‌های کوچک به عنوان سلول دهنده، درصد الحاق بمراتب کمتر خواهد شد. این معضل به ویژه در روش معمول شبیه‌سازی جلب توجه می‌نماید (10،34،35). 2-1-1- سلول‌های فیبروبلاست بالغ: اغلب این سلولها از پوست و عضله اخذ می‌گردند. از معایب اصلی این سلولها نسبت به سلول‌های فیبرو بلاست جنینی، نیمه عمر کوتاه و پیر شدن سریع‌تر آنها در محیط کشت (16،35) و سرعت تکثیر پایین‌تر آنها (35،36) است. تنها مزیت قابل توجه آنها نسبت به سلول‌های رویانی، طولانی‌تر بودن بارز مرحله G0و یا G1 درآنهاست. با پیر شدن سلول‌سرعت سیکل ‌سلولی کمتر شده و طول سیکل و نیز طول فازهای G0 و یا G1 افزایش می‌یابد (35،37). 3-1-1- سلول‌های کومولوس: این سلولها جمعیت سلولی اختصاصی و تمایز یافته‌تری نسبت به سلول‌های گرانولوزا بوده که به دنبال افزایش ناگهانی هورمون LH در اواسط سیکل، تمایز نهایی خود را بدست می‌آورند (38). مزایای اصلی این سلولها شامل استحصال سریع و آسان آنها بدون وارد آمدن هرگونه آسیب به دام، مجاورت طبیعی این سلولها با تخمک و احتمالاً واکنش متقابل سیتوپلاسمی بین آنها، سازگاری بهتر با سیتوپلاسم تخمک، درصد بالای الحاق این سلولها با اووپلاسم، درصد بالای تولید بلاستوسیست، آبستنی و زایمان موفق (41-38) و نیز توقف طبیعی سیکل سلولی آنها در مرحله G0و یا G1 (22،27،35) می‌باشد. از معایب اصلی آنها می‌توان قابلیت محدود این سلولها جهت رشد و تکثیر در آزمایشگاه، متوقف شدن روند تقسیمات جنینی در مراحل ابتدایی تکامل و عدم توانایی شبیه سازی موجود نر اشاره نمود (35،40،42). گزارش‌هایی مبنی بر تولد نتاج زنده شبیه سازی شده به دنبال استفاده از این روش در گاو (41)، خوک (43)، موش (44،45) و بز (46) وجود دارد. 4-1-1- سلول‌های گرانولوزی جداری: این سلولها دارای خاصیت پرتوانی هستند و میانگین مدت زمان دو برابر شدن جمعیت (PD) این سلولها در محیط کشت 1/1±42 ساعت است (47). مزیت اصلی این سلولها، دسترسی آسان و جمع آوری سریع این سلولها به وسیله‌آسپیراسیون تخمک‌ توسط دستگاه لاپاراسکوپی و یا سونوگرافی و نیز متوقف بودن سیکل سلولی آنها در مرحله‌G0 و G1 و تنها عیب آنها، همانند سلول‌های کومولوس، امکان شبیه‌سازی انحصاری حیوانات ماده است (48). 5-1-1- بلاستومرها: شبیه‌سازی با استفاده از بلاستومر را شبیه سازی رویانی (EC) می‌نامند (32). این سلولها دارای خاصیت همه توانی (1) و یا پرتوانی (30) هستند. تحقیقات اولیه در خصوص شبیه‌سازی، اساساً معطوف به استفاده از بلاستومر‌های جنینی به عنوان سلول دهنده بوده است. با توجه به اینکه این سلولها نسبت به سایر سلول‌های سوماتیک تمایز نیافته‌تر می‌باشند، پس از انتقال نیاز به حداقل مدت زمان لازم برای برنامه‌ریزی مجدد دارند (10،28،34،49). اخیراً گزارشی مبنی بر عدم نیاز این سلولها برای سازماندهی مجدد پس از انتقال و برنامه ریزی خودبخودی آنها وجود دارد (49). از معایب اصلی استفاده از این سلولها محدود بودن تعداد آنها و طبعاً تعداد جنین‌های شبیه‌سازی شده، نامشخص بودن پتانسیل ژنتیکی جنین‌های حاصله، کوتاه بودن بارز طول مرحله G1 (15% طول سیکل سلولی)، موثر نبودن روش همزمانی کشت آنها در محیط حاوی مقادیر پایین سرم (5/0-1/0%) و عدم توانمندی جنین‌های شبیه سازی با استفاده از این سلولها در عبور از مرحله بلوکه شدن سلولی اشاره نمود (16،28،34،36،49). 6-1-1- سلول‌های بنیادی جنینی: این سلولها پرتوان و کاملاً تمایز نیافته و از لحاظ مورفولوژی دارای غشایی نسبتاً شفاف، هسته کاملاً بزرگ وشفاف با هستک‌های کاملاً مشخص و برجسته و نسبت بالای هسته به سیتوپلاسم هستند. در سیتوپلاسم این سلولها وزیکول‌‌های چربی فراوان مشاهده می‌گردد. این سلولها در پاساژهای متعدد (در گاو پس از 50 پاساژ یا 12 ماه کشت در آزمایشگاه) کاریوتیپ طبیعی خود را حفظ می‌کنند و قادر به تشکیل اجسام شبه جنینی هستند. ظاهر این اجسام، مشابه جنین مرحله بلاستوسیست است و می‌توانند به انواع مختلف سلولها تمایز یابند. معایب اصلی این سلولها مشکل بودن استخراج و تخلیص آنها، سرعت رشد و تکثیر پایین در شرایط آزمایشگاهی، درصد آبستنی بسیار پایین، خاتمه یافتن آبستنی و سقط، به خصوص در نیمه اول آبستنی که غالباً به دلیل عدم و یا نقص در تشکیل کوتیلدونها و یا خونریزی کارنکولی است، می باشد. میانگین دو برابر شدن جمعیت این سلولها در گونه‌های مختلف معمولاً 24 ساعت است (30،34). 2-1- اندازه سلول سوماتیک: انتخاب سلول دهنده با قطر و ویژگی‌های مناسب، درصد الحاق سلولی و روند تکاملی جنین را تحت تأثیر قرار می‌دهد. در صورت انتخاب سلولی با قطر بسیار کوچک، به دلیل عدم تماس مؤثر آن‌با غشاﺀپلاسمایی تخمک، درصد الحاق سلولی کاهش یافته و حال آنکه با انتخاب سلولی با قطر بسیار بزرگ، علیرغم درصد الحاق بالا، لیکن اختلالات کروموزومی (از آنپلوئیدی تا پلی پلوئیدی) در جنین‌های حاصله افزایش و درصد تولید مورولا و بلاستوسیست به طور مشخص کاهش می‌یابد (12،14،26،31،33). 3-1- جنسیت حیوان دهنده ‌سلول سوماتیک: تلاش‌های اولیه در زمینه SCNT، اساساً معطوف به استفاده از سلول‌های حیوان ماده (سلول‌های اپیتلیال پستان، اپیتلیال اویداکت، کومولوس و گرانولوزا) به عنوان سلول دهنده بوده است. گزارشات ضد ونقیضی در خصوص تاثیر جنس حیوان دهنده سلول سوماتیک بر روی کارایی و درصد موفقیت SCNT به چشم می‌خورد. Hosseini و همکاران با بررسی و مقایسه سلول‌های کومولوس، فیبروبلاست قوچ و فیبروبلاست میش، تاثیر جنسیت حیوان دهنده سلول را روی میزان آسیب سلولی پس از انتقال به فضای Perivitelline، میزان برنامه ریزی مجدد هسته (NR) ، درصد تسهیم ، درصد جنین‌های 16-8 سلولی، مورولا و بلاستوسیست را منتفی دانسته و تنها تاثیر جنسیت را روی درصد جنین‌های 8-5 سلولی گزارش نموده‌اند. این محققین درصد جنین‌های 8-5 سلولی شبیه سازی شده با استفاده از سلول‌های نر را به طور معنی‌دار بیشتر از سلول‌های ماده گزارش نموده‌اند (38). Kato و همکاران نیز با مقایسه ‌سلول‌های اخذ شده از گاوهای نر نابالغ و جنین‌های نر با گاوهای ماده بالغ و جنین‌‌های ماده، وجود هرگونه ارتباط معنی‌دار بین جنسیت حیوان دهنده و درصد تولید بلاستوسیست را منتفی دانسته‌اند (50). این در حالی است که گزارش Stice و همکاران و نیز Wakayama و همکاران حاکی از وجود ارتباط معنی‌دار بین جنسیت حیوان دهنده و درصد تولید بلاستوسیست می‌باشد. به نحوی که انتخاب سلول دهنده از حیوان نر، درصد تولید بلاستوسیست را به طور معنی‌دار کاهش داده است (30،45). لیکن انتقال این جنین به رحم حیوان، درصد آبستنی بالاتری را به دنبال داشته است (30). 4-1- سن حیوان دهنده ‌سلول سوماتیک: علیرغم عدم وجود ارتباط معنی‌دار بین سن حیوان دهنده سلول و طول سیکل سلولی، لیکن با افزایش سن حیوان دهنده‌سلول سوماتیک، درصد تولید بلاستوسیست به طور معنی‌دار کاهش می‌یابد (51). Tian و همکاران با مقایسه و بررسی سلول‌های اخذ شده از گاوهای بالغ (2 ساله، 12-10 ساله و 16 ساله)، گوساله‌های تازه متولد شده و جنین های ‌ 57 روزه، هیچ تفاوت معنی‌داری در درصد تسهیم جنین‌های شبیه‌سازی شده با استفاده از سلول‌های بالغ و جنینی مشاهده ننموده‌اند؛ لیکن اغلب جنین‌های حاصل از سلول‌های بالغ در مراحل پیشرفته‌آبستنی سقط شده و یا در صورت زنده ماندن طیف وسیعی از اختلالات را نشان دادند (15). 5-1: همزمان نمودن سیکل سلولی سلول‌های دهنده: 1-5-1- سیکل سلولی و طریقه کنترل آن: سیکل سلولی در سلول‌های یوکاریوت شامل سه مرحله اینترفاز (مرحله رشد)، میتوز یا کاریوکینز (مرحله تقسیم هسته) و سایتوکینز (مرحله تقسیم سیتوپلاسم و ارگانل‌های آن) می‌باشد. اینترفاز خود شامل سه مرحله G1 ، Sو G2 بوده و G1 مهمترین و طولانی‌ترین مرحله اینترفاز می‌باشد. برخی سلولها از مرحله G1 خارج و وارد مرحله G0 (مرحله سکون) می‌گردند. سلول‌های این مرحله با حفظ فعالیت اختصاصی خود، در وضعیت غیرفعال (کمون) باقی می‌مانند. مراحل مختلف سیکل سلولی بوسیله پروتین‌های مختلف سیتوپلاسمی کنترل و تنظیم می‌گردد. سایکلینها ، سایکلین کینازها (Cdks) و سایکلوزومها (APC) مهمترین کنترل کنندگان سیکل سلولی بوده و فعالیت آنها توسط مکانیسم‌های مختلف داخل و خارج سلولی کنترل و تنظیم می‌گردد. از بین سایکلین‌های تنظیم کننده روند سیکل سلولی، سایکلین‌های گروه B (فاکتورهای پیشبرنده مراحلG2 و M )، سایکلین A (فاکتورهای پیشبرنده مراحل S و M)، سایکلین‌های D وE (فاکتورهای پیشبرنده مرحله G1 ) و سایکلین K (فاکتورهای پیشبرنده مرحله S) و نقش مهمی را ایفا می‌کنند. مقادیر این سایکلینها در سلول با پیشرفت سیکل سلولی تغییر می‌نماید. خانواده سایکلین کینازها در کنترل روند پیشرفت تقسیمات سلولی بویژه تبدیل مرحله G1به S ، تکثیر سلولها و بقاء موجود زنده دخالت می‌نمایند. در پستانداران سایکلین کیناز 2؛ Cdk2 با اتصال به سایکلین‌های D و E سبب کنترل مرحله G1 و با اتصال به سایکلین A سبب کنترل مرحله S می‌گردد. Cdk1 با اتصال به سایکلین‌های A و B سبب کنترل مرحله S و با اتصال به سایکلین B سبب کنترل مراحل G2 و M می‌گردد. سایکلین کینازهای4، 5 و6 (CdK4, 5, 6) نیز با اتصال به سایکلین D سبب کنترل مرحله G1 سیکل سلولی می‌گردند. سطح این سایکلین کینازها در سلول نسبتاً ثابت بوده؛ لیکن با توجه به اینکه فعال شدن آنها اساساً وابسته به اتصال آنها به گروه فسفات سایکلین مربوط به خود بوده و سطح سایکلینها در سلول بسیار متغیر می‌باشد، بنابراین توجه به میزان فعالیت سایکلین کینازها بسیار مهمتر از میزان کمی آنها در سلول است. فاکتورهای پیشبرنده مرحله M به ویژه سایکلین A با اتصال به Cdk2 وارد هسته شده و سلول را برای رونوشت برداری از DNA آماده می‌نماید. با ادامه رونوشت برداری از DNA، سطح سایکلین E به شدت کاهش و سطح سایکلین B شروع به افزایش می‌نماید. در این مرحله سلول وارد مرحله G2 می‌گردد. فاکتورهای پیشبرنده مرحله M به ویژه سایکلین B با اتصال به Cdk1 موجب شکل گیری دوک تقسیم، NEBD، توقف تمامی ژن‌های رونوشت برداری و متراکم شدن کروماتین می‌گردند. این سایکلین با فعال نمودن سایکلوزومها (APC) سلول را به سمت مرحله متافاز پیش می‌برد. سایکلوزومها، کمپلکس پیشبرنده مرحله آنافاز (APC) نیز نامیده می‌شوند. این مجموعه محرک وقایعی هستند که منجر به کاهش میزان سایکلین‌های B در سلول، از بین رفتن چسبندگی کروماتیدهای دختر و تسهیل جدا شدن آنها از یکدیگر می‌گردد. به دنبال فعال شدن APC، سطح سایکلینB بسیار کاهش، سنتز سایکلین Dبه طور معنی‌دار افزایش و کروماتیدهای دختر روی صفحه متافازی از یکدیگر جدا و به جوانب کشیده خواهند شد (52). از طرف دیگر سایکلوزومها نقش به سزایی در کاهش Geminin دارند. Geminin (Gmnn) پروتئین هسته‌ای متشکل از 200 اسید آمینه، وزن ملکولی تقریباً KDa 25 و عضوی از سیستمAPC-ubiguitin بوده و نقش به سزایی در کنترل سیکل سلولی دارد. سلول‌های مرحله G1 فاقد این پروتئین بوده به تدریج با شروع مرحله S در سلول تظاهر یافته وتا مرحله M به حداکثر میزان خود می‌رسد. در انتهای مرحله M بدنبال فعالیت زیاد کمپلکس APC و سایکلین کینازها میزان آن به شدت کاهش می‌یابد. این پروتئین دارای نقش به سزایی در مهار لود شدن کمپلکس MCM (کمپلکس ضروری جهت آغاز رونوشت برداری ژن‌های یوکاریوت)، مهار عملکرد فاکتورهای پروتئینی رونوشت برداری از جمله Brg1, Scmh1, SW1/SNF بویژه cdt1 (جلوگیری از رونوشت برداری DNA به بیش از 1 راند در هر سیکل)، مهار روند یوبیکویتیناسیون cdt1 (مهمترین فاکتور رونوشت برداری) و پروتئولیز (غیرفعال شدن) آن، خاتمه میتوز (جلوگیری از رونوشت برداری مجدد DNA تازه رونوشت برداری شده مرحله S)، کنترل روند تقسیم و تمایز سلولی (بویژه در سیستم اعصاب مرکزی، اسکلتی و چشم) و هماهنگ کننده تقسیمات سلولی در راستای تمایز سلولها می‌باشد. میزان این پروتئین بستگی تام به نحوه بیان ژن Gmnn دارد. لیکن با تمهیداتی نظیر کنترل روند پروتئولیز ubiquitin در زمان تقسیم میتوز (مهار روند مذکور سبب کاهش مشخص میزان Geminin و شروع دور جدید رونوشت برداری DNA می‌گردد) و نیز RNAi می‌توان تا حدودی میزان آنرا تنظیم نمود. RNAi فرایند خاموشی ژنها وابسته به RNA می‌باشد که بنام‌های سرکوب کننده، خاموش کننده ژنها پس از رونوشت برداری و یا ساپرس کنندگان همزمان نیز نامیده می‌شوند. این فرایند نقش بسزایی در تنظیم عملکرد سلول‌های دفاعی بدن در مقابل ژن‌های مهاجم به سلول (ژن‌های ویروسی، انگلی، ترانسپوزونها و ...)، کنترل عملکرد ژن‌های فعال مرتبط با روند تکثیر و تمایز سلولها و همچنین در تنظیم نحوه بیان آنها دارد. مهار Geminin بواسطه RNAi سبب رونوشت برداری مجدد قطعه‌‌ای از ژنوم و متعاقب آن آنپلوییدی می‌گردد. این موضوع در درمان سرطان و تخریب سلول‌های توموری اهمیت فراوانی دارد چرا که بدنبال مهار این پروتئین به سرعت (در عرض چند روز) رشد و تکثیر سلول‌های توموری کاهش و روند آپپتوزیس آغاز می‌گردد. البته این نکته حاﺋز اهمیت است که هنوز سلول‌های توموری اولیه و پیش ساز به این استراتژی پاسخ مناسبی نشان نداده‌اند (53). 2-5-1- انتخاب سلول مناسب جهت انتقال: با توجه به استفاده از تخمک‌های MII به عنوان سلول گیرنده در روند SCNT، شناخت و انتخاب سلول دهنده در مرحله مناسب از سیکل سلولی (G0 و یاG1) امری اجتناب ناپذیر است. در این بین برخی از سلولها مانند سلول‌های سرتولی و عصبی (22،27،47) و 90% از سلول‌های کومولوس (22،27) به طور طبیعی و بدون اعمال هیچگونه برنامه همزمانی در فاز G0 و یا G1 متوقف می‌باشند. در همین خصوص برخی از محققین سلول‌های گرانولوزا، کومولوس و فیبروبلاست جنینی را به دلیل اینکه اغلب در فاز G0 و یا G1 از سیکل سلولی به سر می‌برند، سلول‌های مناسب جهت انتقال معرفی نموده‌اند (26). Tomii و همکاران با مقایسه سلول‌های فیبروبلاست گاوی فاز G0 و G1 گزارش نمودند انتقال سلول‌های فاز G0 نسبت به سلول‌هایی که در اوایل و یا اواخر فاز G1 همزمان شده‌اند موجب افزایش معنی‌دار در تولد نتاج زنده می‌شوند و این در حالی است که انتقال سلول‌های فیبروبلاست ترانسژنیک فاز G1 نسبت به G0 افزایش مشخص در درصد آبستنی، تولد نتاج زنده و قابلیت ماندگاری جنین پس از تولد را به دنبال داشته است (54). در صورت انتقال سلول سوماتیک مراحل S، G1 و G2 به اووپلاسم مرحله MII، گسیختگی غشاء هسته؛ (NEBD) ، متراکم شدن زودرس کروموزومها؛ (PCC) ،شکل گیری مجدد غشاء هسته و رونوشت برداری از DNA حتمی خواهد بود. وقوع و شدت این تحولات بسته به گونه، روش انتقال هسته، سن تخمک، نوع سلول سوماتیک، سطح و میزان فعالیت فاکتور پیشبرنده بلوغ (MPF) اووپلاسم و مدت زمان مواجهه سلول سوماتیک با فعالیت بالای MPF متفاوت می‌باشد. در صورت انتقال سلول‌های سوماتیک فاز G2 به اووپلاسم مرحله MII، سریعاً NEBD و PCC اتفاق افتاده، کروماتین متراکم گردیده و کروموزوم‌های طویل با دو کروماتید تشکیل خواهند شد. سپس به دنبال شکل گیری مجدد غشاء هسته رونوشت برداری مجدد از DNA صورت گرفته و جنین حاصله دچار ناهنجای‌های وسیع کروموزومی خواهد شد. در صورت استفاده از سلول‌های فاز S، سرعت PCC کندتر خواهد بود. پس از شکل گیری مجدد غشاء هسته، رونوشت برداری مجدد به طور کامل یا جزئی صورت خواهد گرفت و مجدداً جنین دچار ناهنجاری‌های کروموزومی خواهد شد. تنها در صورت انتقال سلول‌های سوماتیک فاز G1 به اووپلاسم مرحله MII، روند طبیعی NEBD و PCC و به دنبال آن رونوشت برداری طبیعی از DNA اتفاق خواهد افتاد. در صورت انتقال سلول سوماتیک مرحله G2 به اووپلاسم مرحله S، رونوشت برداری مجدد از DNA اتفاق نمی‌افتد. مگر زمانی که از دترجنتها به منظور افزایش نفوذپذیری غشاء سیتوپلاسمی هسته استفاده گردد. در این صورت رونوشت برداری مجدد از DNA صورت گرفته و جنین حاصله دچار ناهنجاری‌های کروموزومی خواهد شد (55). 3-5-1- روش‌های همزمانی سیکل سلولی: به منظور همزمان سازی سیکل سلولی سلول‌های دهنده در مراحل G0 و یاG1 از ترکیبات و یا روش‌های مختلفی می‌توان استفاده نمود. 1- استفاده از ترکیبات دارویی و شیمیایی: ترکیبات شیمیایی که تاکنون مرد استفاده قرار گرفته عبارتند از: Democolcine (دپلاریزه‌کننده‌میکروتوبولها)، Nocodazole، Colcemid (مهارکننده میکروتوبولها)، Aphidicoline (مهار کننده قابل برگشت و موثر DNA پلیمراز پستانداران) و Roscovitine (مهارکنندهMPF و Cdk2 اختصاصی) (10،51،56،57). سه ترکییب نخست سبب توقف سیکل سلولی در مرحله‌M می‌شود. به دنبال قطع این ترکیبات، سلولها از مرحله‌M عبور می‌نمایند و وارد فاز G1 می‌گردند. Aphidicoline که معمولاً همراه با داروهای مهار کننده‌میکروتوبولها به کار برده می‌شود سبب توقف سیکل سلولی در مرحله‌ی S /G1 می‌گردد (51،56). Roscovitine مهار کننده سایکلین کیناز 2 (Cdk2) و MPF است و موجب همزمانی سیکل سلولی، افزایش وقوع احتمال برنامه ریزی و سازماندهی مجدد هسته سلول سوماتیک پس از انتقال؛ (SCNR) و نیز افزایش درصد آبستنی خواهد شد (11،57،58). این دارو معمولاً همراه با داروهای مهار کننده‌میکروتوبولها به کار برده می‌شود و سبب همزمانی سیکل سلولی سلول‌های سوماتیک در فاز G1، افزایش معنی‌دار احتمال SCNR و بهبود درصد آبستنی و زایمان موفق خواهد شد (10،11). ترکیبات شیمیایی دیگری نیز وجود دارند که به واسطه تداخل در عوامل تنظیم کننده‌های پروتئین کیناز‌ها سبب توقف تقسیمات سلولی در مرحله‌G1 می‌گردند. 2- استفاده از سلول‌های دهنده با درجه تراکم بالا (90-80%) در محیط کشت: کشت‌‌های متراکم حاوی سلول‌هایی با سیکل سلولی طولانی‌تر هستند زیرا تماس نزدیک سلولها با یکدیگر سبب متوقف شدن تقسیمات سلولی (مهار تماسی) و بالطبع طولانی‌تر شدن فاز G1 می‌گردد (10،49،51). 3- روش Shake-off: این روش سبب جداسازی سلول‌های فاز G1 می‌گردد. برخی از محققین دقت این روش در جداسازی سلول‌های فاز G1 را 100% عنوان می‌نمایند و با مقایسه این روش با روش قبل نشان داده‌اند در صورتی که از سلول‌های فاز G1 همزمان شده با روش shake-off استفاده گردد، درصد آبستنی و زایمان موفق به طور معنی دار بیشتر از مواردی است که از سلول‌های همزمان شده با روش قبل استفاده گردد (59). در این روش سلول‌های تازه تقسیم شده‌ای که توسط ارتباطات سیتوپلاسمی به یکدیگر متصل شده‌اند به عنوان سلول‌های فاز G1 قلمداد می‌گردند (51). 4- افزایش تعداد دفعات پاساژ: این کار سبب افزایش درصد سلول‌های فازهای G0 و G1 می‌گردد؛ زیرا افزایش تعداد دفعات پاساژ، سبب پیر‌تر شدن سلولها و افزایش طول سیکل سلولی به خصوص فاز G1 می‌گردد (28). 5- کشت سلولها در محیط‌های حاوی مقادیر پائین سرم (5/0-1/0%): کشت سلولها در این شرایط نه تنها سبب کاهش فعالیت رونوشت برداری و تغییر ساختار هسته و کروماتین سلولهای سوماتیک می‌گردد؛ بلکه سبب توقف سیکل سلولی در فاز G1 (15،33،60،61) و یا G0 (2،22،62) و نیز تسریع SCNR پس از مواجهه با فاکتورهای سیتوپلاسمی می گردد (10،22،31،49). در صورت استفاده از بلاستومر به عنوان سلول دهنده، استفاده از این روش همزمانی موثر نخواهد بود؛ چرا که روند پیشرفت و کنترل سیکل سلولی سلول‌های بلاستومر با سایر سلول‌های سوماتیک متفاوت است (49،63). بررسی‌های اخیر نشان داده است استفاده از این روش همزمان سازی سبب افزایش وقوع آپپتوزیس سلول‌های سوماتیک، کاهش معنی‌دار درصد بلاستوسیست، آبستنی و زایمان موفق می‌گردد (64). مقایسه ‌سه روشShake-off ، کشت با تراکم بالا (مهار تماسی) و کشت در محیط‌های حاوی سرم پایین نشان داده است، کشت سلول‌های دهنده تا در درجات تراکم بالا (روش مهار تماسی) سبب همزمانی بهتر و دقیقتر سلول‌های دهنده در فاز G1 (59) و یا G0 (51) می‌گردد. 6-1- نحوه ‌ورود سلول‌های دهنده: سلول‌های دهنده را می‌توان از دو طریق با اووپلاسم تلفیق نمود: - الحاق سلولها با اعمال پالس الکتریکی (روش راسلین) : تولد دالی به عنوان مهمترین رخداد در تاریخ علم شبیه سازی با استفاده از این روش صورت گرفته است. در این روش همزمانی سیکل سلولی سلو‌ل دهنده و تخمک از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. در این روش پس از اخذ سلول سوماتیک از دام بالغ و همزمانی سیکل سلولی آنها در مراحل G0 و یاG1 (اغلب با استفاده از روش کشت در محیط‌های حاوی مقادیر پایین سرم)، سلول دهنده و تخمک در کنار یکدیگر قرار داده می‌شوند و پالس الکتریکی اعمال می گردد. پالس الکتریکی نه تنها سبب الحاق سلولها می‌شود؛ بلکه موجب فعال سازی جنین جهت القای روند تکاملی تقسیمات جنینی نیز می‌گردد (1،2،23). - روش تزریق مستقیم سلول به داخل اووپلاسم : این روش برای اولین بار توسط Wakayama و Yanagimachi در دانشگاه هاوایی روی موش انجام شد. این محققین در سال 1998 با استفاده از سلول‌های کومولوس، سرتولی و عصبی موفق به تولید 5 بچه موش از سه سویه مختلف شدند (45). مزیت مشخص این تکنیک نسبت به روش قبل، درصد بالاتر تولید بلاستوسیست و موفقیت بیشتر روند شبیه سازی است (1،2،23). 2- فاکتورهای مربوط به تخمک گیرنده در روند شبیه سازی، غالبا از تخمک ‌بعنوان سلول گیرنده استفاده می‌گردد. علل این انتخاب را می‌توان به دلیل دسترسی و استحصال آسان آنها، قابلیت این سلولها در حمایت از ادامه‌روند تکاملی تقسیمات جنینی و قابلیت الحاق این سلولها دانست (64،65). البته به جای تخمک‌های متافازII، می‌توان از زیگوت و یا جنین دو‌سلولی فاقد هسته نیز استفاده نمود. این جایگزینی در موش برخلاف پستانداران کاربرد وسیعی دارد. مزیت اصلی زیگوت‌این است که در آن لقاح به طور طبیعی سبب فعال‌سازی سیتوپلاسم ‌می‌گردد؛ لذا به نظر می‌رسد برنامه‌ریزی مجدد هسته‌سلول‌های دهنده پس از انتقال در مورد آنها تسهیل شود (67،68). 1-2- سن حیوان دهنده تخمک: علیرغم اینکه تخمک‌های اخذ شده از حیوانات مسن‌تر نسبت به تخمک‌های گونه‌های جوانتر سریعتر و راحت‌تر فعال می‌گردند و به نظر می‌رسد روند فعال سازی بعدی جنین تجدید ساختار شده بسیار ساده تر و سریعتر باشد (69،70،71). لیکن با افزایش سن حیوان دهنده، تخمک به دلیل تضعیف ساختار سایتواسکلتال، سریعتر در روند خارج سازی هسته دچار آسیب شدید سلولی می‌گردد و احتمال آپپتوزیس در جنین حاصله به طور قابل توجه افزایش می‌یابد. از آنجائیکه دوک تقسیم توسط ارگانل‌های اووپلاسم شکل‌می‌گیرد با افزایش سن ارگانل‌های سیتوپلاسم، قابلیت دوک در جدا نمودن کروموزوم‌های هومولوگ کاهش و احتمال هر گونه اختلال در جدا شدن کروموزومها (به ویژه آنپلوئیدی) به طور مشخص افزایش می‌یابد (66،71). مقایسه تخمک‌های اخذ شده از گاوهای سنین مختلف نشان داده است با افزایش سن حیوان دهنده تخمک نه تنها درصد تسهیم، مورولای متراکم و بلاستوسیست به طور معنی‌دار کاهش می‌یابد؛ بلکه پس از انتقال جنین‌های شبیه سازی شده درصد آبستنی، زایمان موفق و نیز قابلیت زنده ماندن گوساله‌های متولد شده نیز به طور مشخص کاهش یافته است (70). علل احتمالی این رخداد می‌تواند قابلیت بالاتر تخمک‌های جوان‌تر در طی نمودن روند تکاملی، کیفیت بالاتر جنین‌های حاصله و سطح بالای پروتئینها، پروتئین کینازها و ترانسکریپت‌های مرتبط با روند SCNR در اووپلاسم تخمک‌های جوان است (71،72). Rizos و همکاران نیز با مقایسه تخمک‌های گوساله‌های زیر 30 ماه با گاوهای بالای 4 سال نشان داده‌اند علیرغم یکسان بودن تعداد تخمک‌های جمع آوری شده از تخمدان‌های هر دو گروه، درصد مورولا و بلاستوسیست بدست آمده از گوساله‌های زیر 30 ماه به طور معنی‌دار بیشتر از گروه دوم بوده است (72). Mermillod و همکاران نیز درصد مورولا و بلاستوسیت حاصل از تخمک‌های جمع آوری شده از گاوهای 3-1 سال را مشابه یکدیگر و به طور معنی‌دار بیشتر از گاوهای بالای 3 سال گزارش نموده‌اند (73). 2-2- وضعیت تخمک گیرنده: 1-2-2- تخمک‌های فعال نشده ‌فاقد هسته: تغییرات سلول‌های دهنده پس از انتقال توسط پروتئین کینازهای مختلف اووپلاسم (از جمله MPF و MAPK) کنترل و تنظیم می‌گردند. این پروتئین کینازها سبب متراکم شدن کروماتین و منظم شدن کروموزومها در مرکز دوک تقسیم می‌شوند. سیتوپلاسم این تخمکها در مرحله‌ متافاز II دارای سطح بالای فعالیت هیستون H1 کیناز، MPF و MAPK هستند. به دنبال انتقال سلول سوماتیک و مواجهه هسته با سطح بالای این پروتئین کینازها یک سری تغییرات ساختاری خاصی در سلول دهنده رخ می‌دهد که شامل NEBD و به دنبال آن PCC، منظم شدن کروموزومها در مرکز دوک تقسیم، ناپدید شدن هسته، تشکیل مجدد غشاء هسته و متورم شدن آن است (34،51،66،74،75). شدت و میزان وقوع PCC و NEBD بسته به میزان فعالیت پروتئین کینازهای مذکور به ویژه MPF اووپلاسم، مدت زمان مجاورت هسته سلول سوماتیک با آنها، نوع سلول سوماتیک منتقل شده، سن تخمک و گونه، متفاوت است. در موش میزان و فعالیت بالایی از MPF و MAPK در هسته تخمک و در مجاورت دوک تقسیم وجود دارد که به دنبال خارج سازی هسته، حجم بالایی از این کینازها از تخمک خارج می‌گردد. در حالی که در خوک اغلب این کینازها و عملکرد اصلی آنها در اووپلاسم متمرکز است و خارج سازی هسته تفاوت چندانی در میزان و فعالیت کینازها ایجاد نمی‌نماید. بررسیها در گوسفند نشان داده است تخمک‌های دارای هسته نسبت به تخمک‌هایی که هسته آنها خارج گردیده‌اند بسیار مستعدتر و دارای سطح بالاتری از پروتئین کیناز می‌باشند، با این حال خارج سازی حجمی از سیتوپلاسم متعاقب خارج سازی هسته و حذف مقادیری از MAPK و MPF منجر به کاهش قابل توجهی در میزان SCNR و توقف روند تکامل جنین نمی‌گردد (68). به منظور افزایش سطح MAPK و MPF و فعالیت آنها می‌توان از کافئین که یک عامل مهارکننده پروتئین فسفاتاز و نیز مهارکننده پروتئوزوم است، استفاده نمود. استفاده از کافئین سبب افزایش SCNR و افزایش درصد تسهیم جنین‌های شبیه سازی شده می‌گردد (49). 2-2-2- تخمک‌های فعال شده ‌فاقد هسته: به فعال سازی تخمک قبل از انتقال هسته، پیش فعال سازی گفته می‌شود و بیشتر زمانی به کار می‌رود که از بلاستومر‌ها به عنوان سلول‌های دهنده استفاده گردد (67). به دنبال لقاح و یا فعال سازی جنین، میزان و فعالیت MPF، MAPK و آنزیم هیستون H1 کیناز بدلیل نوسانات کلسیم و تخریب سایکلین B1، توسط دستجات پروتئوزومی، کاهش می‌یابد. این شرایط سبب می‌گردد تخمک از مرحله‌متافاز II خارج، پرونوکلئوس تشکیل و روند تکاملی تقسیمات سلول ادامه یابد (29). تحت این شرایط سیتوپلاسم این تخمکها در مرحله‌ اینترفاز (66،51) گیرنده مناسبی برای سلول‌های دهنده با مراحل مختلف سیکل سلولی است. به طوریکه پس از انتقال سلول سوماتیک مراحل S،G2، G1وG0، به دلیل سطح پایین پروتئین کینازها، NEBD وPCC اتفاق نخواهد افتاد و رونوشت برداری از DNA بسته به مرحله سیکل سلولی سلول دهنده مشاهده خواهد شد. در صورت انتقال سلول‌های مراحل G0 و G1، رونوشت برداری از DNA آغاز و به طور طبیعی پیش خواهد رفت. در صورت انتقال سلول‌های مرحله S، رونوشت برداری از DNA ادامه یافته و به طور طبیعی خاتمه خواهد یافت و در صورت انتقال سلول‌های مرحله G2، رونوشت برداری از DNA ادامه خواهد یافت و قطعاتی از DNA که قبلاً رونوشت برداری شده، مجدداً رونوشت برداری نخواهد شد. در تمامی موارد جنین حاصله از لحاظ کروموزومی کاملاً طبیعی و فاقد هر گونه ناهنجاری می‌باشند (49،51،67،68،75) البته گزارش‌هایی مبنی بر انتقال سلول‌های مرحله G2 و آسیب کروموزومی متعاقب PCC و ایجاد جنین‌های با کروموزومها غیر متعارف وجود دارد (51،67). 3-2- توانایی اووپلاسم در برنامه‌ریزی مجدد هسته‌سلول دهنده: اصطلاح برنامه ریزی مجدد هسته (NR) برای اولین بار در روند شبیه سازی دوزیستان به کار گرفته شد و به معنای تغییرات مورفولوژیک و مولکولی هسته سلول سوماتیک پس از مواجهه با اووپلاسم است (76). بعدها این تعریف، تغییرات کروماتین و نحوه بیان ژن را نیز شامل شد. وقایعی که در روند NR در هسته سلول سوماتیک رخ می‌دهد اساساً مشابه تغییرات DNA اسپرم و تخمک در روند لقاح طبیعی است؛ لیکن تفاوت‌هایی در این بین وجود دارد که به آنها پرداخته خواهد شد. SCNR اساساً وابسته به فاکتورهای سیتوپلاسمی تخمک می‌باشد. این عوامل خاص، منحصراً در اووپلاسم تخمک‌های بالغ (مرحله MII) بارور نشده (یا به عبارتی فعال نشده) و فقط به مدت کوتاهی پس از فعال شدن تخمک وجود دارند و لازم است کروماتین سلول سوماتیک مستقیماً با این فاکتورها مواجه گردد (33). محرک اصلی روند SCNR، فعالیت بالای MPF اووپلاسم می‌باشد. MPF از دو زیر واحد به نام زیر واحد کاتالیتیک CDC2 که مشابه پروتئین کیناز cdc2 مخمر می‌باشد و زیر واحد تنظیم کننده CyclinB تشکیل شده است. به دنبال ورود سلول سوماتیک به داخل اووپلاسم، فعالیت بالای MPF سبب شروع وقایعی نظیر NEBD، PCC و یکسری تغییرات اپی‌ژنتیکی در کروماتین سلول سوماتیک می‌گردد. در صورتیکه این تغییرات اپی‌ژنتیک به طور منظم در روند طبیعی خود پیش نروند، دامنه وسیعی از انواع ناهنجاری‌های کروموزومی در جنین ایجاد می‌گردد. از جمله مهمترین آنها، تغییرات اپی‌ژنتیکی مسئول NR، استیله ومتیله شدن هیستون و متیله شدن DNA می‌باشند. 4-2- زمان خارج سازی محتویات ژنومی تخمک: مناسب‌‌ترین زمان برای خارج سازی جسم قطبی (pb) و صفحه متافازی تخمک در گوسفند h 24-22 و در گاو h 26-24 پس از شروع IVM بوده و توصیه شده تخمک‌هایی که در گوسفند و گاو به ترتیب ظرف مدت 24 و 26 ساعت پس از شروع کشت، pb مشخصی ندارند از مطالعه حذف گردند (35). 5-2- کیفیت و کمیت اووپلاسم: کیفیت اووپلاسم تخمک‌هایی که در شرایط in vitro بالغ شده‌اند بسیار پایین تر از تخمک‌هایی است که در in vivo بالغ شده‌اند. لیکن به دلیل دسترسی آسان و فراوانی تخمک‌های کشت داده شده در شرایط آزمایشگاهی معمولاً از این تخمکها به عنوان سلول گیرنده استفاده می‌گردد. در صورت استفاده از تخمک‌های بلوغ یافته در آزمایشگاه توجه به نکاتی از جمله انتخاب فولیکول جهت آسپیره کردن، مدت زمان و شرایط محیط کشت تخمکها، شرایط اتمسفر حاکم بر انکوباتور و انتخاب تخمک‌های مناسب جهت خارج سازی هسته ضروری است (35). 3- همزمانی سیکل سلولی سلولهای دهنده و گیرنده به منظور اجتناب از اختلالات کروموزومی جنین‌های شبیه سازی شده، بایستی سیکل سلولی سلول‌های دهنده با میزان بالای MPF تخمک متافاز II هماهنگی و همخوانی داشته باشد. به همین دلیل تنها سلول‌های دهنده‌ای کهDNA دیپلوئید داشته و در فاز G1 و یا G0 هستند برای این کار مناسب‌اند (22،34،47،68،78). 4- روش خارج‌سازی هسته خارج سازی دقیق تمام محتویات هسته در روند شبیه سازی، کاری وقت گیر و خسته کننده و در عین حال بسیار حساس و کلیدی است. انتخاب روشی سریع، ساده، کارامد و با حداقل آسیب وارده به تخمک سبب افزایش مشخص راندمان شبیه سازی خواهد شد. تاکنون از روش‌های مختلفی به منظور خارج سازی محتویات کروموزومی تخمک استفاده شده که مرسوم‌ترین آنها عبارتند از: 1-4- خارج سازی هسته به روش فیزیکی: در این روش محل استقرار صفحه‌ متافازی و کروموزومها از روی موقعیت جسم قطبی تخمین زده شده لیکن در اغلب موارد (بیش از 50%) Pb از محل اولیه‌خود حرکت می‌نماید و معمولاً نزدیک به صفحه‌متافازی قرار ندارد. در این روش با وارد کردن سر سوزن به داخل سیتوپلاسم، pb و حجمی از سیتوپلاسم (30-10%، ترجیحاً 10%) خارج می‌گردد؛ لیکن در این روش هیچ تضمین قطعی برای خارج‌سازی واقعی کروموزومها وجود ندارد (35،42). از طرف دیگر خارج سازی حجم بالای سیتوپلاسم سبب کاهش قابلیت برنامه ریزی مجدد اپی ژنتیکی هسته سلول دهنده توسط تخمک خواهد شد (35،44،68). در این روش به منظور افزایش اطمینان از خارج سازی صفحه متافازی از رنگ هوخس استفاده و پس از مجاورت تخمک با UV (کمتر از 5 ثانیه) و مشخص شدن جایگاه هسته، محتویات ژنتیکی خارج می‌شود. 2-4- خارج سازی هسته به روش شیمیایی: در این روش پس از مجاورت تخمک با ترکیبات شیمیایی مختلف، روند سایتوکاینز و کاریوکاینز سلول دچار تغییر می‌گردد. در گذشته بدین منظور از Cyclohexamide و Etoposide (مهار کننده‌topoisomerase II) استفاده می گردید. بعدها با پیشرفت‌های حاصله مشخص گردید که تخمک‌هایی که با Cyclohexamide و Etoposide و یا ترکیبی از آنها فعال می‌شوند در انتهای روند خارج سازی هسته فاقد آنزیمMPF kinase فعال هستند و درصد تسهیم و تولید بلاستوسیت در آنها به طور معنی‌دار کمتر از سایر روشها است. بنابراین Democolcine (DEM) و Nocodazole (NOC)به عنوان جایگزین مناسبی برای دو داروی فوق مطرح گردید. DEM با اتصال به دایمر توبولین از پلیمریزه شدن میکروتوبولها جلوگیری و دانسیته‌آنها را کاهش داده و همچنین سبب بیرون زدگی توده کاملاً متراکم کروماتین از سطح غشاء سیتوپلاسمی تخمک می‌گردد. استفاده از این ترکیب سبب تحریک روند تکاملی تقسیمات جنینی و افزایش درصد بلاستوسیت می‌گردد. این ترکیب معمولاً همراه با اتانول استفاده گردیده و کاربرد وسیعی در شبیه سازی موش، بز، خرگوش و خوک دارد (44،54،64). NOC نیز دارای تاثیری مشابه DEM بوده با این تفاوت که درصد خارج سازی موثر تمامی محتویات ژنومی با استفاده از این ترکیب در مقایسه با DEM پایین‌تر می‌باشد. اخیراً مشخص شده استفاده از DEM و NOC سبب بیرون زدگی کامل ولی موقت محتویات کروموزومی تخمک گردیده و در صورت عدم خارج سازی هسته به صورت فیزیکی، توده کروموزومی مجدداً جذب سیتوپلاسم تخمک می‌گردد (79). لذا به نظر می‌رسد خارج سازی هسته به روش شیمیایی به تنهایی نمی‌تواند اطمینان کافی از بدون هسته شدن تخمک را فراهم نماید و تنها سبب سهولت در خارج سازی محتویات کروموزومی تخمک می‌گردد. 3-4- خارج سازی هسته به کمک سانترفیوژ: برخی از محققین تمهیداتی نظیر سانتریفیوژ تخمک قبل از خارج سازی هسته را به کار برده و گزارش نموده‌اند سانتریفیوژ تخمک بدون هیچ تاثیر مضر روی تخمک و جنین حاصله، سبب کاهش زاویه استقرار جسم قطبی (pb) نسبت به صفحه متافازی و افزایش درصد خارج سازی موفق هسته خواهد شد (44،77،80). Hua و همکاران با مقایسه سرعت‌های مختلف سانتریفیوژ تخمک‌های گاو (RPM 3000، 2000 و 1000) به مدت 20 دقیقه و بررسی تاثیر آن بر روی درصد خارج سازی موفق هسته، درصد جنین‌های 2 سلولی 16-8 سلولی، درصد بلاستوسیست و نیز تعداد بلاستومرهای روز 8، مشخص نمودند که سانتریفیوژ تخمک در دورهای 2000 و 3000 نسبت به دور 1000 و گروه کنترل سبب افزایش معنی‌دار درصد خارج سازی موفق هسته خواهد شد. این محققین زاویه نسبی استقرار جسم قطبی نسبت به صفحه متافازی را با کمک رنگ آمیزی هوخس، به سه گروه زاویه کوچک (کمتر از 20 درجه)، متوسط (30-20 درجه) و بزرگ (180-30) تقسیم و گزارش نمودند پس از سانتریفیوژ با سرعت‌های بالا (2000 و 3000) زاویه مذکور در اغلب موارد (90-80%) 20 درجه و 30-20 درجه خواهد بود و این در حالی است که در سرعت 1000 زاویه استقرار تفاوت معنی‌داری با گروه کنترل نداشته و زوایای 180-20 درجه را نشان داده است (77). در مجموع بررسیها نشان داده است سانتریفیوژ تخمک قبل از انتقال هسته هیچ تاثیر مضری بر روی درصد لقاح و روند تکاملی جنین ندارد (43،77). خارج سازی هسته با استفاده از سوکروز 3%: سوکروز به واسطه ایجاد یک ظاهر نیمه شفاف و مات در دوک میتوزی تشخیص دوک تقسیم را زیر میکروسکوپ نوری بسیار راحت‌تر می‌نماید. استفاده از این ترکیب در موش کاربرد بسیار وسیعی یافته است؛ در حالی که در سایر گونه‌ها به دلیل ایجاد برآمدگی‌های متعدد، تشخیص صفحه متافازی مشکل‌تر خواهد بود (44). اخیراً روش‌های دیگری نیز به منظور خارج سازی هسته مطرح شده است؛ از جمله استفاده از میکروسکوپ POL-Scope (Cambridge Research & Instrumentation; Cri) به منظور مشاهده بهتر و دقیقتر دوک تقسیم،Clone Laser System XY به منظور ایجاد شکاف در لایه زونا پلوسیدا قبل ازخارج سازی هسته و استفاده از پالس‌های متعدد Laser به منظور خرد نمودن کامل کروموزوم (44). 5- فعال سازی جنین پس از انتقال هسته در حالت طبیعی بلافاصله پس از لقاح، مجموعه‌ای از وقایع زنجیره‌ای به وقوع می‌پیوندد که نتیجه آنها جلوگیری از پلی اسپرمی و به راه افتادن وقایع آبشاری است که منجر به فعال شدن ژن‌های رونوشت برداری مرتبط با روند تکاملی جنین می‌گردد. فعال شدن جنین روند پیچیده‌ای است که خود شامل مکانیسم‌های متعددی می‌باشد. مهمترین مکانیسم مرتبط با فعال سازی جنین سیگنالینگ کلسیم است. به دنبال لقاح یا وارد نمودن سلول سوماتیک به داخل اووپلاسم، کلسیم به واسطه گیرنده 5- 4-1 تری فسفات از منابع داخل سلولی (عمدتاً شبکه اندوپلاسمی) آزاد و موجی ناگهانی از کلسیم در اووپلاسم شکل می‌گیرد. شکل گیری اول این موج از محل وارد شدن سلول سوماتیک است و سپس این موج در سرتاسر جنین پخش می‌گردد. در اسپرم عاملی به نام پروتئین القاء کننده آبشار کلسیم؛ (COIP) وجود دارد که این پروتئین مسئول فعال سازی تخمک است و کاندیدای اصلی این پروتئین، اعضای خانواده فسفولیپاز C؛ (PLC) می‌باشند. در روند شبیه سازی بسیاری از اعضای این خانواده، غیر فعال هستند و قادر به راه اندازی آبشار کلسیم نمی‌باشند؛ لیکن در صورت تزریقmRNA اعضاﺀ این خانواده به ویژه -Zeta PLC، در زمان انتقال هسته به داخل تخمک، روندی مشابه در جنین به راه می‌افتد. بنابراین در روند فعال سازی جنین شبیه سازی شده تحریک تولید COIP و PLC ضروری به نظر می‌رسد. از طرف دیگر منبع و نحوه آزادسازی کلسیم و الگوی چگونگی شکل گیری موج کلسیم تاثیر به سزایی در نحوه بیان ژنها به خصوص ژن‌های مرتبط با روند تکاملی جنین دارد؛ چرا که شکل گیری موج ضعیف کلسیم داخل سلولی بیان حداقل 20% از ژن‌های مسئول روند تکاملی جنین را کاهش می‌دهد و به دنبال کاهش بیان ژن و کاهش mRNA مربوطه، جنین از قابلیت مناسبی در طی نمودن و اتمام روند تکاملی خود برخوردار نخواهد بود. شکل گیری موج بسیار قوی کلسیم نیز می‌تواند تا حدودی الگوی بیان ژنها و رشد بعدی جنین را تحت تاثیر قرار دهد بطوریکه که مشخص شده موج قوی کلسیم می‌تواند سبب تنظیم عملکرد اعضاﺀ پروتئینی خانواده Bcl-2 و افزایش بیان ژن‌های مرتبط با روند آپپتوزیس در این بلاستومرهای شبیه سازی شده گردد؛ لیکن اثر مضر آن بسیار کمتر از موج ضعیف است. بنابراین توجه به نحوه فعال سازی جنین و استقرار الگوی مناسب و مختص گونه نه تنها می‌تواند سبب افزایش کیفیت و کمیت جنین‌های شبیه سازی شده گردد؛ بلکه روند تکاملی جنین را تا تولد نتاج زنده بهبود خواهد بخشید (82،81). بررسیها نشان داده است بلافاصله پس از فعال سازی جنین، فعالیتMPF شروع به کاهش می‌‌کند به طوریکه ظرف مدت یک ساعت به میزان 2/63% و در عرض دو ساعت به 8/34% می‌رسد و NEBD حاکثر هفت ساعت پس از فعال سازی جنین کامل می‌گردد (85-83). 1-5- روشهای فعال سازی جنین: انتخاب روشی مناسب جهت فعال سازی جنین تاثیر بسزایی در روند SCNR و افزایش کیفی و کمی جنین‌های شبیه سازی شده دارد. تاکنون از ترکیبات و روش‌های مختلف به منظور فعال سازی جنین استفاده شده و انتخاب روش فعال‌سازی مناسب بسته به گونه‌حیوانی و شرایط خاص مطالعه متفاوت است. اکثر محققین توصیه نموده‌اند به منظور فعال سازی جنین از ترکیبات مختلف به صورت توام استفاده گردد. روش‌های فعال سازی جنین شامل تحریکات شیمیایی، تحریکات الکتریکی و تحریکات مکانیکی می‌باشد. 1-1-5- اعمال تحریکات شیمیایی: درصد موفقیت در فعال سازی جنین با این روش بستگی به نوع و غلظت ترکیبات شیمیایی استفاده شده و نیز فاصله زمانی بین الحاق سلولها و شروع روند فعال سازی جنین دارد. محققین استفاده از این روش را به منظور فعال سازی جنین تمامی گونه‌ها (به ویژه دام‌های اهلی) توصیه نموده و نشان داده‌اند این روش نسبت به تحریکات الکتریکی سبب افزایش معنی‌دار درصد الحاق و تشکیل پرونوکلئوس می‌گردد. محرک‌های شیمیایی مرسوم به ترتیب اهمیت و کاربرد عبارتند از: 2-1-5- یونومایسین یا یونوفور کلسیم (A23187): 23187 یک ترکیب آنتی‌بیوتیکی است و از آنجاﺋیکه قادر به تشکیل کمپلکس با کاتیونهای دو ظرفیتی (مثل کلسیم) می‌باشد به نام یونوفور کلسیم نامیده می‌شود. این ترکیب مرسوم‌ترین ترکیب شیمیایی استفاده شده به منظور فعال سازی جنین است و موجب تسریع روند تخریب سایکلین B، آزاد سازی کلسیم از ذخایر درون سلولی، تسریع ورود کلسیم به داخل جنین از منابع خارج سلولی، کاهش فعالیتMAPK وMPF و از سرگیری تقسیمات میوز می‌گردد (15،32،71). در تخمک‌های جوان، استفاده از یونوفور به تنهایی به منظور فعال سازی جنین توصیه نمی‌گردد؛ چرا که در این تخمکها به دنبال استفاده از این ترکیب، فعالیت MAPKتغییری نمی‌یابد و تنها کاهش موقت در فعالیتH1 کیناز مشاهده می‌گردد. در حالی که در تخمک‌های مسن فعالیت هر دو کیناز مشخصاً کاهش می‌یابد (71). علیرغم اینکه یونومایسین نسبت به یونوفور کلیسم از قابلیت بیشتری در جابجایی و انتقال کلسیم برخوردار است، لیکن به دلیل تکرارپذیر نبودن موج کلسیم ایجاد شده توسط یونومایسین و ایجاد موج کلسیم از منابع داخل سلولی و نیز عدم وجود تفاوت معنی‌دار در افزایش ناگهانی و سریع کلسیم درون سلولی، کارایی این دو دارو معادل یکدیگر قلمداد می‌گردد (44،78،86،87). این ترکیبات در بسیاری از گونه‌ها به ویژه گاو (µM5 به مدت 4 دقیقه) (34،47،50)، خوک (µM5 به مدت20 دقیقه (88)، بز و گوسفند (µM5 به مدت 5-1 دقیقه) (89)، اسب (µM5 به مدت 4 دقیقه) (90)، الاغ (µM5 به مدت 5 دقیقه) (91) و سگ (µM10 به مدت 4 دقیقه) (92) کاربرد وسیعی یافته است. در اکثر موارد یونوفور کلسیم به همراه یک مهار کننده‌پروتئین کینازهای دفسفوریله کننده (6-دمتیل آمینوپورین (6-DMAP) و یا سیکلوهگزامید (CHX )) (84،88) و یا اتانول (22) استفاده می‌شود. البته تفاوت‌های گونه‌ای نیز در این بین وجود دارد؛ به طوریکه مشخص شده است در گاو و گوسفند استفاده از ترکیب توام یونومایسین و 6-DMAP علیرغم افزایش معنی‌دار درصد الحاق و تشکیل بلاستوسیست، موجب افزایش احتمال وقوع ناهنجاری کروموزومی در جنین می‌گردد. بنابراین در این گونه‌ها ترکیب یونوفور کلسیم با سیکلوهگزامید توصیه می‌گردد (87،20). 3-1-5- مهارکننده‌های پروتئین کینازهای دفسفوریله کننده پروتئینها: استفاده از این ترکیبات موجب تحریک فعال‌سازی تخمک و از سرگیری میوز می‌گردد. زمانی‌که پروتئوگلیکان‌های در برگیرنده غشاء هسته، دفسفوریله می‌شوند غشاء هسته، شکل ‌گرفته و زمانی که فسفوریله می‌گردند غشاء هسته گسسته می‌گردد. از طرف دیگر دفسفوریله شدن پروتئینها موجب فعال شدن MPF و توقف طولانی‌تر تقسیمات میوزی می‌گردد. لذا می‌توان با مهار نمودن این پروتئین کینازها (MPF کیناز، کینازهای میوزین، MLC کیناز و ...) موجبات فعال شدن تخمک و از سرگیری مجدد تقسیم میوز را فراهم نمود. از جمله این مهارکننده‌ها می‌توان به 6- دمتیل آمینو پورین (6DMAP) و سیکلوهگزامید اشاره نمود. 6-DMAP مهار کننده‌ وسیع‌الطیف سرین پروتئاز است که با مهار روند فسفوریله کردن پروتئین و جلوگیری از دفسفوریله شدن MPF سبب غیرفعال شدن MPFو عبور سلول از مرحله ایست میوزی می‌گردد. در بسیاری از گونه‌ها 6-DMAP از خروج دومین جسم قطبی ممانعت و بدین ترتیب به دنبال القای افزایش کلسیم درون سلولی از آن می‌توان در فعال سازی تخمک بعد از انتقال هسته استفاده نمود (32،35،71،87). از این ترکیبات می‌توان به منظور فعال نمون تخمک‌های جوان استفاده نمود. تخمک‌های جوان با اینکه کیفیت بسیار خوبی دارند؛ لیکن به‌دلیل فعالیت بالا و مستمر MPF به سختی فعال می‌شوند. در نتیجه می‌توان به منظور فعال سازی آنها، از ترکیب توام یونوماسیون و 6-DMAP استفاده نمود (10،32). سیکلوهگزامید نیز مهارکننده قوی پروتئین کینازها است. در تمامی گونه‌ها (به جز گاو و گوسفند) مقایسه CHX و 6-DMAP هیچ تفاوت معنی‌داری را در درصد تولید بلاستوسیست، تعداد کلی بلاستومرها و میزان وقوع ناهنجاری‌های کروموزومی در جنین‌های حاصله نشان نمی‌دهد (10،44،93). 4-1-5- اتانول: این ترکیب سبب تحریک ساخت mRNA اینوزیتول 1، 4، 5 – تری فسفات ، افزایش ورود کلسیم از منابع خارج سلولی، آزادسازی کلسیم از منابع داخل سلولی، تسریع روند تشکیل پرونوکلئوس و فعال‌سازی موثر جنین (به ویژه در موش، گاو و خوک) می‌گردد. غلظت مرسوم این ترکیب 8-7% است و معمولاً همراه با مهار کننده‌های پروتئین کینازهای دفسفوریله کننده استفاده می‌گردد (44،71،81،94). Gaynor و همکاران با مقایسه‌اتانول و یونومایسین گزارش نموده‌اند هیچ تفاوت معنی‌داری در درصد الحاق و تسهیم جنین‌های شبیه‌سازی شده و فعال شده با استفاده از این دو ترکیب وجود ندارد. این محققان با مشاهده عدم تفاوت معنی‌دار در درصد تشکیل مورولا و تولید بلاستوسیست در دو گروه، ترکیبات فوق را دارای پتانسیل کافی و مشابه در روند شبیه سازی عنوان نموده‌اند (95). Chen و همکاران با بررسی و مقایسه تاثیر دو فعال کننده اتانول و یونومایسین بر قابلیت تکاملی جنین‌های میمون گزارش نموده‌اند، علیرغم عدم وجود تفاوت معنی‌دار در درصد تشکیل پرونوکلئوس‌های نر و ماده، لیکن درصد جنین‌های 2 سلولی (درصد تسهیم) در گروهی که از اتانول به منظور فعال سازی جنین استفاده شده بود، به طور معنی‌دار بالاتر از گروه یونومایسین بود. البته در این مطالعه تفاوت معنی‌دار در درصد جنین‌های 4 و 8 سلولی بین دو گروه گزارش نگردید (61). 5-1-5- کلرید استرونتیوم SrCl2 : استرونتیوم یک کاتیون دو ظرفیتی (Sr2 ) بوده که قادر به آزاد‌سازی متناوب و تدریجی کلسیم از ذخایر درون سلولی به ویژه شبکه‌سارکوپلاسمیک (71،95) و تسریع ورود کلسیم از منابع خارج سلولی بداخل سلول می‌باشد (95). بررسی نوسانات کلسیم درون سلولی نشان داده است الگوی نوسانات ایجاد شده توسط این ترکیب بسیار مشابه نوسانات ایجاد شده به دنبال نفود طبیعی اسپرم است. به نظر می‌رسد این ترکیب در غیاب کلسیم خارج سلولی مؤثرتر عمل نماید. استفاده از این ترکیب در موش و همستر کاربرد وسیعی در فعال‌سازی جنین تجدید ساختار داده شده داشته و معمولاً همراه با سایتوشالازین B استفاده می‌گردد (15،44،80،94،96،97،98). بررسیها نشان داده است در گاو استفاده توام این ترکیب با اتانول سبب فعال سازی پارتنوژنیک تخمک می‌گردد؛ در حالی که همراه با یونومایسین می‌تواند سبب فعال سازی جنین‌های تجدید ساختار داده شده و رسیدن به مرحله بلاستوسیست گردد (44،80،84،99). 6-1-5-Phorbol ester : این ترکیب سبب فعال سازی پروتئین کینازهای وابسته به کلسیم و فسفولیپید، ایجاد موج کلسیم داخل سلولی و ترغیب تشکیل پرونوکلئوس می‌گردد. این ترکیب در فعال سازی جنین‌های شبیه سازی شده موش کاربرد گسترده‌ای داشته لیکن به دلیل پائین‌تر بودن درصد فعال سازی موثر جنین‌های موش با استفاده از این ترکیب در مقایسه با ترکیبات کاربردی‌تر، استفاده از آن در سایر پستانداران توصیه نمی‌گردد (80). 7-1-5- Thimerosal: یک ترکیب اکسیده کننده گروه سولفیدریل است و سبب افزایش ممتد و پیوسته کلسیم داخل سلولی می‌گردد. استفاده از این ترکیب در گاو کاربرد وسیع تری دارد؛ لیکن به دلیل کوتاه تر بودن مدت زمان موج کلسیم و حداکثر غلظت کلسیمی درون تخمک، کاربرد آن محدودتر از سایر ترکیبات است (80،100). 8-1-5- اعمال تحریکات الکتریکی: استفاده از تحریکات الکتریکی جایگزین مناسب تحریکات شیمیایی و مرسوم‌ترین روش فعال سازی جنین در تمامی گونه‌های حیوانی به ویژه خوک و گوسفند است. موفقیت این روش وابسته به اندازه و ابعاد منافذ ایجاد شده در غشاء سلول به دنبال اعمال تحریکات الکتریکی و قدرت یونی محیط کشت می‌باشد. مدت زمان اصلاح منافذ ایجاد شده و ترمیم یکپارچگی غشاء به درجه حرارت محیط فعال سازی جنین، سیالیت لیپیدها و جابجایی پروتئین‌های غشاﺀ سلولی بستگی دارد. قدرت و مدت زمان اولین موج ایجاد شده به دنبال اعمال اولین تحریک الکتریکی اساساً وابسته به غلظت یون کلسیم خارج سلولی است. به دنبال اعمال پالس‌های الکتریکی بعدی، ساخت اینوزیتول‌تری فسفات در سلول به شدت تقویت شده و بر قدرت و طول امواج کلسیم درون سلول افزوده می‌شود (44،101). متعاقب این تحریکات تغییراتی در الگوی استقرار میتوکندری‌های درون اووپلاسم ایجاد می‌گردد. بدین صورت که ابتدا میتوکندریها در اطراف هسته و نواحی جداری اووپلاسم تجمع یافته و تشکیل دستجات متعدد با اندازه‌های مختلف را می‌دهند. سپس چندین مرکز سازماندهی شده متشکل از میکروتوبولها؛ (MTOC) در اووپلاسم و معمولاً در یک سمت دوک تقسیم شکل می‌گیرد و در نهایت یک یا دو پرونوکلئوس ماده تشکیل می‌شود. شکل گیری این پرونوکلئوسها اساساً مرتبط با میتوکندریها است؛ به طوریکه ارتباط ساختارهای شبه پرونوکلئوس و میتوکندریها در 42% جنین‌های تجدید ساختار شده دیده می‌شود (101). بررسیها نشان داده است درصد فعال سازی جنین با استفاده از تحریکات الکتریکی به قدرت میدان الکتریکی و مدت زمان اعمال پالس بستگی دارد (44،55،71،102). برخی محققین تاثیر قدرت پالس جریان مستقیم (DC) بر بازده شبیه سازی را نسبت به تأثیر تعداد دفعات پالس و طول مدت پالس بالاتر دانسته‌اند (44،103). این در حالی است که De souse تعداد دفعات پالس را موثرتر می‌داند و گزارش نموده است استفاده از پالس‌های متعدد با قدرت کمتر نسبت به اعمال یک پالس با قدرت بیشتر سبب افزایش معنی‌دار درصد تولید بلاستوسیست می‌گردد (102). Daniel، با بررسی و مقایسه تاثیر قدرت میدان الکتریکی (kv/cm5/1-1، 5/2-2، 3 و بالاتر) بر درصد الحاق سلول‌های کومولوس و فیبروبلاست با تخمک، بهترین ولتاژ را برای این سلولها، kv/cm5/2-2 گزارش نموده است. در این مطالعه در تمامی ولتاژها الحاق سلول‌های کومولوس با تخمک به طور معنی‌دار بیشتر از سلول‌های فیبروبلاست گزارش شده است. علل درصد الحاق کمتر سلول‌های فیبروبلاست نسبت به کومولوس را ابعاد کوچکتر این سلولها، ویژگیها و خصوصیات خاص این سلول از جمله وجود منافذ کمتر با قطر کوچکتر در غشاء هسته، ایجاد گرما و جریان آهسته یونی به دنبال اعمال پالس در این سلولها و نیز قرابت بسیار کمتر غشاء سلول‌های فیبروبلاست با غشاء تخمک در مقایسه سلول‌های کومولوس عنوان نموده‌اند (56). معمولا به دنبال اعمال پالس، استفاده از ترکیبات شیمیایی جهت فعال نمودن جنین‌های تجدید ساختار داده شده ضروری به نظر رسیده و سبب بهبود معنی‌دار درصد تولید بلاستوسیست می‌گردد. بررسی و مقایسه تاثیر توام thimerosal با 6-DMAP وCHX پس از تحریک الکتریکی روی قابلیت تکاملی جنین و میزان وقوع آپپتوزیس نشان می‌دهد که استفاده از ترکیبات شیمیایی فوق پس از اعمال پالس سبب افزایش معنی‌دار تعداد بلاستومرها و در عین حال افزایش وقوع آپپتوزیس در جنین‌های حاصله می‌گردد. همچنین مقایسه زمان‌های مختلف مواجهه جنین با این ترکیبات شیمیایی (قبل از اعمال پالس الکتریکی، بلافاصله پس از اعمال پالس و مواجهه پس از وقفه زمانی چند ساعته) نشان داده است ایجاد وقفه زمانی سبب مواجهه بیشتر و طولانی‌تر هسته سلول منتقل شده با سطح بالای فعالیت MPF درون سیتوپلاسم تخمک گردیده که این سبب افزایش معنی‌دار احتمال SCNR و تغییر در الگوی رونوشت برداری ژن‌های مرتبط با روند تکاملی جنین (تولید بلاستوسیست) از جمله زیر واحد α1 آنزیم Na/K-ATPase ،E-cadherin،Zonula occludens protein-1(ZO-1)، desmocollin II (Dc II)، plakophilin (Plako)، ) (IF) Interferon و glucose transporter1,3,4 می‌گردد. نتیجه این تغییرات افزایش کیفی و کمی تولید بلاستوسیست شبیه سازی شده است (92،104،105،106). 9-1-5- اعمال تحریکات مکانیکی: یک روش فعال سازی قدیمی است و امروزه کاربرد چندانی به منظور فعال سازی جنین ندارد. از جمله تحریکات مکانیکی می‌توان به مواجهه تخمک با درجه حرارت اتاق قبل از شروع NT اشاره نمود (81). 6- تغییرات اپی ژنتیک پس از بررسی تغییرات اپی ژنتیکی صورت گرفته در روند تولید جنین‌های (بلاستوسیست) شبیه سازی شده و مقایسه آن با تحولات صورت گرفته در هسته سلول اسپرم و تخمک پس از لقاح طبیعی، متوجه تشابه بسیار زیاد این تغییرات با یکدیگر خواهیم شد. از جمله مهمترین تغییرات اپی ژنتیکی می‌توان به الگوی متیلاسیون DNA و تغییرات ایجاد شده در پروتئین هیستون (متیلاسیون، استیلاسیون، داستیلاسیون، فسفوریلاسیون، یوبیکویتیناسیون و...) و نقش microRNAs در ژنوم سلول دهنده، اشاره نمود. به دنبال لقاح و یا ورود هسته سلول سوماتیک به داخل اووپلاسم، گروه متیل باز آلی سیتوزین در نوکلئوتید CpG برداشته شده و سیتوزین غیرمتیله جایگزین 5- متیل سیتوزین می‌گردد. مجدداً پس از رسیدن جنین به مرحله 8 سلولی و مراحل بعدی، متیلاسیون مجدد ژنوم صورت گرفته و مجدداً 5- متیل سیتوزین تشکیل می‌گردد. این الگوی متیله و دمتیله شدن ژنوم نقش بسیار مهمی در تعیین توانمندی جنین برای عبور از مرحله توقف سلولی دارد. تفاوت این الگو در لقاح و یا SCNT در میزان متیلاسیون ژنوم است. به طوریکه در لقاح طبیعی میزان متیله شدن هسته اسپرم و تخمک، قبل از لقاح بسیار بیشتر از متیل شدن هسته سلول سوماتیک پس از انتقال می‌باشد (107) و همین موضوع می‌تواند یکی از علل پایین بودن بازده تولید جنین شبیه سازی شده نسبت به لقاح طبیعی باشد. از طرف دیگر میزان متیلاسیون لیزین 4 هیستون 3 (H3K4 ) و نیز لیزین‌های 9 و 27 هیستون 3 (H3K9 ، H3K27 ) و همچنین استیله شدن آنها در روند SCNR بسیار تاثیرگذار بوده به طوریکه هایپومتیله شدن و یا دمتیله شدن سیتوزین نوکلئوتید CpG و لیزین پروتئین هیستون سبب افزایش مشخص و معنی‌دار ظرفیت تکاملی جنین و افزایش درصد تولید بلاستوسیست می گردد. استفاده از سلول‌هایی که اساساً دارای ژنوم هایپومتیله می‌باشند نیز سبب افزایش مشخص بازده SCNT خواهد شد (68،107،108). از طرفی مشخص شده است که استفاده از آلل‌های هایپومورفیک DNA- متیل ترانسفراز I ، بدلیل هایپومتیله بودن ژنوم سلول‌های سوماتیک (تمایز یافته)، سبب افزایش مشخص میزان تولید مورولا و بلاستوسیست شبیه سازی شده می‌گردد (68). از طرف دیگر افزایش میزان استیله شدن هیستون به خصوص هیستون 3 در انجام موفقیت آمیز روند SCNR و درصد تولید بلاستوسیست‌های شبیه سازی شده بسیار تاثیرگذار است. به طوریکه مشخص شده است اضافه شدن گروه استیل به لیزین 9 هیستون 3 (AcH3K9) و نیز به لیزین‌های 9 و 14 هیستون 3 به طور همزمان (AcH3K9-K14) و نیز به لیزین 5 هیستون 3 (AcH3K5) سبب تحریک روند تکاملی جنین و رسیدن جنین به مرحله بلاستوسیست می‌گردد. در حالیکه داستیله شدن و یا هایپواستیله شدن آنها منجر به توقف روند تکاملی تقسیمات جنین در مرحله چند سلولی می‌گردد (108). میزان استیله و متیله شدن بیشتر از آن که تحت تاثیر نوع سلول، سیکل سلولی و تعداد پاساژهای سلول دهنده باشد، به کیفیت اووپلاسم و یکپارچگی آن بستگی دارد (16،106،107). تغییرات اپی ژنتیکی مذکور (الگوی استیله شدن هیستون و متیله شدن هسته سلول دهنده) علاوه بر وراثت پذیر بودنشان، به دلیل نقش برجسته آنها در تنظیم فعالیت ژن‌های سلول‌های یوکاریوتیک از اهمیت به سزایی در کسب موفقیت در SCNR برخوردار هستند. به طوریکه محققین میزان متیله شدن و یا استیله شدن هسته سلول سوماتیک را به عنوان شاخص‌ اپی ژنتیکی روند شبیه سازی معرفی نموده و علل اصلی پایین بودن بازده SCNR، SCNT و وقوع بالای ناهنجاری‌های کروموزومی را در متعادل نبودن تغییرات اپی ژنتیکی سلول دهنده و عدم برنامه‌ریزی اپی‌ژنتیکی مناسب می‌دانند. به عبارتی پس از انتقال سلول سوماتیک، شاخص‌های اپی ژنتیکی سلول دهنده به عنوان یک سلول کاملاً تمایز یافته باید حذف و الگوی جدیدی از شاخص‌های اپی ژنتیک در جنین تجدید ساختار داده شده، با ویژگی پرتوانی، شکل گیرد (44،68). بنابراین شناخت دقیق این شاخصها و درک صحیح روش‌های کنترلی و تنظیمی آنها می‌تواند معیار انتخابی بسیار دقیقی جهت انتخاب سلول سوماتیک مناسب جهت انتقال و هدایت این سلول به سمت سازماندهی مجدد و تولید جنینی با کیفیت بالا باشد (44،49،68،108). با توجه به اهمیت و نقش ترانس کریپتها و پروتئین‌های موجود در سیتوپلاسم تخمک مرحله MII در حمایت از تقسیمات جنینی تا مرحله فعال شدن ژنوم جنینی (Embryionic genomic activation; EGA) و نیز قابلیت سیتوپلاسم تخمک مرحله MII در القای برنامه ریزی مجدد هسته سلول سوماتیک (reprogramming) و همزمانی EGA و کاهش مشخص ترانس کریپت‌های با منشا مادری، reprogramming هسته سلول سوماتیک مبتنی بر تغییرات اپی ژنتیک می بایست همزمان با شروع EGA تکمیل شده باشد. معهذا از آنجائیکه الگوی تغییرات اپی‌ژنتیک در طی روند تکاملی جنین در مراحل قبل از لانه گزینی از وضعیت دینامیکی برخوردار بوده، اتخاذ روش‌های درمانی در القای برنامه ریزی مجدد هسته می‌بایست از الگوی این تغییرات در جنین‌های طبیعی تبعیت نماید. 1-6- ایجاد تغییرات اپی‌ژنتیک در جهت حمایت از شاخص‌های اپی ژنتیک: ترکیبات مختلفی به منظور تغییر در الگوی اپی ژنتیک سلول‌های سوماتیک در جهت حمایت از تغییرات مناسب اپی‌‍‍‍ژنتیک مطرح و مورد استفاده قرار گرفته‌اند. 1-1-6- تریکوستاتین A؛ (TSA) : TSA یک عامل تغییر دهنده کروماتین است که سبب هایپراستیله شدن هیستون و دمتیله شدن DNA می‌گردد. به دنبال تغییرات ساختاری ایجاد شده در کروماتین متعاقب استفاده از این ترکیب، وقایعی نظیر بهبود و تسریع روند SCNR، تقویت بیان ترانسژن، افزایش بیان ژن‌های آندوژن مرتبط با رونوشت برداری و نیز ژن‌های جنینی به ویژه در مرحله قبل از مرحله لانه گزینی، رخ خواهد داد. بررسیها نشان داده است مجاورت سلول‌های دهنده با این ترکیب قبل از انتقال نه تنها سبب تسریع و تشدید روند باز شدن کروماتین، افزایش حجم هسته جنین‌های شبیه سازی شده ومتعاقب آن افزایش معنی‌دار میزان استیله شدن لیزین‌های27، 4، 9 و 14 هیستون 3 (H3K14, H3K27, H3K4, H3K9 ) و لیزین 5 و 16هیستون 4 (H4K16, H4K5) می‌گردد، بلکه موجب مهار آنزیم‌های داستیله کننده هیستون (HDACs) در سلول‌های سوماتیک، افزایش بیان ژن‌های مرتبط با روند تکاملی جنین، کاهش بیان ژن‌های مرتبط با متیلاسیون DNA، افزایش بیان ژن‌هایOCT4, Nanog, SOX2 و cMYC در بلاستوسیست، افزایش میزان تولید بلاستوسیست، افزایش مشخص تعداد بلاستومرهای جنین‌های شبیه سازی شده و افزایش درصد آبستنی و زایمان موفق خواهد شد. آنزیم‌های HDACs نقش بسیار مهمی در تغییر ساختار کروماتین، کنترل مدت زمان بقای سلول، کنترل روند سیکل سلولی و روند شکل گیری تومور دارند (44،68،108،109،110،111،112،113). بررسی Shahper و همکاران با اشاره به نقش این آنزیمها در اصلاح و ترمیم نواحی آسیب دیده زنجیره دوتایی DNA، نشان داده است که جنین‌های موش فاقد آنزیم HDAC1 تا قبل از روز 5/10 آبستنی به علت نقایص تکاملی شدید و تاخیر در رشد سقط می‌گردند. همچنین جنین‌های موش‌های آبستن فاقد HDAC3 نیز به علت عدم پیشرفت سیکل سلولی از فاز S و آسیب‌های شدید DNA تا قبل از روز 5/9 آبستنی سقط می‌شوند (114). به نظر استفاده از TSA به عنوان یک ترکیب مهارکننده HDACs به واسطه تنظیم فعالیت آنزیم‌های دخیل در تغییرات اپی ژنتیکی سلول، موجب حذف شاخص‌های اپی ژنتیکی سلول‌های سوماتیک و تغییر آنها به شاخص‌های اپی ژنتیکی موثر در روند تکاملی جنین می‌گردد و بدین ترتیب سلول سوماتیک قابلیت سازماندهی مجدد و برگشت به وضعیت پرتوانی خود را به دست می‌آورد و قادر خواهد بود جنین شبیه سازی شده‌ای با تمامی سلولها و ارگان‌های طبیعی تولید نماید. دستکاری شاخص‌های اپی ژنتیکی رمز موفقیت در SCNR،SCNT و تولید سلول‌های iPS است (92). غلظت معمول TSA در نشخوار کنندگان اهلی M25/1 می‌باشد. غلظت‌های بالاتر این ترکیب موجب آسیب کروموزومی (شکسته شدن کروماتین)، افزایش توقف سلولی، مهار روند تکاملی جنین و افزایش احتمال وقوع آپوپتوزیس و غلظت‌های پایین‌تر سبب تغییر ظاهر مورفولوژیک سلول‌های سوماتیک خواهد شد (15). 2-1-6- پنج آزا داکسی سیتیدین؛ 5-aza-dC : این ترکیب مهارکننده DNA متیل ترانسفراز (DNAmt) است و مجاورت سلول‌های سوماتیک قبل از انتقال، با این ترکیب موجب دمتیله شدن و یا هایپومتیله شدن DNA می‌گردد. Campbell و همکاران معتقدند استفاده از این ترکیب سبب بهبود بازده SCNT می‌گردد؛ در حالی که سایر محققین کاهش مشخص درصد تولید بلاستوسیست‌های شبیه سازی شده را با استفاده از این ترکیب گزارش نموده‌اند (15،44،49). استفاده طولانی مدت از این ترکیب حتی در دوزهای پایین سبب هایپومتیله شدن شدید و کاهش بیان ژن‌های اصلی روند تکاملی جنین می‌گردد. غلظت معمول این ترکیب در نشخوارکنندگان µM 5-1 است. غلظت‌های بالاتر آن سایتوتوکسیک می‌باشد (15). 3-1-6- افزودن عصاره سیتوپلاسمی سلولهای سوماتیک: افزودن عصاره برخی سلول‌های سوماتیک به محیط کشت سلول سوماتیک و جنین، به ویژه در مورد سلول‌هایی که روند تقسیمات میتوزی آنها متوقف گردیده می‌تواند منجر به تسریعPCC و بهبودSCNR گردد (49،68). 4-1-6- افزودن محتویات سیتوپلاسمی تخمک: اضافه نمودن محتویات سیتوپلاسمی تخمک دوزیستان به محیط کشت جنین شبیه سازی شده، منجر به فعال و یا غیر فعال شدن برخی ژن‌های سلول‌های سوماتیک پستانداران و سازماندهی و برنامه ریزی مجدد هسته این سلولها پس از انتقال می‌گردد. Campbell و همکاران نشان داده‌اند افزودن عصاره این تخمکها منجر به بیان ژن OCT4 (فاکتور رونوشت برداری سلول‌های پرتوان مانند ESC) و افزایش mRNA مربوط به آن در جنین، تسریع روند SCNR، تجزیه سریعتر هستکها، تغییر لامینای هسته، تغییر در الگو و میزان استیلاسیون DNA و افزایش استیله شدن هیستون 3 و افزایش درصد تولید بلاستوسیست می‌گردد (44). همچنین افزودن عصاره تخم Xenopus Laevis سبب تغییر در الگوی رونوشت برداری ژنها و مهار سایکلین کیناز 2 شده و این تغییرات منجر به افزایش قابلیت SCNR و درصد بقای جنین‌های شبیه سازی شده می‌گردد (35). 5-1-6- MG132 و کافئین: افزودن این ترکیبات به محیط کشت جنین، بدون داشتن هرگونه تاثیر مضر بر روند تکاملی جنین، از فعال شدن خودبه‌خودی تقسیمات جنینی جلوگیری کرده و سبب افزایش کیفیت و کمیت بلاستوسیست و افزایش تولد نتاج زنده خواهد شد. کافئین یک مهار کننده غیراختصاصی فسفاتاز است و افزودن این ترکیب به محیط کشت جنین نه تنها سبب افزایش معنی‌دار درصد تسهیم و میزان MPF و MAPK اووپلاسم می‌گردد؛ بلکه از کاهش شدید این پروتئین کینازها پس از رسیدن تخمک به مرحله MII جلوگیری کرده و کاهش آنها را به تعویق می‌اندازد. MG132 نیز مهارکننده پروتئوزوم است و افزودن آن به محیط کشت سلول‌های دهنده هسته و تخمک سبب بهبود مشخص SCNR و جلوگیری از فعال شدن خود به خودی تخمک، تسریع روند تکاملی جنین، افزایش کیفیت و کمیت بلاستوسیست و تولد نتاج زنده خواهد شد (46،49،115،116). استفاده از این ترکیبات در روند شبیه‌سازی موش، خوک و میمون و رت به منظور افزایش کاراییSCNT توصیه می‌شود (49). 6-1-6- سدیم بوتیرات؛ (NaBu) : این ترکیب موجب مهار داستیله شدن هیستون می‌گردد و افزودن این ترکیب به محیط کشت سلول سوماتیک سبب بهبود روند SCNR و افزایش مشخص کیفیت و کمیت بلاستوسیست‌های شبیه سازی شده می‌شود (108،104). تمامی ترکیبات فوق با تغییر در الگوی تغییرات اپی ژنتیک سبب حذف شاخص‌های اپی ژنتیکی سلول سوماتیک و تغییر در الگوی بیان ژنها ‌گردیده به گونه‌ای که سلول تا حد امکان ویژگی همه توانی خود را باز یافته و بدین ترتیب قابلیت و توان SCNR در روند SCNT افزایش می‌یابد. 7- هتروپلاسمی میتوکندریایی یکی از علل پایین بودن درصد موفقیت و بازده SCNT، هتروپلاسمی میتوکندریایی است. برخلاف لقاح طبیعی که در آن DNA میتوکندریایی اساساً منشأ مادری داشته و میتوکندری‌های اسپرم کاملاً تخریب می‌شوند، در روند شبیه سازی ژن‌های میتوکندریایی سلول دهنده با همان حجم بسیار پایین سیتوپلاسم وارد اووپلاسم ‌شده، غشاء پلاسمایی میتوکندریها طی وقایع سیتوپلاسمی شکسته شده و DNA میتوکندریایی سلول دهنده با DNA میتوکندریایی تخمک مخلوط می‌گردد (116). در نتیجه جنین شبیه‌سازی شده دچار هتروپلاسمی میتوکندریایی می شود. از این رو حیوان شبیه‌سازی شده کاملاً از نظر ژنتیکی مشابه حیوان دهنده سلول سوماتیک نمی‌باشد. از آنجاﺋیکه میتوکندریها دارای نقش بسیار مهمی در تأمین انرژی سلول، سیگنالینگ، برنامه ریزی زمان آپپتوزیس سلول و کنترل روند تکاملی جنین و فتوس می‌باشند، به نظر می‌رسد هرگونه آشفتگی و ناهمگونی میتوکندریایی سبب کاهش عملکرد میتوکندریها، متابولیسم ناقص آنها و کاهش مشخص بازده SCNT می‌گردد (117). البته این بدان معنا نیست که هتروپلاسمی میتوکندریایی علت اصلی پایین بودن بازده شبیه سازی است، چرا که در گربه وحشی و اهلی آفریقایی که به طور طبیعی دارای هتروپلاسمی میتوکندریها می‌باشند، رشد و تولیدمثل طبیعی و باروری موفق دیده می‌شود (108). نتیجه گیری در مجموع انتظار می‌رود با ارتقاء دانش فنی و تئوری در تمامی ابعاد شبیه سازی از جمله به حداقل رساندن آسیب‌های فیزیکی به ساختار سایتواسکلتال تخمک در زمان خارج سازی هسته، به حداکثر رسانیدن همزمانی هسته سلول دهنده با سیتوپلاسم تخمک گیرنده، و نیز القای کمی و کیفی تغییرات اپی ژنتیک در جهت ایجاد شرایط همه توانی در هسته سلول دهنده از طریق حذف وضعیت اپی ژنتیک قبلی سلول سوماتیک و اعمال تغییرات اپی ژنتیک جدید و بهبود شرایط reprogramming، بتوان بازدهی روند شبیه سازی را در جهت تولید حیوانات با قابلیت حیاتی بالا و تولید مثل موثر به حداکثر رسانید. مع‌الوصف هر گونه انحراف از الگوی طبیعی بیان ژنها بواسطه کاربرد ترکیبات شیمیایی در جنین مرحله قبل از لانه گزینی، می تواند نتایج نامطلوبی را در مراحل تکاملی جنینی و حتی مراحل پس از تولد بدنبال داشته باشد. بدیهی است با ارتقا کیفی این فناوری، سایر علوم و فناوری‌های مرتبط از قبیل تولید حیوانات تراریخته و دسترسی به فرآورده‌های بیولوژیک حاصله، ابقای گونه‌های جانوری در معرض خطر انقراض و بعضاً امکان احیای گونه‌های جانوری منقرض شده و نهایتاً امکان انجام شبیه‌ سازی بین گونه‌ای با اهداف عدیده به‌ویژه در راستای شبیه سازی درمانی در انسان، به نحو شایسته‌ای متأثر خواهد شد. تشکر و قدردانی با تشکر از تمامی محققین عرصه زیست شناسی تکوینی و شبیه سازی به دلیل تلاشها و یافته‌های علمی ایشان و قدردانی از زحمات تیم شبیه سازی پژوهشکده فناوری جنین دام دانشگاه شهرکرد. 2 Background: The term “Cloning” has originated from “Klon”, a Greek word with the meaning of a small twig that can multiply by itself and turn to a generative tree. Cloning is an asexual reproduction in which a copy or multiple copies of an organism are generated by transferring the nucleus (DNA) of a somatic cell into an enucleated metaphase-II oocyte. Despite the benefits and potentially broad applications of this technology, its low efficiency, especially in the production of viable offspring, has implicated its application with serious challenges. In this article, we will review papers related to its emerging principles, with an emphasis on epigenetic modifications, which appear to govern the efficiency of cloning. Methods: The literature review was carried out by searching through knowledge-based data bases such as ScienceDirect, PubMed and Scopus on the internet. No time limit was considered for literature review of the relevant articles up to the time of submission. Results: Considering the large varieties of factors affecting cloning, improvements in cloning efficiency are dependent on the increment of theoretical knowledge and technical expertise of its procedures. This can be achieved by improving oocyte and cytoplasmic maturation, optimizing synchronization between the nucleus of the donor cell and cytoplasm of MII stage oocyte, minimizing the physical insults to the cytoskeleton of oocyte during enucleation and nuclear transfer, improving the cellular fusion and culture conditions of reconstructed oocytes and in particular and more importantly by employing effective methods to qualitatively alter the epigenetic status of the incoming nucleus to an embryonic or totipotent state, leading to the improvement of donor cell reprogramming. Considering the importance of inherited maternal transcripts and proteins in cytoplasm of fully matured oocytes in supporting the embryos up to the embryonic genomic activation (EGA) and the capability of MII stage cytoplasm in de-differentiating mammalian somatic cells and coincident of EGA with depletion of maternally originated transcripts, reprogramming of the somatic cell nuclei must be completed by the time that the embryonic genome is activated. Since the patterns of epigenetic modification are dynamic and not static during development, the optimum procedure to properly induce nuclear reprogramming should follow the pattern of epigenetic modifications in normal embryo development. Conclusion: Besides the all progresses in reproductive cloning using highly efficient methods, any deviation from the normal pattern of mRNA expression due to epigenetic changes induced by chemical interventions in early preimplantation embryo may persist throughout fetal development. The effects of these aberrations may manifest later in development. Nonetheless, understanding the kinetics of normal molecular events related to epigenetic modifications and identification of the specific factors present in the ooplasm, which are necessary for epigenetic reprogramming, will provide a better understanding of the underlying mechanisms and would improve cloning efficiency and other related technologies. 047 73 Banafsheh B Heidari بنفشه حیدری Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Sara S Borjian سارا برجیان Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Mahmood M Jeddi-Tehrani محمود جدی‌تهرانی Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Amir Hassan AH Zarnani امیرحسن زرنانی Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Mohammad Mehdi MM Akhondi محمدمهدی آخوندی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Abolfazl A Shirazi ابوالفضل شیرازی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran shiraziabbas@yahoo.com CloningEnucleationEpigenetic modificationNuclear reprogrammingReconstructed oocyte 451.pdf Campbell K, McWhir J, Ritchie B, Wilmut I. Produc-tion of live lambs following nuclear transfer of cul-tured embryonic disc cells. Theriogenology. 1995;43 (1):181.##Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Camp-bell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997;385(6619):810-3.##Beyhan Z, Iager AE, Cibelli JB. Interspecies nuclear transfer: implications for embryonic stem cell boilogy. Cell Stem Cell. 2007;1(5):502-12.##Mastromonaco GF, Favetta LA, Smith LC, Filion F, King WA. The influence of nuclear content on developmental competence of gaur x cattle hybrid in vitro fertilized and somatic cell nuclear transfer embryos. Biol Reprod. 2007;76(3):514-23.##Roh S, Yoon JT. Production of HanWoo (Bos taurus coreanae) fetuses following interbreed somatic cell nuclear transfer. J Vet Med Sci. 2001;63(9):945-8.##Li Y, Dai Y, Du W, Zhao C, Wang L, Wang H, et al. In vitro development of yak (Bos grunniens) embryos generated by interspecies nuclear transfer. Anim Reprod Sci. 2007;101(1-2):45-59.##Meirelles FV, Bordignon V, Watanabe Y, Watanabe M, Dayan A, Lôbo RB, et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 2001;158(1):351-6.##Loi P, Ptak G, Barboni B, Fulka J Jr, Cappai P, Clinton M. Genetic rescue of an endangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells. Nat Biotechnol. 2001;19(10):962-4.##Gómez MC, Pope CE, Giraldo A, Lyons LA, Harris RF, King AL, et al. Birth of African Wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning Stem Cells. 2004;6(3):247-58.##Jang G, Kim MK, Lee BC. Current status and applications of somatic cell nuclear transfer in dogs. Theriogenology. 2010;74(8):1311-20.##Oh HJ, Fibrianto YH, Kim MK, Jang G, Hossein MS, Kim HJ, et al. Effects of canine serum collected from dogs at different estrous cycle stages on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Zygote. 2005;13(3):227-32.##Bousquet D, Blondin P. Potential uses of cloning in breeding schemes: dairy cattle. Cloning Stem Cells. 2004;6(2):190-7.##Ng SC, Chen N, Yip WY, Liow SL, Tong GQ, Martelli B, et al. The first cell cycle after transfer of somatic cell nuclei in a non-human primate. Development. 2004;131(10):2475-84.##Cho J, Bhuiyan MM, Shin S, Park E, Jang G, Kang S, et al. Development potential of transgenic somatic cell nuclear transfer embryos according to various factors of donor cell. J Vet Med Sci. 2004;66 (12):1567-73.##Tian XC, Kubota C, Enright B, Yang X. Cloning animals by somatic cell nuclear transfer--biological factors. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:98.##Hodges CA, Stice SL. Generation of bovine transgenics using somatic cell nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:81.##Kim TM, Park TS, Shin SS, Han JY, Moon SY, Lim JM. An interclass nuclear transfer between fowl and mammal: in vitro development of chicken-to-cattle interclass embryos and the detection of chicken genetic complements. Fertil Steril. 2004;82 (4):957-9.##Verma PJ, Trounson AO. Nuclear Transfer Protocols, Cell Reprogramming and Transgenesis. Totowa: Humana Press; 2006. p. 169.##Booth PJ, Viuff D, Tan S, Holm P, Greve T, Callesen H. Numerical chromosome errors in day 7 somatic nuclear transfer bovine blastocysts. Biol Reprod. 2003;68(3):922-8.##Spemann H. Embryonic development and induction. New York: Yale University Press; 1938. p. 401.##Gao S, Chung YG, Williams JW, Riley J, Moley K, Latham KE. Somatic cell-like features of cloned mouse embryos prepared with cultured myoblast nuclei. Biol Reprod. 2003;69(1):48-56.##Kühholzer B, Tao T, Machaty Z, Hawley RJ, Greenstein JL, Day BN, et al. Production of transgenic porcine blastocysts by nuclear transfer. Mol Reprod Dev. 2000;56(2):145-8.##Kubota C, Yamakuchi H, Todoroki J, Mizoshita K, Tabara N, Barber M, et al. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(3):990-5.##Reggio BC, James AN, Green HL, Gavin WG, Behboodi E, Echelard Y, et al. Cloned transgenic offspring resulting from somatic cell nuclear transfer in the goat: oocytes derived from both follicle-stimulating hormone-stimulated and nonstimulated abattoir-derived ovaries. Biol Reprod. 2001;65(5):1528-33.##Koo DB, Kang YK, Choi YH, Park JS, Kim HN, Oh KB, et al. Aberrant allocations of inner cell mass and trophectoderm cells in bovine nuclear transfer blastocysts. Biol Reprod. 2002;67(2):487-92.##Hill JR, Winger QA, Long CR, Looney CR, Thompson JA, Westhusin ME. Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells. Biol Reprod. 2000;62(5):1135-40.##Mullins LJ, Wilmut I, Mullins JJ. Nuclear transfer in rodents. J Physiol. 2004;554(Pt 1):4-12.##Mello MR, Caetano HV, Marques MG, Padilha MS, Garcia JF, Milazzotto MP, et al. Production of a cloned calf from a fetal fibroblast cell line. Braz J Med Biol Res. 2003;36(11):1485-9.##Wells DN, Laible G, Tucker FC, Miller AL, Oliver JE, Xiang T, et al. Coordination between donor cell type and cell cycle stage improves nuclear cloning efficiency in cattle. Theriogenology. 2003;59(1):45-59.##Stice SL, Strelchenko NS, Keefer CL, Matthews L. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer. Biol Reprod. 1996;54(1):100-10.##Wells DN, Misica PM, Day TA, Tervit HR. Production of cloned lambs from an established embryonic cell line: a comparison between in vivo- and in vitro matured cytoplasts. Biol Reprod. 1997;57(2):385-93.##Reggio BC. Production of transgenic goats by somatic cell nuclear transfer [dissertation]. [Louisiana]: The Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College; 2002. 153 p.##Smith LC, Wilmut I. Influence of nuclear and cytoplasmic activity on the development in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation. Biol Reprod. 1989;40(5):1027-35.##Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science. 1998;280(5367):1256-8.##Heidari B, Shirazi A, Tajic P, Ahmadi E, Nazari H, Shams-Esfandabadi N, et al. Effect of donor cell age on development of ovine nuclear transfer embryos in vitro. Zygote. 2010;18(4):331-8.##McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature. 2000;405(6790):1066-9.##Zalokar M. Transplantation of nuclei into the polar plasm of Drosophila eggs. Dev Biol. 1973;32(1): 189-93.##Hosseini SM, Moulavi F, Foruzanfar M, Hajian M, Abedi P, Rezazade-Valojerdi M, et al. Effect of donor cell type and gender on the efficiency of in vitro sheep somatic cell cloning. Small Rumin Res. 2008;78(1-3):162-8.##Forsberg EJ, Strelchenko NS, Augenstein ML, Betthauser JM, Childs LA, Eilertsen KJ, et al. Production of cloned cattle from in vitro systems. Biol Reprod. 2002;67(1):327-33.##Willadsen SM. The viability of early cleavage stages containing half the normal number of blastomeres in the sheep. J Reprod Fertil. 1980;59(2):357-62.##Kato Y, Tani T, Sotomaru Y, Kurokawa K, Kato J, Doguchi H, et al. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science. 1998;282(5396): 2095-8.##Liu JL, Sung LY, Barber M, Yang X. Hypertonic medium treatment for localization of nuclear material in bovine metaphase II oocytes. Biol Reprod. 2002;66(5):1342-9.##Cheong HT, Ikeda K, Martinez Diaz MA, Katagiri S, Takahashi Y. Development of reconstituted pig embryos by nuclear transfer of cultured cumulus cells. Reprod Fertil Dev. 2000;12(1-2):15-20.##Campbell KH, Fisher P, Chen WC, Choi I, Kelly RD, Lee JH, et al. Somatic cell nuclear transfer: Past, present and future perspectives. Theriogenology. 2007;68 Suppl 1:S214-31.##Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 1998;394(6691):369-74.##Zhou Q, Jouneau A, Brochard V, Adenot P, Renard JP. Developmental potential of mouse embryos reconstructed from metaphase embryonic stem cell nuclei. Biol Reprod. 2001;65(2):412-9.##Wells DN, Misica PM, Tervit HR. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells. Biol Reprod. 1999;60(4):996-1005.##Keefer CL, Keyston R, Lazaris A, Bhatia B, Begin I, Bilodeau AS, et al. Production of cloned goats after nuclear transfer using adult somatic cells. Biol Reprod. 2002;66(1):199-203.##Mitalipov SM, Zhou Q, Byrne JA, Ji WZ, Norgren RB, Wolf DP. Reprogramming following somatic cell nuclear transfer in primates is dependent upon nuclear remodeling. Hum Reprod. 2007;22(8):2232-42.##Kato Y, Tani T, Tsunoda Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult, newborn and fetal cows. J Reprod Fertil. 2000;120 (2):231-7.##Kasinathan P, Knott JG, Wang Z, Jerry DJ, Robl JM. Production of calves from G1 fibroblasts. Nat Biotechnol. 2001;19(12):1176-8.##Ekholm SV, Reed SI. Regulation of G(1) cyclin-dependent kinases in the mammalian cell cycle. Curr Opin Cell Biol. 2000;12(6):676-84.##Nishitani H, Lygerou Z. Control of DNA replication licensing in a cell cycle. Genes Cells. 2002;7(6): 523-34.##Tomii R, Kurome M, Wako N, Ochiai T, Matsunari H, Kano K, et al. Production of cloned pigs by nuclear transfer of preadipocytes following cell cycle synchronization by differentiation induction. J Reprod Dev. 2009;55(2):121-7.##Campbell KH. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning. 1999;1(1):3-15.##Daniel SM, Raipuria P, Sarkhel BC. Efficiency of cloned embryo production using different types of cell donor and electric fusion strengths in goats. Small Rumin Res. 2008;77(1):45-50.##Gibbons J, Arat S, Rzucidlo J, Miyoshi K, Waltenburg R, Respess D, et al. Enhanced survivability of cloned calves derived from roscovitine-treated adult somatic cells. Biol Reprod. 2002;66(4):895-900.##Yang X, Cheng T, Sung LY, Gao S, Shen H, Yu H, et al. Reply to “On the cloning of animals from terminally differentiated cells”. Nat. Genet. 2007;39 (2):137-138.##Kasinathan P, Knott JG, Wang Z, Jerry DJ, Robl JM. Production of calves from G1 fibroblasts. Nat Biotechnol. 2001;19(12):1176-8.##Tatham BG, Dowsing AT, Trounson AO. Enucleation by centrifugation of in vitro-matured bovine oocytes for use in nuclear transfer. Biol Reprod. 1995;53(5):1088-94.##Markert CL, Petters RM. Manufactured hexaparental mice show that adults are derived from three embyronic cells. Science. 1978;202(4363):56-8.##Chen N, Liow SL, Yip WY, Tan LG, Tong GQ, Ng SC. Early development of reconstructed embryos after somatic cell nuclear transfer in a non-human primate. Theriogenology. 2006;66(5):1300-6.##Fluckiger AC, Marcy G, Marchand M, Négre D, Cosset FL, Mitalipov S, et al. Cell cycle features of primate embryonic stem cells. Stem Cells. 2006;24 (3):547-56.##Miranda Mdos S, Bressan FF, Zecchin KG, Vercesi AE, Mesquita LG, Merighe GK, et al. Serumstarved apoptotic fibroblasts reduce blastocyst production but enable development to term after SCNT in cattle. Cloning Stem Cells. 2009;11(4):565-73.##Takeuchi T, Ergün B, Huang TH, Rosenwaks Z, Palermo GD. A reliable technique of nuclear transplantation for immature mammalian oocytes. Hum Reprod. 1999;14(5):1312-7.##Shirazi A, Shams-Esfandabadi N, Ahmadi E, Heidari B. Effects of growth hormone on nuclear maturation of ovine oocytes and subsequent embryo development. Reprod Domest Anim. 2010;45(3):530-6.##Willadsen SM. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins. Nature. 1979;277(5694):298-300.##Campbell KH, Alberio R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Reprod Suppl. 2003; 61:477-94.##Ware CB, Barnes FL, Maiki-Laurila M, First NL. Age dependence of bovine oocyte activation. Gamete Res. 1989;22(3):265-75.##Karja NW, Otoi T, Wongsrikeao P, Shimizu R, Murakami M, Agung B, et al. Effects of electric field strengths on fusion and in vitro development of domestic cat embryos derived by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 2006;66(5):1237-42.##Shirazi A, Bahiraee A, Ahmadi E, Nazari H, Heidari B, Borjian S. The effect of the duration of In Vitro Maturation (IVM) on parthenogenetic development of ovine oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 2009;1(3):113-8.##Rizos D, Burke L, Duffy P, Wade M, Mee JF, O'Farrell KJ, et al. Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitro. Theriogenology. 2005;63(3):939-49.##Mermillod P, Le Bourhis D, Lonergan P, Khatir H, Heyman Y. Assessment of cytoplasmic competence of prepubertal calf oocytes by use of nuclear transfer. Theriogenology. 1998;49(1):187.##Dominko T, Mitalipova M, Haley B, Beyhan Z, Memili E, McKusick B, et al. Bovine oocyte cytoplasm supports development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species. Biol Reprod. 1999;60(6): 1496-502.##Tani T, Kato Y, Tsunoda Y. Direct exposure of chromosomes to nonactivated ovum cytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus reprogramming. Biol Reprod. 2001;64(1):324-30.##Gurdon JB. Genetic reprogramming following nuclear transplantation in Amphibia. Semin Cell Dev Biol. 1999;10(3):239-43.##Campbell KH, Loi P, Otaegui PJ, Wilmut I. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod. 1996;1(1):40-6.##Hua S, Zhang Z, Zhang C, Zhang Y. An improved enucleation method of bovine somatic cell nuclear transfer. J Genet Genomics. 2007;34(6):491-6.##Costa-Borges N, Paramio MT, Santaló J, Ibáñez E. Demecolcine- and nocodazole-induced enucleation in mouse and goat oocytes for the preparation of recipient cytoplasts in somatic cell nuclear transfer procedures. Theriogenology. 2011;75(3):527-41.##George A, Shah RA, Sharma R, Palta P, Singla SK, Manik RS, et al. Activation of zona-free buffalo (Bubalus bubalis) oocytes by chemical or electrical stimulation, and subsequent parthenogenetic embryo development. Reprod Domest Anim. 2010. [E-pub ahead of print]##Mtango NR, Potireddy S, Latham KE. Oocyte quality and maternal control of development. Int Rev Cell Mol Biol. 2008;268:223-90.##Samiec M. The Bcl-2 family proteins and calcium signaling in mammalian embryos generated by somatic cell cloning. Biotechnologia. 2010;1:66-81.##Yong Z, Yuqiang L. Nuclear-cytoplasmic interacttion and development of goat embryos reconstructed by nuclear transplantation: production of goats by serially cloning embryos. Biol Reprod. 1998;58 (1):266-9.##Vignon X, Lebourhis D, Chesne P, Marchal J, Heyman Y, Renard JP. Development of bovine nuclear transfer embryos reconstituted with quiescent and proliferative skin fibroblasts. Theriogenology. 1999; 51(1):216.##Samiec M. Calcium signal transduction in reconstructed oocytes and somatic cell nuclear transfer embryos of mammals in the conditions of artificial activation. Biotechnologia. 2010;1:46-65.##Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997;278 (5346):2130-3.##Shirazi A, Ostad-Hosseini S, Ahmadi E, Heidari B, Shams-Esfandabadi N. In vitro developmental competence of ICSI-derived activated ovine embryos. Theriogenology. 2009;71(2):342-8.##Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, et al. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nat Biotechnol. 2000;18(10): 1055-9.##Lan GC, Chang ZL, Luo MJ, Jiang YL, Han D, Wu YG, et al. Production of cloned goats by nuclear transfer of cumulus cells and long-term cultured fetal fibroblast cells into abattoir-derived oocytes. Mol Reprod Dev. 2006;73(7):834-40.##Galli C, Lagutina I, Crotti G, Colleoni S, Turini P, Ponderato N, et al. Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature. 2003;424(6949):635.##Woods GL, White KL, Vanderwall DK, Li GP, Aston KI, Bunch TD, et al. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science. 2003;301(5636): 1063.##Lee BC, Kim MK, Jang G, Oh HJ, Yuda F, Kim HJ, et al. Dogs cloned from adult somatic cells. Nature. 2005;436(7051):641.##Bhak JS, Lee SL, Ock SA, Mohana Kumar B, Choe SY, Rho GJ. Developmental rate and ploidy of embryos produced by nuclear transfer with different activation treatments in cattle. Anim Reprod Sci. 2006;92(1-2):37-49.##Malcuit C, Fissore RA. Activation of somatic cell nuclear transfer embryos. In: Sutovsky P, editor. Somatic cell nuclear transfer. USA: Landes Bioscience and Springer Science Business Media, ILC; 2007. p. 123.##Gaynor P, Wells DN, Oback B. Couplet alignment and improved electrofusion by dielectrophoresis for a zona-free high-throughput cloned embryo production system. Med Biol Eng Comput. 2005;43(1): 150-4.##Tsunoda Y, Yasui T, Shioda Y, Nakamura K, Uchida T, Sugie T. Full-term development of mouse blastomere nuclei transplanted into enucleated twocell embryos. J Exp Zool. 1987;242(2):147-51.##Gao S, McGarry M, Ferrier T, Pallante B, Priddle H, Gasparrini B, et al. Effect of cell confluence on production of cloned mice using an inbred embryonic stem cell line. Biol Reprod. 2003;68(2):595-603.##Gao S, Czirr E, Chung YG, Han Z, Latham KE. Genetic variation in oocyte phenotype revealed through parthenogenesis and cloning: correlation with differences in pronuclear epigenetic modification. Biol Reprod. 2004;70(4):1162-70.##Vignon X, Chesné P, LeBourhis D, Heyman Y, Renard JP. Developmental potential of bovine embryos reconstructed with somatic nuclei from cultured skin and muscle fetal cells. Theriogenology.1998;41(1):392-5.##Cuthbertson KS, Whittingham DG, Cobbold PH. Free Ca2 increases in exponential phases during mouse oocyte activation. Nature. 1981;294(5843): 754-7.##Katayama M, Zhong Z, Lai L, Sutovsky P, Prather RS, Schatten H. Mitochondrial distribution and microtubule organization in fertilized and cloned porcine embryos: implications for developmental potential. Dev Biol. 2006;299(1):206-20.##De Sousa PA, Dobrinsky JR, Zhu J, Archibald AL, Ainslie A, Bosma W, et al. Somatic cell nuclear transfer in the pig: control of pronuclear formation and integration with improved methods for activation and maintenance of pregnancy. Biol Reprod. 2002;66(3):642-50.##Heidari B, Shirazi A, Ahmadi E, Nazari H, Shams Esfandabadi. The effect of strength of DC pulse on fusion and development of reconstructed ovine oocytes. In: Sirivaidyapong S, Wongtavatchai J, editors. Proceedings of the 13th Associations of Institutions for Tropical Veterinary Medicine (AIT VM) conference 2010; 2010 Aug 23-26; Bangkok. Thailand: Chulalongkorn University; 2010. p. 139.##Im GS, Seo JS, Hwang IS, Kim DH, Kim SW, Yang BC, et al. Development and apoptosis of pre-implantation porcine nuclear transfer embryos activated with different combination of chemicals. Mol Reprod Dev. 2006;73(9):1094-101.##Wells DN, Misica PM, Tervit HR, Vivanco WH. Adult somatic cell nuclear transfer is used to preserve the last surviving cow of the Enderby Island cattle breed. Reprod Fertil Dev. 1998;10(4): 369-78.##Peura TT, Kleemann DO, Rudiger SR, Nattrass GS, McLaughlan CJ, Walker SK. Effect of nutriation of oocyte donor on the outcomes of somatic cell nuclear transfer in the sheep. Biol Reprod. 2003;68(1):45-50.##Aston KI, Li GP, Hicks BA, Sessions BR, Pate BJ, Hammon D, et al. Effect of the time interval between fusion and activation on nuclear state and development in vitro and in vivo of bovine somatic cell nuclear transfer embryos. Reproduction. 2006;131(1):45-51.##Lee HS, Yu XF, Bang JI, Cho SJ, Deb GK, Kim BW, et al. Enhanced histone acetylation in somatic cells induced by a histone deacetylase inhibitor improved inter-generic cloned leopard cat blastocysts. Theriogenology. 2010;74(8):1439-49.##Wrenzycki C, Wells D, Herrmann D, Miller A, Oliver J, Tervit R, et al. Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned bovine blastocysts. Biol Reprod. 2001;65 (1):309-17.##Yan ZH, Zhou YY, Fu J, Jiao F, Zhao LW, Guan PF, et al. Donor-host mitochondrial compatibility improves efficiency of bovine somatic cell nuclear transfer. BMC Dev Biol. 2010;10:31.##Li X, Kato Y, Tsuji Y, Tsunoda Y. The effects of trichostatin A on mRNA expression of chromatin structure-, DNA methylation-, and developmentrelated genes in cloned mouse blastocysts. Clon-ing Stem Cells. 2008;10(1):133-42.##Wang F, Kou Z, Zhang Y, Gao S. Dynamic reprogramming of histone acetylation and methylation in the first cell cycle of cloned mouse embryos. Biol Reprod. 2007;77(6):1007-16.##Bui HT, Wakayama S, Kishigami S, Park KK, Kim JH, Thuan NV, et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 2010;83(3): 454-63.##Khan SN, Khan AU. Role of histone acetylation in cell physiology and diseases: An update. Clin Chim Acta. 2010;411(19-20):1401-11.##Gao S, Han Z, Kihara M, Adashi E, Latham KE. Protease inhibitor MG132 in cloning: no end to the nightmare. Trends Biotechnol. 2005;23(2):66-8.##Do JT, Lee JW, Lee BY, Kim SB, Ryoo ZY, Lee HT, et al. Fate of donor mitochondrial DNA in cloned bovine embryos produced by microinjecttion of cumulus cells. Biol Reprod. 2002;67(2): 555-60.##Hiendleder S, Zakhartchenko V, Wolf E. Mitochondria and the success of somatic cell nuclear transfer cloning: from nuclear-mitochondrial interactions to mitochondrial complementation and mitochondrial DNA recombination. Reprod Fertil Dev. 2005;17(1-2):69-83.##

Fertility Preservation in Men after Cancer Treatment; a Review Article 2 1 زمینه و هدف سلول‌های بنیادی و سلول‌های زایا: سلول‌های بنیادی گروهی از سلولها هستند که ضمن داشتن توانمندی تقسیم به سلول های کاملاً مشابه خود ، توانایی تولید و تمایز به سلول‌های تخصصی‌تر را نیز داشته باشند (1). در بسیاری از انواع سلول‌های بنیادی، گروهی سلول حد واسط بین سلول‌های کاملاً تمایز یافته با سلول‌های بنیادی، وجود دارد که سلول های پیش‌ساز نامیده می‌شوند سلول‌های پیش‌ساز خونی نمونه‌های مشهور آن هستند. علیرغم اینکه این سلولها قابلیت برگشت به حالت تمایز یافته را ندارند؛ بعضی از ویژگی‌های آنها را تقلید می کنند. مهم‌ترین تفاوت میان سلول‌های بنیادی و پیش‌ساز، قابلیت تقسیم میتوز بسیار شدید سلول‌های پیش ساز، نسبت به سلول های بنیادی است (2). بنابراین، نقش سلول‌های بنیادی، به عنوان ذخیره زایای بدن و نقش سلول‌های پیش ساز، به عنوان تولیدکننده رده‌های سلولی تعریف می‌شود و در واقع، سلول‌های پیش‌ساز، مسئول اصلی تمایز نهایی هستند. سلول‌های زایای نر ، در واقع، مجموعه‌ای از سلول‌های تمایز نیافته هستند که در مجموع، اسپرماتوگونیها را شامل می‌شوند. این سلولها در گروه‌های مختلف جانوری، ترکیب‌بند‌های متفاوتی دارند. به عنوان مثال، در ردۀ پریماتها و انسان، دو رده سلولی اسپرماتوگونی A, B وجود دارد که ردۀ A خود به دو گروه سلولی Adark و Apale تقسیم می‌شود. گروه Adark که جمعیتی حدود 1% از سلول‌های اسپرماتوگونی را شامل می‌شود، در واقع، همان سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی (SSCs) با تقسیم میتوزی اندک است (3). میزان پایین میتوز در اسپرماتوگونی‌های Adark به کاهش خطر جهش و پایداری ژنتیکی کمک می‌کند. در واقع، اسپرماتوگونی‌های Adark ذخیره سلول‌های بنیادی، در زمان تخریب حجم انبوه سلول‌های پیش‌ساز، هستند (4). از سوی دیگر، گروه Apale، به عنوان سلول‌های پیش‌ساز با تکثیر زیاد و تمایز برگشت‌ناپذیر، شرایط را برای تولید انبوه اسپرماتوزوییدها فراهم می‌کند. در جوندگان، اسپرماتوگونی‌های A شامل 7 رده اسپرماتوگونی Asingle، Apaired، AAligned، A1، A2، A3 و A4 هستند که در این میان، تنها رده Asingle نقش سلول بنیادی را به عهده دارد و سایر رده‌های اسپرماتوگونی، به ویژه Apaired و AAligned، نقش‌های حد واسط را بازی می‌کنند (5). مرحله بعدی تقسیم سلول‌های زایا، اسپرماتوگونی‌های B هستند که حد واسط نوع A تا اسپرماتوسیت تلقی می‌شوند. این سلولها در موش یک رده، در پریماتها چهار رده و در انسان نیز یک رده را شامل می‌شوند (6،7). به این ترتیب، اسپرماتوگونی‌های انسان برای رسیدن به اسپرماتوسیت عبارتند از Adark و Apale. در حالی‌ که در موش، 10 رده سلولی حد واسط و در پریماتها، 7 رده سلولی حد واسط وجود دارد. این تفاوتها، در تعداد اسپرماتوسیت‌های حاصل از هر سلول بنیادی اسپرماتوگونی تأثیر خواهد داشت؛ به گونه‌ای که در انسان از هر اسپرماتوگونی Adark، 4 اسپرماتوسیت و در پریماتها، 32 اسپرماتوسیت و در موش، از هر ASingle، 1024 اسپرماتوسیت تولید می‌شود (8). کاهش تعداد سلول‌های پیش‌ساز در انسان که تقسیم میتوز فراوان دارند و تحت تأثیر عوامل داخلی و خارجی، در معرض خطر بالای جهش قـرار می‌گیرند، یک راهکار تکاملی برای حفظ پایداری ژنتیکی و حساسیت سلولها در مقابل عوامل سیتوتوکسیک به نظر می‌رسد. افزون بر آن، از نظر الگوهای تولیدمثلی نیز، با توجه به امید به زندگی طولانی انسانها و نیز تعداد کم فرزندان، به تعداد کمتری گامت نیاز است و این الگوی سلول‌های پیش‌ساز با تولید کمتر اسپرمها مطابقت می‌کند (8). اثر درمان‌های ضد سرطان بر سلول‌های زایا: درمان‌های ضد سرطان، اعم از پرتودرمانی یا شیمی‌درمانی، با هدف قراردادن سلول‌های پرتکثیر، اثر درمانی خود را بر سلول‌های سرطانی اعمال می‌کنند. در این میان، سلول‌های زایا نیز، با توجه به نرخ بالای تکثیر، دچار آسیب و مرگ سلولی می‌شوند که در نهایت، با کاهش توان باروری یا ناباروری کامل بیماران همراه است (9). میزان آسیب در سلول‌های زایا به شدت درمان‌های ضد سرطان بستگی دارد، به گونه‌ای که در شیمی‌درمانی و پرتودرمانی با دوز پایین، تنها سلول‌های Apale و اسپرماتوگونی‌های B از بین می‌روند و سلول‌های Adark باقی می‌مانند و در نهایت، توانایی باروری بدین واسطه حفظ می‌شود (4)؛ اگرچه این امکان نیز وجود دارد که به علت از دست رفتن سلول‌های پیش‌ساز، فرد دچار الیگوسپرمی ‌شود (10). در دوزهای بالای شیمی‌درمانی، همه سلول‌های اسپرماتوگونی اعم از A, B از دست می‌روند و آنچه باقی می‌ماند سلول‌های سرتولی است که به این شرایط سندرم SCO گفته می‌شود (11). به عنوان مثال، دوزهای پرتودرمانی Gy2/1-1/0 به رده‌های پیش‌ساز آسیب خواهد زد و در نهایت، الیگوزوسپرمی را به دنبال خواهد داشت. در دوزهای 4 و 3-2 و1، اسپرماتوژنز به ترتیب ظرف 18-9 ماه، 3 و 5 سال باز خواهد گشت. در دوزهای بیش از Gy20، آسیب سلولی به سلول های لایدیگ نیز گسترش خواهد یافت که در صورت بروز این آسیب در کودکان، روند هورمونی بلوغ دچار اختلال خواهد شد. اگر میزان پرتوها در محدوده زیر Gy12 (پیوند مغز استخوان) باقی بماند، روند اسپرماتوژنز دچار اختلال می‌شود اما روند بلوغ آسیبی نمی‌بیند (12،13). در مورد درمان‌های شیمی‌درمانی، با توجه به تنوع رژیم‌های درمانی، تأثیرات نیز متنوع است ولی در کل گروهی از داروها که از سد خونی بیضه‌ای عبور کنند، آسیب‌رسان هستند مانند سیکلوفسفامید، بوسولفان، کلرامبوسیل (14). بقای بیماران سرطانی: بنا بر آمار ارایه شده، از هر 640 امریکایی، یک نفر و در مجموع 300 هزار نفر از جمعیت کل، بیماران مبتلا به سرطانی هستند که درمان شده اند و در سنین 20 تا 40 سال قرار دارند. بیش از نیمی از آنها امید به زندگی بیشتر از 5 سال دارند و امکان داشتن فرزند به افزایش کیفیت زندگی آنها کمک خواهد کرد. در کودکان نیز، اگرچه بقای 5 ساله بعد از درمان سرطان حدود 80% است؛ اما میزان بقای 10 ساله و بیشتر، با توجه به سن و نیز عوارض درمان‌های ضد سرطان، کاهش می‌یابد. با این حال و با توجه به پیشرفت‌های موجود در درمان سرطان، یافتن راه‌های حفظ باروری کودکان تحت درمان‌های ضدسرطان از اولویت‌های متخصصان علوم باروری به حساب می‌آید (15). روش بررسی این مقاله مروری، با استفاده از مقالات منتشر شده در منابع اطلاعاتی SCIENCE DIRECTو ELSEVIER در بازه زمانی سال‌های 2010 – 1985 میلادی و با جستجوی کلید واژه‌هایFertility preservation, Spermatogonial Stem cell culture & transplantation, infertility in cancer treatment آغاز و در مواردی از منابع درج شده در مقالات فوق‌الذکر نیز استفاده شد. تعداد منابع مورد بررسی در مجموع 156 مقاله و 4 کتاب بود. روش‌های حفظ باروری پس از درمان سرطان: روش‌های حفظ باروری مورد استفاده در بیماران سرطانی، گروه‌های دیگری از افراد را نیز شامل می‌شود. کارگران و کارکنان کارخانه‌هایی که در مواجهه طولانی مدت با مواد گونادوتوکسیک قرار دارند (مثل کارگران نساجی) یا کارمندان سیستم‌های بهداشتی درمانی و نیز نظامیانی که در مواجهه با ترکیبات پرتوزا یا سمی قرار دارند، از این دسته افرادند (16،17). روش‌های حفظ باروری را می‌توان با توجه به طیف سنی بیماران به دو دسته تقسیم کرد: برخی از روش‌های حفظ باروری در مردان بالغ انجام می‌گیرد، که این روشها، به علت دسترسی به بافت فعال بیضه و نیز اسپرماتوزوآی مؤثر، روش‌هایی به نسبت در دسترس هستند و در حال حاضر امکان حفظ باروری را فراهم می‌آورند. اما از سویی دیگر، روش‌های حفظ باروری کودکان تحت شیمی‌درمانی با مشکل فقدان سلول‌های اسپرماتوگونی فعال و نبود اسپرم مؤثر مواجه است در نتیجه فراهم کردن شرایط برای بلوغ و تمایز این سلولها به سمت اسپرماتوسیت و اسپرماتوزوآ بخشی مهم از این فرآیند است. وجود مشکلات فوق باعث محدودیت روش‌های حفظ باروری برای کودکان شده است. با این حال، تلاش خوبی در این راه انجام شده است و بسیاری از دانشمندان این فرآیند را پیگیری می‌کنند (14). روش‌های حفظ باروری در مردان بالغ: 1ـ سرکوب تقسیم سلول‌های زایای بیضه در مردان بالغ به وسیله تزریق آنالوگ‌های هورمون‌های آزادکننده گنادوتروپینها GnRH قبل از انجام پرتو یا شیمی‌درمانی، به حساسیت کمتر این سلولها نسبت به درمان‌های سیتوتوکسیک منجر می‌شود (18). از سوی دیگر، اگر درمان با دوزهای بالای آگونیست‌های GnRH بلافاصله پس از انجام شیمی‌درمانی تا حدود ده هفته اول انجام شود، سلول‌های زایای باقی مانده را برای تقسیم تحریک می‌کند. در یک مطالعه، در90% از افرادی که پس از پرتوتابی Gy 5/3 تحت درمان GnRH قرار گرفته‌اند، تکثیر مجدد اسپرماتوگونیها را داشته‌اند، اگرچه هنوز اثر آنها بر روی باروری ثبت نشده است (19). در مطالعه دیگرکه بر روی موشهای مدل آزوسپرمی انجام شده است تزریق توام کونادوتروپینها به همراه استرادیول با افزایش بازگشت اسپرماتوژنز همراه بوده است (20). افزایش ترشح تستوسترون نیز نتیجه مثبت دیگری است که در نتیجه تزریق گونادوتروپینها به دست می‌آید (21). با تمام تلاش‌های فوق، این احتمال که اختلالات ژنتیکی ناشی از شیمی‌درمانی، در محتوای ژنتیکی متولدان تأثیرگذار باشد، استفاده از این روش را با ابهام مواجه می کند (22). 2ـ اخذ و انجماد نمونه‌های اسپرم قبل از انجام شیمی‌درمانی و پرتودرمانی و استفاده ازآن برای تزریق داخلی سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) یا IVF شانس باروری مردان رهایی یافته از سرطان را، تا 50% افزایش داده است (23). افزون بر آن، مطالعات، عارضه ژنی خاصی را پس از تولد حاصل از اسپرم منجمد گزارش نکرده‌اند (24). روش‌های حفظ باروری در کودکان سرطانی: حفظ باروری در کودکان پسر، با توجه به عدم وجود اسپرماتوژنز فعال، با مشکلاتی روبه‌رو است که مهم‌ترین آنها عدم امکان انجماد اسپرم و نیز عدم تمایز سلول‌های اسپرماتوگونی در بیضه است. بنابراین، سیاست حفظ باروری آنها بر یکی از سه محور زیر بنا خواهد شد: الف) جداسازی و انجماد بافت بیضه و تلاش برای پیوند مجدد بافت پس از بهبودی ب) جداسازی سلول‌های اسپرماتوگونی و تلاش برای کشت و بلوغ آنها در شیشه یا میزبان ثانویه با هدف نهایی تولید اسپرم برای IVF ج) جداسازی سلول‌های اسپرماتوگونی از بافت منجمد شده بیضه پس از درمان سرطان و پالایش آن از سلول‌های سرطانی و پیوند مجدد آنها پس از بهبودی انجماد بافت بیضه و پیوند مجدد: حفظ بافت بیضه، از طریق انجماد نمونه‌ها قبل از انجام شیمی‌درمانی و پیوند مجدد آنها پس از درمان، یک روش‌ درمانی پیشنهادی برای حفظ باروری در کودکان تحت درمان سرطان است. در این روش، هدف نهایی بلوغ سلول‌های تمایز نیافته اسپرماتوگونی در بدن فرد بیمار، به کمک سلول‌های سرتولی است. تلاش‌های بسیاری برای حفظ باروری در پستانداران از طریق پیوند بافت‌ بیضه صورت گرفته است، بدین صورت که بافت بیضه نابالغ به صورت ارتوتوپیک در داخل بافت‌ بیضه میزبان و اکتوپیک ، در سایر نقاط بدن میزبان سرکوب ایمنی شده مثل پوست پیوند زده و وضعیت تولیدمثلی آنها نیز پیگیری شده است. به عنوان مثال، Schlatt و همکارانش در سال‌های 2002 و 2003، موفق شدند به دنبال پیوند بافت بیضه در موش و همستر، به تولید نسل جدید از آنها دست یابند (25،26). تحقیقات هنرآموز (27،28) نیز در مورد خوک و بز، به ترتیب، به تولید جنین و اسپرم‌های زنده انجامید. گاهی این پیوندها در میزبانی غیر از گونه دهنده بیضه انجام شده است (xenotransplantation)، که به عنوان مثال، هنرآموز در سال 2004، موفق شد با پیوند اکتوپیک سلول‌های بیضه میمون رزوس به موش سرکوب ایمنی شده، اسپرم میمون را در بدن موش ردیابی کند (29). یکی از پژوهش‌های مهم انسانی در این زمینه در سال 2006 توسط Schlatt به صورت زنوگرافت اکتوپیک انسان به موش و در زیر پوست انجام شد که علیرغم حفظ بقای سلول‌های زایا تقسیمات میوزی و اسپرماتوژنز را به همراه نداشت. این روش هنوز در مورد بافت‌های انسانی رویکرد موفقیت‌آمیزی نداشته است، با این وجود، در یک مطالعه، پیوند بافت‌های بیضه بالغ در 14 نفر از 31 فرد درمان شده پس از سرطان، به تولید سلول‌های بیضه و توبول‌های منی‌ساز منجر شده است. البته، پیشبرد فرآیند بلوغ این سلول‌های نابالغ همچنان نیازمند انجام پژوهش‌های بیشتر است (30). در میان تکنیک‌های مختلف انجماد، حفظ سلول‌های اسپرماتوگونی، سرتولی و بستر بافتی بیضه نابالغ به وسیله انجماد در دی‌متیل سولفوکسید (DMSO) موفقیت‌آمیزتر بوده است (31). از سوی دیگر، در سال 2007، Wyns موفق شد بافت بیضه منجمد شده انسانی را پس از ذوب کردن به بیضه موش پیوند بزند و سلول‌های اسپرماتوگونی را زنده نگهدارد (32). یکی از موفقیت‌های این پژوهش، تأیید سلامت سلولها پس از انجماد و ذوب بود که قابلیت استفاده از پیوند بافت در کودکان مبتلا به سرطان را، پس از انجماد طولانی مدت، نوید می‌داد. مطالعات wistuba در سال 2005 و Luetjens در سال 2007 که روی پریماتها انجام شد (33)، نشان می‌دهد که پیوندهای ارتوتوپیک از پیوندهای اکتوپیک مؤثرترند، چرا که چرخۀ اسپرماتوژنز در پیوندهای ارتوتوپیک در بافت بیضه تکمیل می‌شود اما در حالت اکتوپیک، سلول‌های اسپرماتوگونی در چرخه‌های میوز و اسپرمیوژنز گیر می‌افتند. تولید اسپرم در محیط آزمایشگاهی از سلول‌های زایای استخراج شده قبل از درمان: فراهم ساختن شرایط مناسب در شیشه (in vitro) برای تمایز سلول‌های زایای بدوی (PGC) یا اسپرماتوگونیها به سمت اسپرماتوسیتها، در نهایت، به شبیه سازی محیط بیضه خواهد انجامید که در صورت تحقق این امر گام بسیار بزرگی در روند حفظ باروری افراد و درمان ناباروری برداشته خواهد شد، اگرچه تا رسیدن به این هدف راهی بسیار طولانی پیش‌رو است. برای تحقق این امر، مهم‌ترین اقدامات، بررسی فاکتورهای رشد ترشح شده در بافت بیضه و سلول‌های سرتولی، شناسایی ژن‌های مؤثر بر باروری و تمایز اسپرماتوگونیها و نیز، انتخاب سلول‌های تغذیه کننده مناسب است (34). افزون بر آن، استفاده از محیط‌های مناسب تمایز در آزمایشگاه، در فاصله زمانی بین درمان‌های ضد سرطان و بازگرداندن سلول‌های زایا زمان کافی برای تمایز سلول‌های نابالغ استخراج شده را مهیا می‌سازد و این محیطها امکانی فراهم می‌آورد تا سلولها مراحل تقسیم و تمایز خود را در محیط آزمایشگاهی به دست آورنــد و پس از آن عمل پیوند انجام گردد. آنچـه در نهایت، پس از پیوند بافت‌ بیضه، بسیار مهم به نظر می‌رسد، سلامت و احیای چرخه اسپرماتوژنز و نیز حفظ محتوای ژنتیکی اسپرم‌های تولید شده است که این موضوع در نمونه‌های حیوانی توسط zeng، در دو مقاله بررسی و تأیید شده‌اند (35،36). از سوی دیگر، در صورت موفقیت نهایی حفظ اسپرماتوژنز انسان از طریق پیوند زنوگرافت می‌توان برای حفظ باروری مبتلایان به سرطان، از تلقیح اسپرم به دست آمده از آن استفاده کرد و نیاز به پیوند اتوگرافت بافت در فرد دهنده را مرتفع ساخت. یکی از مهم‌ترین ایرادات وارد شده به پیوند بافت بیضه، امکان انتقال سرطان از طریق پیوند اتوگرافت بافت‌های آلوده است؛ چرا که ممکن است آلودگی آن در روندهای تشخیصی معمول قابل ارزیابی دقیق نباشد. افزون بر آن، Fujita در سال 2008 نشان داد که وجود سلول‌های سرطانی در بافت بیضه مانع تکمیل روند اسپرماتوژنز نرمال در بافت پیوندی می‌شود (37). پیوند سلول‌های SSCمنجمد شده: در این روش سلول‌های SSC پس از جداسازی از نمونه بیضه، منجمد می‌شوند و تا پایان درمان سرطان، نگهداری و سپس ذوب می‌گردند و به بافت بیضه فرد بازگردانده می‌شوند. سابقه پیوند سلول‌های SSC به سال 1994 بر می‌گردد که Brinster موفق شد با پیوند سلول‌های SSC ی یک موش، باروری را به موش نابارور دیگر برگرداند و موجب تولید اسپرماتوزوآی فعال و مؤثر شود (38،39). معمولاً در مطالعات پیوند سلول‌های SSC، برای ردیابی سلول‌های پیوند شده از نشانگرهای ژنتیکی تراریخته یا پروتئین‌هایی استفاده می‌شود که ژن آنها به صورت ترانس‌ژنیک وارد سلول‌های زایای فرد دهنده شده باشد؛ اما فرد گیرنده فاقد آن باشد. به عنوان مثال، Brinster در مطالعه خود از ژن B گالاکتوزیداز استفاده کرد که به صورت ترانس‌ژنیک در موش دهنده وجود داشت و پس از پیوند، در اسپرم تولید شده نیز ردیابی شد. در یک مطالعه نیز سلول‌های SSCs با ماده شیمیایی Brdu نشاندار و سپس با آنتی بادی علیه آن ارزیابی گردیدند (40). در مطالعه سال 1996، Avarbock نشان داد که سلول‌های زایا را می‌توان قبل از میوز برای مدت طولانی منجمد کرد (41). در 1998، Nagano قبل از انجام پیوند سلول‌های اسپرماتوگونی، آنها را در محیط کشت آزمایشگاهی رشد داد و پس از نامیرا کردن در محیط کشت، پیوند زد و بقای آنها را برای مدت طولانی تایید کرد (42). نتایج حاصل از چنین پیوندی در موش، در سال 2003 و از سوی Shinohara گزارش شد (43). با وجود انجام پیوندهای متعدد، سلول های زایا در گونه‌های جانوری مختلف از جمله رت، همستر، بز، گاو و خوک و میمون، زانوگرافت بین دو گونه، زمانی به تولید اسپرم خواهد انجامید که این پیوند بین دو گونه نزدیک به هم باشد به طوری که این امر بین رت با موش و بز با خوک اتفاق افتاده است. در غیر این صورت، در قسمتی از میوز، روند اسپرماتوژنز مختل خواهد شد (44). به نظر می‌رسد اختلال فوق ناشی از عدم تطابق فعالیت سلول‌های سرتولی بیضه میزبان با سلول‌های زایای پیوندی باشد. زیرا که Shinohara در 2003 نشان داد که پیوند همزمان سلول‌های سرتولی با سلول‌های زایا توانایی تولید اسپرم را به دنبال خواهد داشت. در نزدیک‌ترین مطالعه به انسان که توسط Hermann روی پریماتها انجام شده است، پس از مواجهه میمون رزوس با بوسولفان و ایجاد وضعیت ناباروری در آن، سلول‌های اسپرماتوگونی که از قبل نمونه‌گیری شده بودند و به صورت منجمد نگهداری می‌شدند، به بیضه او بازگردانده شدند. نشانگر ژنی اسپرماتوگونی (VASA, DA2L) و نیز پیش‌ساز (PLZF, GFRά1) در بافت‌های بیضه ردیابی و پیوند موفقیت‌آمیز گزارش شد (45). از سوی دیگر، نیز پیوند زنوگرافت بافت بیضه، نسبت به پیوند سلول‌های SSC به تنهایی، موفقیت بیشتری در اسپرماتوژنز داشته‌اند که این امر می‌تواند مؤید نقش سلول‌های سرتولی در این میان باشد. پیوند سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی در انسان: آنچه در نهایت به ذهن می‌رسد، این است که آیا بعد از به نتیجه رسیدن فعالیت‌های پژوهشی حیوانی، پیوند سلول‌های زایا در انسان قابل انجام است یا به عبارت دیگر، آیا از این روند می‌توان به عنوان روشی برای حفظ باروری افراد مبتلا به سرطان، به ویژه کودکان مبتلا که سلول‌های زایای آنها پیش از طی مراحل بلوغ از بین رفته است، استفاده کرد یا خیر. افزون بر آن، پرسش‌های بسیاری در مورد ایمنی و سلامت این پیوند، به ویژه در حفظ محتوی ژنی آنها، مطرح است که باید به آنها پاسخ داده شود. در یکی از مطالعات انجام شده، در 11 نفر از مردان مبتلا به سرطان نمونه‌گیری و نمونه‌های بافتی بیضه منجمد شده و سپس در مرحله پس از درمان با باز گرداندن بافت‌ بیضه، 5 نفر از آنها اســـپرماتوژنز فعال خود را باز یافته‌اند (46). مراحل اصلی پیوند سلول‌های SSC برای حفظ باروری کودکان مبتلا به سرطان عبارتند از: نمونه‌گیری و انجماد نمونه‌ها، جداسازی سلول‌های SSC، رفع آلودگیها و بدخیمیها و در نهایت پیوند سلول‌های اسپرماتوگونی به فرد. تقریباً از هر 104 سلول بیضه، 2 سلول آن اسپرماتوگونی بنیادی (S.S.C) هستند (44) در نتیجه در یک بیضه موش نابالغ حدود 100 تا 200 سلول بنیادی اسپرماتوگونی وجود دارد (5). به دست آوردن تعداد مناسب از سلول‌های SSC و نیز تخلیص یا بالا بردن غلظت آنها در سوسپانسیون پیوند یکی از عوامل مؤثر در میزان موفقیت آن پیوند است (47). انجماد بافت بیضه: با توجه به فاصله زمانی میان نمونه‌گیری تا پیوند سلول اسپرماتوگونی که شامل دوره درمان ضد سرطان و اطمینان از وضعیت سلامتی و عدم بازگشت سرطان و نیز اتمام اثر داروهای ضد سرطان در بدن است و حدود 5 سال به درازا می‌کشد (47)، انجماد سلول‌های اسپرماتوگونی اجتناب‌ناپذیر است. نخستین الگوی انجماد سلول‌های بافت بیضه با هدف فعالیت‌های In vitro و مهم تر از همه ICSI طراحی شد (48). اگرچه با همین الگوها در 1996، Avarbock اولین پیوندهای سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی موش را پس از انجماد با موفقیت انجام داد؛ اما نیاز به یک تکنیک اختصاصی برای انجماد سلول‌های زایا و سلولهای همراه آن احساس می‌شود تا بتواند بهترین شرایط ممکن را فراهم آورد. در 1999، Dobrinsky و Ogawa با استفاده از دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) 10% موفق به انجماد مؤثر شدند و در 2002، ایزدیار (46) و همکاران جهت انجماد اسپرماتوگونی گاو از الگوی مشابهی استفاده کردند. تفاوت روش آنها در این بود که محیط انجماد آنها ساکارز M07/0 بود و بقای سلول‌های ذوب شده بعد از انجماد حدود 70% گزارش شد. در یک پژوهش دیگر در سال 2007، Hermann موفق شد با استفاده از DMSO با غلظت 10%، به بقای 58% سلول‌های میمون، پس از انجماد، برسد (45). برای انجماد سلول‌های انسانی، Kvist در سال 2006 از روش انجماد آهسته که پیش از آن در مورد تخمدان استفاده شده بود، استفاده کرد که ماده محافظ آن اتیلن‌گلیکول M5/1 و ساکارز M1/0 بود (49). از سوی دیگر، در سال 2007، Keros از انجماد آهسته با DMSO استفاده کرد و به نتیجه رسید. برای ذوب کردن نیز معمولاً از محلول نمکی هنکس (HBSS) در یک حمام آب C37 استفاده می‌شود (31). جداسازی سلولها: پس از ذوب کردن سلول، نوبت به استخراج سلول‌های اسپرماتوگونی از بافت بیضه می‌رسد که طبق آنچه گفته شد، تراکم پایینی در بیضه دارند و باید جهت پیوند، جداسازی و افزایش غلظت داده شوند. برای جداسازی سلول‌های اسپرماتوگونی معمولاً از روش‌های جداسازی سلولی مبتنی بر اتصال آنتی‌بادی به گیرنده‌های سطحی اختصاصی این سلولها استفاده می‌شود. اولین شاخص پروتئینی که برای سلول‌های اسپرماتوگونی شناخته شد، گیرنده C-kit بود که در سلول‌های اسپرماتوگونی تمایز نیافته (A) بیان نمی‌شود ولی در انواع تمایز یافته‌تر یافت می‌شود (50). بنابراین، سلول‌های زایای مناسب برای پیوند، گروه -C-kit است. سایر پژوهشها در مورد سلول بنیادی اســپرماتوگونی نشان می‌دهد که سلول‌های اسپرماتوگونی انسانی THY1 ، integrin 1 β و 6α، CD24، CD9، C-kit -، MHC I -،integrin v α هستند (51). با این حال هیچ یک از شاخص‌های زیر برای SSCs اختصاصی نیستند و در سایر سلول‌های رده زایا نیز مشترکا یافت می‌شوند. اخیراً GPR125 به عنوان یک شاخص اختصاصی سلول‌های SSCs معرفی شده است که توسط سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی بیان می‌شود. اما به نظر می‌رسد عدم بیان آن در سایر سلول‌های بافت بیضه نیازمند بررسی بیشتر باشد (51). دو روش جداسازی سلولی براساس برهم کنش ایمنولوژیک وجود دارد: ـ روش FACS مبتنی بر اتصال رنگ‌های فلورسنت به آنتی‌بادی اختصاصی برای سلول‌های اسپرماتوگونی و جداسازی آنها بر مبنای اتصال به آنتی‌بادی نشاندار است. در سال 2003، Kubota سلول‌های اسپرماتوگونی را با روش FACS جداسازی کرد (52). ـ در روش MACS آنتی‌بادی اختصاصی علیه شاخص‌های سطحی مورد نظر به دانه‌های بسیار ریز مغناطیسی متصل می‌شود تا با عبور محلول حاوی سلولها از میدان مغناطیسی، سلول‌های متصل شده به ذرات مغناطیسی از طریق آنتی بادی، جداسازی گردند. سال 1999 Von schonfeldt با روش MACS سلول‌های c-kit را جداسازی کرد (53). رفع آلودگی سلول‌های SSC: در سال 2001، Jahnukainen (54) نشان داد که پیوند سلول‌های زایای به دست آمده از بیضه آلوده با لوکمی، به القای مجدد سرطان در افراد گیرنده منجر می‌شود. به عبارتی دیگر، در میان سلول‌های زایا، هنوز تعدادی از سلول‌ها ویژگی سرطانی دارند. از آنجا که تعدادی از سرطان‌های دوره کودکی، به ویژه سرطان خون، می‌توانند به بافت بیضه وارد شوند یا تهاجم کنند، آلودگی این سلولها می‌تواند موجب بازگشت سرطان شود بنابراین تا رفع این مشکل باید از پیوند سلول‌های زایا به عنوان درمان حفظ باروری خودداری شود.به علاوه همانطور که پیشتر ذکر شد وجود سلول‌های سرطانی مانع تمایز صحیح و بلوغ کامل سلول های اسپرماتوگونی موش می‌شوند (37). تلاشها برای جدا سازی سلول‌های سرطانی بر عدم بیان MHC I روی سلول‌های اسپرماتوگونی بنیادی بنا شده است؛ چرا که MHC کلاس اول بر روی سلول‌های سرطانی بیان می‌شود. Fujita در سال 2005 موفق شد با استفاده از روش FACS سلول‌های فاقد CD45 و زنجیره‌های سنگین MHC I (H2kb, H2Db) را به عنوان سلول‌های اسپرماتوگونی موش جداسازی کند و به بیضه موش‌های شیمی‌درمانی شده تزریق نماید و در نهایت با تولد اولین موش زنده ناشی از این پیوند، جداسازی صحیح و کامل این سلولها را اعلام کند. از سوی دیگر، سلول‌های جداسازی نشده در گروه شاهد باعث بازگرداندن لوکمی به این موشها شدند (55). در تلاش برای جداسازی سلول‌های سرطانی در انسان، Geens در سال 2007، با وجود استفاده از FACS برای سلول‌های HLA,A-,B-,C- ، نتوانست به کیفیت مناسبی از جداسازی برای یک پیوند مطمئن برسد (56). کشت سلول‌های SSC : با توجه به دشواری‌های جداسازی سلولها و نیز نیاز به مقادیر کافی سلول برای پیوند، کشت آنها در محیط in vitro یک مقوله الزامی است. اولین پژوهشها برای کشت این سلولها به همراه سلول‌های سرتولی در محیط کشت به نتیجه رسید. در 1999، Dirami از محیط کشت KSOM برای سلول‌های SSC موش استفاده کرد و در عرض 3 روز به بقای 50 درصدی این سلولها رسید.در این روش کشت سلول‌های پیکری از سلول‌های زایا بر مبنای تفاوت در زمان اتصال آنها به ظرف کشت، جداسازی افتراقی شدند (57). Nagano در 1998، توانست سلول‌های SSCموش را 132 روز در محیط کشت نگهداری و در آخر پیوند کند. محیط کشت او حاوی STO به عنوان سلول تغذیه کننده بود (42). فاکتورهای رشد مختلفی برای کشت سلول‌های زایا استفاه شدند که به تدریج کارآیی آنها تأیید یا رد شده است EGF, bFGF, LIF, GDNF مهم‌ترین فاکتورهای رشد کارآمد برای کشت هستند. GDNF به عنوان یکی از مهم‌ترین فاکتورهای رشد مؤثر بر سلول‌های SSC، با اتصال به گیرنده خود GFR1، در هماننــدسازی این سلولها نقش خود را ایفا می‌کند (58،59). حدود ده سال کشت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی براستفاده از سلول‌های تغذیه کننده مانند STO و MEF مبتنی بود. اما در فاصله سال‌های 2003 تا 2005 بستر پوشانده شده از لامینین که یک پروتئین داربست سلولی است جایگزین سلول‌های تغذیه کننده شد، به طوریکه امکان تکثیر این سلولها تا چند هزار برابر را نیز افزایش داد (60). کشت بسیار موفق SSCsموش با تغییر محیط‌های کشت پایه ازDMEM یاαMEM به محیط کشت غنی‌ترSTEM PRO- 34 ( که نخستین بار به عنوان محیط کشت مناسب برای سلول‌های بنیادی خونساز به بازار آمد) با استفاده از حداقل سرم در محیط ترکیبی (SFM) در کنار ایجاد زیست ساختار لامینین در سال 2005 توسطShinohara (61) مقدمه‌ای شد که دکتر صدری اردکانی و همکارانش در سال 2009 موفق به تکثیر 18000 برابری سلول‌های SSC انسانی با استفاده از SFM گردند (62). در سال بعد گروهی از محققین کره‌ای توانستند سلول‌های SSC را از نمونه‌های بیوپسی بیضه افراد آزوسپرم علیرغم اختلال در تولید اسپرم از آنها جداسازی و کشت کنند (63). پیوند نهایی سلولها: پیوند نهایی سلولها به بافت مورد نظر در موش به صورت بازگشتی از مجرای دفران صورت می‌گیرد اما با توجه به طول بیشتر آن در موجودات بزرگ‌تر و نیز احتمال پر شدن لوله‌های منی ساز و کاهش سلول‌های سرتولی، تزریق محلول حاوی سلول‌های SSC به محل Rete testis از طریق سونوگرافی، جایگزین روش قبلی در جانداران بزرگتر از نشخوارکنندگان تا پریماتها شده است. در پژوهش‌های ذکر شده در مورد پیوند سلول‌های SSC در جوندگان و نشخوار کنندگاند و پریماتها با توجه به امکان تکثیر بالای این سلولها در محیط آزمایشگاهی، پیوند الوگرافت این سلولها در بسیاری موارد با موفقیت همراه بوده و گاه تا تولید نسل بعد این جانوران همراه بوده است. با توجه به مسائل اخلاقی مداخله در بیولوژی انسانی، پیوند سلول‌های کشت شده انسانی هنور در مرحله زنوگرافت به موش است و در غالب موارد ردیابی بیان ژن‌های انسانی اختصاصی SSC و سلول‌های زایا مانند PLZF، VASA و UCHL1 در سلول‌های موشی پس از پیوند سلول‌های کشت یافته اسپرماتوگونی با موفقیت همراه بوده است و افق روشنی را در مسیر حفظ باروری از طریق کشت و جداسازی سلول‌هایSSCs پس از جداسازی سلول‌های سرطانی ایجاد گشوده است. نکته های ایمنی و اخلاقی: در پایان ذکر چند نکته ضروری به نظر می‌رسد: Zeng در 2006 اسپرماتوژنز خوک را بعد از انجام پیوند سلول‌های منجمد بررسی کرده و نشانه‌ای از آسیب ژنی یا اختلال کروموزمی در روند اسپرماتوژنز گزارش نکرد (35،36)؛ ولی با این حال، باید مسئله فوق را در موجودات عالی‌تر و در نهایت، انسان نیز بررسی کرد. همچنین، سلامت فرزندان ناشی از اسپرماتوژنز با روش پیوند نیاز به تأیید دارند تا استفاده درمانی از پیوند سلول‌های اسپرماتوگونی در نهایت تضمین ایمنی و سلامت داشته باشد. برای تأمین امنیت کامل پیوند، بررسی عوارض مداخله جراحی در بیضه نیز نکته‌ای قابل تأمل است که باید به آن پرداخته شود و با توجه به عوارض آن، زمان بهینه برای اخذ نمونه و نیز پیوند پس از درمان سرطان تعیین گردد (48). به عنوان آخرین نکته، اینکه در هنگام نمونه‌برداری و تصمیم برای حفظ باروری کودکان مبتلا به سرطان، تصمیم گیرندۀ نهایی والدین این کودکان هستند، در حالی که نظر کودک، به عنوان فرد اصلی تصمیم گیرنده در روند باروری، محاسبه نمی‌گردد و این می‌تواند ملاحظات اخلاقی داشته باشد (64). نتیجه گیری با توجه به نتایج تحقیقات انجام شده در پستانداران غیر از انسان و نیز با پیشرفت‌های اخیر در زمینه کشت و جداسازی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی در انسان، به نظر می‌رسد در صورت اطمینان از سلامت زیستی و اخلاقی روش‌های فوق، کشت و جداسازی این سلولها پیش از درمان سرطان و پیوند آنها پس از درمان قطعی می‌تواند روش مناسبی برای حفظ باروری کودکان سرطانی که فاقد اسپرم یا بافت بالغ تولید مثلی هستند باشد. از آنجاییکه حفظ باروری بدین روش این مزیت را به همراه دارد که باروری حاصله، فارغ از روش‌های مصنوعی تولید مثلی است و فرد به روند عادی تولید مثلی بر می‌گردد، در صورت بالا بودن درصد موفقیت آن، می‌تواند در مورد مردان بالغ نیز به کار برده شود تا نیازی به روش‌های لقاح مصنوعی در آزمایشگاه نباشد. تشکر و قدردانی در پایان از سرکار خانم معصومه اخلاق پسند که زحمت تایپ این مقاله را متقبل شدند کمال تشکر و قدردانی را داریم. 2 Some cases of male infertility are due to the destructive side-effects of anticancer treatment methods such as chemo and radiotherapies on germ cell lines. The increase in the survival rate of cancer patients who undergo treatment, especially children, has drawn attention to fertility preservation. The most common and effective technique in preserving male fertility is sperm freezing and its subsequent IVF. Children cannot efficiently produce sperm because of their spermatogonial immaturity. One of the strategies to maintain fertility in these patients is to preserve the testes or the germ cells by freezing them for their later maturation and production of fertile sperm, although the state in which the spermatogonia may not undergo maturation is one of the main obstacles faced in this method. Therefore, scientists have attempted to transplant cryopreserved testis tissues or produce in vitro-matured spermatozoa in this group of patients upon anticancer treatment. In this study we reviewed the germ cell biology, the side-effects of chemo and radiotherapies on germ cells and fertility preservation techniques in adults and children undergoing anticancer treatment. 073 85 Arash A Mohazab آرش مهذب Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Mahnaz M Heidari مهناز حیدری Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Sheida Sh Salehkhou شیدا صالح‌خو Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Mahmood M Jeddi-Tehrani محمود جدی‌تهرانی Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Mohammad Mehdi MM Akhondi محمدمهدی آخوندی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran akhondi@avicenna.ac.ir ChemotherapyCryopreservationFertility preservationGerm cell transplantationRadiotherapySpermatogonial transplantation 455.pdf Robey PG. Stem cells near the century mark. J Clin Invest. 2000;105(11):1489-91.##Cowen C, Melton D. Stemness: Definitions, Criteria, and Standards. In: Lanza RP, Hogan B, Melton D, Pedersen R, editors. Essentials of stem cell biology. Burlington: Elsevier Academic Press; 2006.##Simorangkir DR, Marshall GR, Ehmcke J, Schlatt S, Plant TM. Prepubertal expansion of dark and pale type A spermatogonia in the rhesus monkey (Macaca mulatta) results from proliferation during infantile and juvenile development in a relatively gonadotropin independent manner. Biol Reprod. 2005;73(6):1109-15.##van Alphen MM, van de Kant HJ, de Rooij DG. Repopulation of the seminiferous epithelium of the rhesus monkey after X irradiation. Radiat Res. 1988; 113(3):487-500.##Dettin L, Ravindranath N, Hofmann MC, Dym M. Morphological characterization of the spermatogonial subtypes in the neonatal mouse testis. Biol Reprod. 2003;69(5):1565-71.##Wistuba J, Schrod A, Greve B, Hodges JK, Aslam H, Weinbauer GF, et al. Organization of seminiferous epithelium in primates: relationship to spermatogenic efficiency, phylogeny, and mating system. Biol Reprod. 2003;69(2):582-91.##Johnson L, Staub C, Neaves WB, Yanagimachi R. Live human germ cells in the context of their spermatogenic stages. Hum Reprod. 2001;16(8):1575-82.##Ehmcke J, Wistuba J, Schlatt S. Spermatogonial stem cells: questions, models and perspectives. Hum Reprod Update. 2006;12(3):275-82.##Craft I, Bennett V, Nicholson N. Fertilising ability of testicular spermatozoa. Lancet. 1993;342(8875): 864.##Thomson AB, Campbell AJ, Irvine DC, Anderson RA, Kelnar CJ, Wallace WH. Semen quality and spermatozoal DNA integrity in survivors of childhood cancer: a case-control study. Lancet. 2002; 360(9330):361-7.##de Rooij DG, van de Kant HJ, Dol R, Wagemaker G, van Buul PP, van Duijn-Goedhart A, et al. Long-term effects of irradiation before adulthood on reproductive function in the male rhesus monkey. Biol Reprod. 2002;66(2):486-94.##Howell SJ, Shalet SM. Spermatogenesis after cancer treatment: damage and recovery. J Natl Cancer Inst Monogr. 2005;(34):12-7.##Shalet SM, Tsatsoulis A, Whitehead E, Read G. Vulnerability of the human Leydig cell to radiation damage is dependent upon age. J Endocrinol. 1989; 120(1):161-5.##Sabanegh ES Jr, Ragheb AM. Male fertility after cancer. Urology. 2009;73(2):225-31.##Hudson MM. Survivors of childhood cancer: coming of age. Hematol Oncol Clin North Am. 2008; 22(2):211-31.##Heindel JJ. Role of exposure to environmental chemicals in the developmental basis of reproductive disease and dysfunction. Semin Reprod Med. 2006;24(3):168-77.##Lawson CC, Schnorr TM, Daston GP, Grajewski B, Marcus M, McDiarmid M, et al. An occupational reproductive research agenda for the third millennium. Environ Health Perspect. 2003;111(4): 584-92.##Rivkees SA, Crawford JD. The relationship of gonadal activity and chemotherapy-induced gonadal damage. JAMA. 1988;259(14):2123-5.##Meistrich ML, Wilson G, Huhtaniemi I. Hormonal treatment after cytotoxic therapy stimulates recovery of spermatogenesis. Cancer Res. 1999;59(15): 3557-60.##Jafarian A, Akhondi MA, Pezhhan N, Sadeghi MR, Zarnani AH, Salehkhou Sh, et al. Stimulatory effects of Estradiol and FSH on the restoration of spermatogenesis in azoospermic mice. J Reprod Infertil. 2009;9(4):317-25.##Akbarzadeh Najar R, Akhondi MA, Parivar K, Jeddi-Tehrani M, Sadeghi MR, Djavadi E, et al. The effects of Human Chorionic Gonadotropin on germ cell maturation and testosterone secretion in neonatal mouse testis. J Reprod Infertil. 2006;7(3): 209-17.##Revel A, Revel-Vilk S. Pediatric fertility preservation: is it time to offer testicular tissue cryopreservation? Mol Cell Endocrinol. 2008;282(1-2): 143-9.##van Casteren NJ, van Santbrink EJ, van Inzen W, Romijn JC, Dohle GR. Use rate and assisted reproduction technologies outcome of cryopreserved semen from 629 cancer patients. Fertil Steril. 2008;90(6):2245-50.##Lansac J, Royere D. Follow-up studies of children born after frozen sperm donation. Hum Reprod Update. 2001;7(1):33-7.##Schlatt S, Kim SS, Gosden R. Spermatogenesis and steroidogenesis in mouse, hamster and monkey testicular tissue after cryopreservation and heterotopic grafting to castrated hosts. Reproduction. 2002;124(3):339-46.##Schlatt S, Honaramooz A, Ehmcke J, Goebell PJ, Rübben H, Dhir R, et al. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Hum Reprod. 2006;21(2):384-9.##Honaramooz A, Behboodi E, Blash S, Megee SO, Dobrinski I. Germ cell transplantation in goats. Mol Reprod Dev. 2003;64(4):422-8.##Honaramooz A, Megee SO, Dobrinski I. Germ cell transplantation in pigs. Biol Reprod. 2002;66(1): 21-8.##Honaramooz A, Li MW, Penedo MC, Meyers S, Dobrinski I. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biol Reprod. 2004;70(5):1500-3.##Schrader M, Muller M, Straub B, Miller K. Testicular sperm extraction in azoospermic patients with gonadal germ cell tumors prior to chemotherapy--a new therapy option. Asian J Androl. 2002;4(1):9-15.##Keros V, Hultenby K, Borgström B, Fridström M, Jahnukainen K, Hovatta O. Methods of cryopreservation of testicular tissue with viable spermatogonia in pre-pubertal boys undergoing gonadotoxic cancer treatment. Hum Reprod. 2007;22(5):1384-95.##Wyns C, Curaba M, Martinez-Madrid B, Van Langendonckt A, François-Xavier W, Donnez J. Spermatogonial survival after cryopreservation and short-term orthotopic immature human cryptorchid testicular tissue grafting to immunodeficient mice. Hum Reprod. 2007;22(6):1603-11.##Luetjens CM, Stukenborg JB, Nieschlag E, Simoni M, Wistuba J. Complete spermatogenesis in orthotopic but not in ectopic transplants of autologously grafted marmoset testicular tissue. Endocrinology. 2008;149(4):1736-47.##Sofikitis N, Pappas E, Kawatani A, Baltogiannis D, Loutradis D, Kanakas N, et al. Efforts to create an artificial testis: culture systems of male germ cells under biochemical conditions resembling the seminiferous tubular biochemical environment. Hum Reprod Update. 2005;11(3):229-59.##Zeng W, Avelar GF, Rathi R, Franca LR, Dobrinski I. The length of the spermatogenic cycle is conserved in porcine and ovine testis xenografts. J Androl. 2006;27(4):527-33.##Zeng W, Rathi R, Pan H, Dobrinski I. Comparison of global gene expression between porcine testis tissue xenografts and porcine testis in situ. Mol Reprod Dev. 2007;74(6):674-9.##Fujita K, Tsujimura A, Hirai T, Ohta H, Matsuoka Y, Miyagawa Y, et al. Effect of human leukemia cells in testicular tissues grafted into immuno-deficient mice. Int J Urol. 2008;15(8):733-8.##Brinster RL, Avarbock MR. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91 (24):11303-7.##Brinster RL, Zimmermann JW. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(24):11298-302.##Akbarzadeh Najar R, Jeddi-Tehrani M, Sadeghi MR, Zarnani AH, Salehkhou SH, Hoseinzadeh F, et al. Spermatogonial Stem Cell Transplantation in Mice. Tehran Univ Med J. 2008;65(Suppl 3):1-10.##Avarbock MR, Brinster CJ, Brinster RL. Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells. Nat Med. 1996;2(6):693-6.##Nagano M, Avarbock MR, Leonida EB, Brinster CJ, Brinster RL. Culture of mouse spermatogonial stem cells. Tissue Cell. 1998;30(4):389-97.##Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Restoration of fertility in infertile mice by transplantation of cryopreserved male germline stem cells. Hum Reprod. 2003;18(12):2660-7.##Dobrinski I. Transplantation of germ line stem cells for the study and manipulation of spermatogenesis. Ernst Schering Res Found Workshop. 2006;(60):175-93.##Hermann BP, Sukhwani M, Lin CC, Sheng Y, Tomko J, Rodriguez M, et al. Characterization, cryopreservation, and ablation of spermatogonial stem cells in adult rhesus macaques. Stem Cells. 2007;25(9):2330-8.##Radford J. Restoration of fertility after treatment for cancer. Horm Res. 2003;59 Suppl 1:21-3.##Geens M, Goossens E, De Block G, Ning L, Van Saen D, Tournaye H. Autologous spermatogonial stem cell transplantation in man: current obstacles for a future clinical application. Hum Reprod Update. 2008;14(2):121-30.##Hovatta O. Cryopreservation of testicular tissue in young cancer patients. Hum Reprod Update. 2001; 7(4):378-83.##Kvist K, Thorup J, Byskov AG, Hoyer PE, Mollgard K, Yding Andersen C. Cryopreservation of intact testicular tissue from boys with cryptorchidism. Hum Reprod. 2006;21(2):484-91.##Yoshinaga K, Nishikawa S, Ogawa M, Hayashi S, Kunisada T, Fujimoto T, et al. Role of c-kit in mouse spermatogenesis: identification of spermatogonia as a specific site of c-kit expression and function. Development. 1991;113(2):689-99.##Dym M, Kokkinaki M, He Z. Spermatogonial stem cells: mouse and human comparisons. Birth Defects Res C Embryo Today. 2009;87(1):27-34.##Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL. Spermatogonial stem cells share some, but not all, phenotypic and functional characteristics with other stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11): 6487-92.##von Schönfeldt V, Krishnamurthy H, Foppiani L, Schlatt S. Magnetic cell sorting is a fast and effective method of enriching viable spermatogonia from Djungarian hamster, mouse, and marmoset monkey testes. Biol Reprod. 1999;61(3): 582-9.##Jahnukainen K, Hou M, Petersen C, Setchell B, Söder O. Intratesticular transplantation of testicular cells from leukemic rats causes transmission of leukemia. Cancer Res. 2001;61(2):706-10.##Fujita K, Ohta H, Tsujimura A, Takao T, Miyagawa Y, Takada S, et al. Transplantation of spermatogonial stem cells isolated from leukemic mice restores fertility without inducing leukemia. J Clin Invest. 2005;115(7):1855-61.##Geens M, Van de Velde H, De Block G, Goossens E, Van Steirteghem A, Tournaye H. The efficiency of magnetic-activated cell sorting and fluorescence-activated cell sorting in the decontamination of testicular cell suspensions in cancer patients. Hum Reprod. 2007;22(3):733-42.##Dirami G, Ravindranath N, Pursel V, Dym M. Effects of stem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM. Biol Reprod. 1999;61(1):225-30.##Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(47):16489-94.##Jeong D, McLean DJ, Griswold MD. Long-term culture and transplantation of murine testicular germ cells. J Androl. 2003;24(5):661-9.##Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod. 2003;69(2):612-6.##Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K, Ogonuki N, Toyokuni S, Ogura A, et al. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions. Biol Reprod. 2005;72(4): 985-91.##Sadri-Ardekani H, Mizrak SC, van Daalen SK, Korver CM, Roepers-Gajadien HL, Koruji M, et al. Propagation of human spermatogonial stem cells in vitro. JAMA. 2009;302(19):2127-34.##Lim JJ, Sung SY, Kim HJ, Song SH, Hong JY, Yoon TK, et al. Long-term proliferation and characterization of human spermatogonial stem cells obtained from obstructive and non-obstructive azoospermia under exogenous feeder-free culture conditions. Cell Prolif. 2010;43(4):405-17.##Robey PG. Stem cells near the century mark. J Clin Invest. 2000;105(11):1489-91.##

Common Techniques for Preserving Fertility in Girls and Young Women Undergoing Cancer Treatment 2 1 زمینه و هدف زنان جوان مبتلا به سرطان که تحت شیمی درمانی یا اشعه درمانی قرار می‌گیرند با خطر از کار افتادن تخمدانها و ناباروری (به دلیل حساسیت تخمدان به عوامل شیمی درمانی از جمله داروهای آلکیلاسیون و پرتوهای یونیزان) مواجه هستند (1). در واقع تعداد زیادی از این افراد پس از درمان سرطان نابارور می‌شوند. امروزه با پیشرفت‌هایی که در زمینه درمان سرطان صورت گرفته امکان درمان موفق و بقا افراد مبتلا به سرطان افزایش یافته است؛ بنابراین حفظ کیفیت زندگی این افراد پس از درمان، اهمیت زیادی دارد (2،3). یکی از مسائل مهم در رابطه با زنان جوان مبتلا به سرطان، حفظ قدرت باروری آنها است. روش‌های محدودی در رابطه با حفظ قدرت باروری در این افراد وجود دارد که شامل جابجائی تخمدان، انجماد جنین، انجماد تخمک و انجماد بافت تخمدان است. انتخاب یکی از این روشها بستگی به عوامل مختلفی از جمله نوع سرطان، سن بیمار، نوع و زمان شیمی درمانی، وضعیت تاهل فرد و ..... دارد (1،2). هدف از این مطالعه بررسی و ارزیابی روش‌های مختلف حفظ باروری در دختران و زنان جوان مبتلا به سرطان است. روش بررسی در این بررسی، مقالات منتشر شده در رابطه با روش‌های مختلف حفظ باروری از سال 1976 تا 2009 که امکان دسترسی به مقاله کامل آنها از طریق منابع اطلاعاتی مختلفی از جمله PubMed و Science Direct وجود داشت جمع‌آوری و مورد بررسی قرار گرفت که در ذیل به آنها پرداخته می‌شود: جابجایی تخمدان : استفاده از روش جابجایی تخمدان به منظور حفظ باروری اولین بار در سال 1958 صورت گرفت (4،5). در این روش تخمدانها از محل خود خارج و به ناحیه دیگر از بدن پیوند زده می‌شوند تا تخمدانها از اثرات مستقیم پرتوهای یونیزان که در رادیوتراپی به ناحیه شکم به منظور درمان سرطان استفاده می‌شود محافظت گردند. میزان موفقیت در حفظ باروری در این روش بین 16 تا 90% است (10-6). این طیف گسترده در میزان موفقیت ناشی از درجه پراکندگی تابش، وضعیت رگها، سن بیماران، دز تابش داده شده، اینکه آیا تخمدانها در طی رادیوتراپی حفاظت شده‌اند آیا شیمی درمانی همراه با اشعه درمانی بوده، آیا براکی تراپی واژینال با اشعه درمانی لگن همراه بوده یا خیر می‌باشد (13-8). در یک بررسی انجام شده در مورد جابجایی تخمدان که روی ده بیمار مبتلا به هوچکین انجام شده بود دز تابش لگنی از cGy1500 تا 3500 بود. پنج بیماری که شیمی درمانی نشده، یا حداقل شیمی درمانی را دریافت کرده بودند پس از اشعه درمانی، عملکرد طبیعی تخمدان را نشان داده و چهار نفر از آنها باردار شدند. در مقابل، چهار بیماری که دوره‌های متعدد شیمی درمانی داشتند و بیماری که اشعه درمانی با دوز cGy3500 را دریافت کرده بود، اختلال در عملکرد تخمدان را نشان دادند. گرچه جابجایی تخمدان خطر از کار افتادن تخمدان را کاهش می‌دهد؛ اما تخمدانها باز هم در معرض خطر گرفتن پرتوهای یونیزان (علیرغم حفاظت) هستند که این مسئله ناشی از پراکندگی تابش و عبور از حفاظ به مقدار 15±8% در کل تابش لگنی می‌باشد (13). در این روش، بیمار عوارضی چون انفارکتوس لوله فالوپین ، درد مزمن تخمدان و تشکیل کیست تخمدانی را نشان می‌دهد که باعث جراحی‌های ژینکولوژیک بعدی می‌شود. به علاوه این بیماران در آینده برای باروری نیازمند روش‌های کمک باروری هستند (9،13،14). بنابراین بیماران کاندیدای این روش باید به دقت براساس کلیه متغیرهای اثرگذار بر میزان موفقیت در این روش انتخاب شوند. همچنین هنگامی که علاوه بر اشعه درمانی از شیمی درمانی هم استفاده شود این روش کارایی چندانی در حفظ باروری ندارد. انجماد جنین : از دهه 1980 انجماد و نگهداری جنین به صورت روشی معمول مورد استفاده قرار گرفته است (15،16). در بیماران مبتلا به سرطان با استفاده از روش‌های کمک باروری می‌توان جنین‌هایی را برای استفاده در آینده ذخیره نمود به شرط آنکه بیمار متاهل بوده و زمان کافی قبل از شروع درمان سرطان برای انجام روش‌های کمک باروری یا لقاح خارج رحمی و ذخیره جنین داشته باشد. میزان بقا هر جنین پس از ذوب بین 35 تا 90% و میزان بقا پیوند بین 8 تا 30% است که میزان بارداری نهایی می‌تواند حدود 60% باشد (18-16، 4،5). از آنجائیکه در سیکل‌های کمک باروری پس از تحریک تخمک گذاری به طور معمول، سطح استرادیول به ده برابر میزان طبیعی می‌رسد، در برخی از سرطانها نظیر سرطان پستان این روش توصیه نمی‌شود (15). انجماد جنین تکنیکی با کارایی بالا است؛ اما تنها در بیمارانی که بتوان از آنها تخمک‌های بالغ گرفت و زمان کافی قبل از شروع درمان سرطان برای جمع‌آوری تخمک را داشته، همچنین دارای زوج بوده یا خواستار استفاده از اهدا اسپرم باشند قابل استفاده است (15،16،18). به طور کلی روش انجماد جنین، روشی معمول و قابل اجرا در اکثر مراکز درمان ناباروری است؛ اما محدودیت‌های این روش شامل موارد زیر است: هنگامیکه شروع درمان سرطان قابل تاخیر نباشد؛ بنابراین زمانی برای تحریک تخمدان جهت گرفتن تخمک وجود ندارد؛ همچنین زمانی که تحریک تخمدان برای بیمار مضر باشد و یا در مواردی که فرد مجرد است و یا تمایلی به استفاده از اهدا اسپرم نداشته باشد انجام این روش امکانپذیر نیست. علاوه بر موارد فوق تعداد تخمکها و در نتیجه جنین‌های به‌دست آمده در این روش محدود می‌باشد که این مسئله باعث کاهش شانس بارداری فرد در آینده می‌شود. علاوه بر این انجماد جنین در روش کمک باروری، هزینه بر و درصد موفقیت پائین است، احتمال تولد در انتقال جنین‌های منجمد و ذوب شده تقریباً یازده درصد گزارش شده است (15،16،18). انجماد تخمک بالغ و نابالغ : از آنجائیکه روش انجماد جنین در دختران و زنان مجرد امکان پذیر نیست. روش انجماد تخمک بالغ و نابالغ می‌تواند در این بیماران (به شرط داشتن زمان کافی قبل از شروع درمان سرطان برای تحریک تخمدانها و گرفتن تخمک از آنها) استفاده شود. بر خلاف انجماد جنین و اسپرم نتایج اولیه در مورد بقا، باروری و بارداری در انجماد تخمک ناامید کننده بود (19). اولین مورد تولد نوزاد با استفاده از این روش به دهه 1980 بر می‌گردد (20). انجماد تخمک بالغ : از جنبه تئوری این روش مناسب‌ترین راه برای ذخیره سلول‌های بنیادی است. اما روش تحریک تخمدان و جمع‌آوری تخمک در کودکان امکان‌پذیر نیست (21،22). شانس باروری در تحقیقات اولیه انجام شده با این روش بسیار اندک بود. چرا که از زمان اولین گزارش نوزاد زنده با این روش علیرغم پیشرفت‌های انجام شده در زمینه تکنیک‌های حفظ بقا تخمک، میزان موفقیت کمتر از 2% گزارش شده است (23،24). اطلاعات جمع‌آوری شده از 21 بررسی انجام شده توسط Sonmezer و Oktay در سال 2004 نشان می‌دهد که میزان متوسط بقا 47%، میزان متوسط باروری 5/52% میزان متوسط بارداری برای هر تخمک ذوب شده 52/1% است. اطلاعات اخیر همچنین نشان می‌دهد گرچه ترکیب روش‌های مختلف، میزان بقا تخمکها را افزایش می‌دهد؛ اما این روش هنوز از استاندارد بالایی در رابطه با کیفیت درمانی برخوردار نیست (25). در بررسی دیگری که توسطBorini روی 927 تخمک انجام شد تنها در 18 تخمک باروری کلینکی انجام گرفت. مطالعات نشان می‌دهد که تخمک در مرحله متافاز II، سلولی بسیار تمایز یافته و بی‌نهایت شکننده است. انجماد تخمک باعث انواع مختلفی از آسیب‌های سلولی می‌شود که ممکن است بیان کننده میزان بقا پائین آن باشد (26). دو علت برای عدم موفقیت انجماد تخمک‌های بالغ وجود دارد: اول اینکه، زونا پلاسیدا در طی فرایند انجماد احتمالاً به علت اگزوسیتوز پیش از بلوغ گرانول‌های کورتیکال سخت می‌شود. این مسئله به صورت سدی عمل می‌کند که از نفوذ اسپرم و باروری طبیعی جلوگیری می‌نماید؛ البته با کمک تکنیک‌های تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) می‌توان این مشکل را تا حدودی حل نمود (29-27). دوم اینکه، در تخمک‌های بالغ، کروموزوم‌های متافازی بوسیله دوک متافازی در صفحه استوایی قرار می گیرند، که بر اثر تشکیل یخ درون سلولی، سیستم دوکی سلول در طی فرایند انجماد و ذوب آسیب می‌بیند (30). در طی فرایند انجماد سرد شدن سلول، باعث القا دپلیمره شدن دوک میتوزی (که یک ساختار دینامیکی است) و در نتیجه آناپلوئیدی می‌شود. دو مرحله اصلی فرایند انجماد شامل سرد کردن (کاهش دما از دمای فیزیولوژیکی تا نقطه انجماد) و انجماد (کاهش بعدی تا دمای ذخیره (ازت مایع در C196-)) است. آسیب‌های سرد کردن می‌تواند باعث تغییر ساختار غشاها و حفظ تمامیت آن شود این مسئله می‌تواند بر میکروتوبول‌های تخمکها و ساختار سیتواسکلتون اثر بگذارد (33-31). این مسئله همچنین باعث تغییر خواص غشا و آسیب گسترده سلولی در طی فرآیند انجماد می‌شود (36-34). بنابراین ایجاد بانک تخمک به دلیل میزان پائین موفقیت در باروری تخمک‌های منجمد شده محدود است؛ چرا که همانگونه که گفته شد تخمکها به سرد کردن حساس هستند و در طی فرایند انجماد و ذوب مستعد آسیب سیتواسکلتون و آناپلوئیدی بوده که ممکن است منجر به از دست دادن بقا آنها شود. گرچه روش‌های مختلف انجماد نظیر انجماد فوق سریع ممکن است مزایایی نسبت به روش‌های سرد کردن آرام داشته باشد و میزان بقا پس از ذوب بافت بیشتر باشد؛ اما این مسئله هنوز نیازمند بررسی‌های بیشتری است (34،36). البته ارزیابی بهتر غلظت‌های سوکورز در محیط انجماد هم می‌تواند منجر به بهبود فرایند انجماد در آینده گردد (25). به طور کلی انجماد تخمک بالغ یک روش جایگزین برای حفظ باروری زنان جوان مجرد مبتلا به سرطان با همان ویژگی داوطلبین استفاده از روش انجماد جنین است. انجماد تخمک نابالغ : به نظر می‌رسد که تخمک‌های نابالغ به دلیل حجم کوچک‌تر و فقدان دوک متافازی به آسیب‌های فرآیند انجماد مقاومتر هستند. معهذا ناهنجاری‌های دوکی، فشردگی‌های کروموزومی ناحیه‌ای پس از به بلوغ رساندن تخمک‌های فاز ژرمینال در محیط کشت مشاهده شده (37)، تنها چند مورد محدود باروری با استفاده از تخمک‌های نابالغ تاکنون گزارش شده است (38،39). بقا تخمکها در فرآیند انجماد در مرحله دیپلوتن پروفاز I یا مرحله ژرمینال، بهتر از مرحله متافاز II است (38). این سلولها در این مرحله به اندازه کامل خود و کفایت کامل میتوزی خود رسیده‌اند؛ اما هنوز فرآیند بلوغشان کامل نشده است و متافاز ثانویه خود را شروع ننموده‌اند. گرچه خطر سخت شدن زونا پلاسیدا یا آسیب به سیتواسکلتون اجتناب نا‌پذیر است، احتمال دارد که فقدان دوک میتوزی و حضور غشا هسته‌ای باعث حفاظت کروماتین و ناهنجاری‌های سیتوژنیک در طی تقسیم‌های سلولی بعدی شود. بنابراین انجماد تخمک‌های نابالغ و بدنبال آن بلوغ در محیط کشت از جنبه تئوری مزایایی دارد (8). اما این روش هنوز به مرحله ایده‌آل نرسیده (40)، دستیابی همزمان به تکامل هسته‌ای و تکامل سیتوپلاسمی در محیط کشت بسیار مشکل است. گرچه گزارشاتی از دستیابی به باروری پس از بلوغ در محیط کشت تخمک‌های تازه در مرحله ژرمینال وجود دارد (41). تنها یک مورد تولد زنده از یک تخمک منجمد شده نابالغ در مرحله ژرمینال بدنبال بلوغ در محیط کشت گزارش شده (42)، یک بارداری هم از یک تخمک منجمد شده نابالغ که منتهی به یک جنین دوازده هفته ای شده وجود دارد (43). گرچه انجماد تخمک اخیراً در چند مرکز کلینیکی عملاً اجرا می‌شود (29،44)؛ اما بر طبق مطالعه مروری انجام شده توسط Kim، انجماد تخمکها در مرحله ژرمینال، تا زمانی که بلوغ تخمک‌های نابالغ در محیط کشت از سطح استاندارد بالاتری برخوردار شود عملی نیست (45). انجماد بافت تخمدان : عمل انجماد بافت تخمدان به دهه 1950 بر می‌گردد. شروع مطالعات در این زمینه بسیار ناامید کننده بود. پس از پیشرفت‌های انجام شده در زمینه مواد ضد یخ نظیر اتیلن گلیگول، DMSO وپروپاندیول و دستگاه‌های اتوماتیک cryopreservation این بررسیها مجدداً بر روی گونه‌های مختلف حیوانی تکرار شد که میزان موفقیت در این زمان افزایش قابل ملاحظه‌ای داشت (48-46). تاکنون بافت تخمدان به طور موفقیت‌آمیزی در موش، خرگوش، گوسفند و میمون منجمد و مجداً به آنها پیوند شده (51-49) ، کارهای انجام شده در مورد انسان نیز رضایت بخش بوده (52)، اولین جنین تولید شده به دنبال پیوند زیر جلدی بافت تخمدان منجمد شده توسط Oktay و همکاران در سال 2004 گزارش شد. برای بیمارانی که نیازمند شیمی درمانی فوری هستند انجماد کورتکس تخمدان احتمالاً تنها روش برای حفظ باروری است. در این روش فراگمنت‌هایی از کورتکس تخمدان جدا و منجمد شده تا پس از درمان و بهبود بیمار جهت باروری مجدا به حفره لگنی یا یک جایگاه هتروتوپیک پیوند شود (56-52). کورتکس تخمدان حاوی فولیکول‌های اولیه یا تخمک‌های مهار شده در پروفاز دیپلوتن اولین تقسیم میتوزی هستند. به نظر می‌رسد که نسبت سطح به حجم نسبتاً بالا، سطح متابولیک پائین و فقدان زونا پلوسیدا در فولیکول‌های اولیه آنها را نسبت به آسیب‌های ناشی از انجماد مقاومتر می‌سازد. علی‌رغم چند مورد گزارش تولد نوزاد سالم با این روش مسائل زیادی در رابطه با پیوند موفق چنین قطعاتی وجود دارد که از میان آنها ایسکمی ایجاد شده تا زمان رگزایی به بافت پیوند شده، یکی از مهمترین آنهاست. مطالعات زیادی نشان داده که آپوپتوز و کاهش قابل ملاحظه دانسیته فولیکولی در کورتکس تخمدان پیوند شده اساساً ناشی از آسیب ایسکمیک است تا آسیب ناشی از ذوب/ انجماد (2،57،58). میزان کاهش فولیکول‌های اولیه در بافت تخمدان منجمد شده پس از پیوند بین 50 تا 65% در برخی مطالعات (59) و پیش از 90% در یک مطالعه گزارش شده است (60). از معایب دیگر این روش امکان انتقال سلول‌های تورموی در صورت درگیر شدن بافت تخمدان به تومور می‌باشد (61). شاید شناسائی تومور مارکرها (نظیرSortilin1) به منظور تشخیص سلول‌های سرطانی بافت تخمدان راه حل مناسبی برای جلوگیری از انتقال سلول‌های سرطانی هنگام انتقال بافت تخمدان باشد (62). بحث روش‌های حفظ باروری در کودکان و زنان جوان مبتلا به سرطان در حال رشد است. به استثنا روش انجماد جنین، همه روش‌های حفظ باروری در زنان هنوز در مرحله آزمایش هستند؛ اما اکثر بیماران قادر به استفاده از روش انجماد جنین به دلایل مختلف از جمله عدم تاخیر در شروع درمان سرطان، خطرناک بودن تحریک هورمونی در برخی سرطانها نظیر سرطان پستان و مجرد بودن، نیستند. همچنین این روش در کودکان قابل استفاده نیست. به نظر می‌رسد روش انجماد کورتکس تخمدان از میان روش‌های ذکر شده مناسب‌تر باشد. از مزایای این روش می‌توان از عدم تاخیر در شروع درمان سرطان، امکان استفاده از آن در کودکان و تعداد زیاد فولیکول‌های به دست آمده در مراحل مختلف تکوینی را (که شانس موفقیت در بارداری را افزایش می‌دهد) نام برد، اما این روش معایبی نیز دارد که از آن جمله می‌توان به کاهش قابل ملاحظه دانسیته فولیکولی تا زمان رگزایی مجدد به بافت پیوند شده و امکان انتقال سلول‌های توموری در صورت درگیری بافت تخمدان به تومور، را نام برد. لذا انجام تحقیقات در زمینه دستیابی به روش‌های تسهیل فرایند رگزائی به بافت پیوند شده به منظور کاهش آسیب‌های ایسکمیک ضروری به نظر می‌رسد. همچنین استفاده از شیوه‌های تشخیصی مناسب به منظور شناسائی و جلوگیری از بازگشت سلول‌های سرطانی از طریق انجام پیوند بافت تخمدان (در صورت درگیر شدن بافت تخمدان به سلول‌های سرطانی) از دیگر موضوعات قابل تامل است. از آنجائیکه روش‌های محدودی برای حفظ باروری در زنان مبتلا به سرطان وجود دارد، انتخاب یکی از این روشها بسیار وابسته به سن بیمار، زمان در دسترس قبل از شروع درمان، وضعیت تاهل فرد، نوع سرطان و احتمال درگیری تخمدان به سلول‌های توموری است. 2 Current protocols for cancer treatment could lead to the failure of ovarian function and subsequent infertility in women. Therefore, utilizing ways to preserve fertility in these individuals seem to be essential. In this review, the full-text of articles which were accessible and had been published during 1976 to 2009 about different methods of female fertility preservation were collected and studied through various online databases such as PubMed, Science Direct, etc. According to the reviewed articles, there are several methods for fertility preservation in women, including ovarian transposition and oocyte, embryo and ovarian cortex cryopreservation. Ovarian transposition is not useful for preserving fertility in women who undergo chemo-therapy. Embryo and oocyte cryopreservations require a delay before starting treat-ment. Metaphase II oocytes are high-volume and fully-differentiated cells which may sustain injury due to the freezing process restricting the number of collected oocytes and reducing the chances of fertility. On the other hand, ovarian stimulation and oocyte collection are not practical in young patients, especially in underage girls. In addition to the restrictions on the number of collected embryos and the raised legal and ethical issues, embryo crypreservation is limited to adults and married women. In comparison to other methods, cryopreservation of the ovarian cortex seems to be more appropriate as ovarian tissue is resistant to cryopreservation and it is easy to be collected by laprascopy, making it practical for use in premature girls. Furthermore, the large number of follicles in the ovarian tissue increases the chances of fertility preservation in women. In general, several parameters including the type, time and duration of treatment, cancer type, age and marital status determine the efficacy of each method. 085 93 Maryam M Hormozi مریم هرمزی Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Mehdi M Akbarpour مهدی اکبرپور Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Ladan L Hosseini Gohari لادن حسینی گوهری Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Mahnaz M Heidari مهناز حیدری Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Sheida Sh Salehkhou شیدا صالح‌خو Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Mahmood M Jeddi-Tehrani محمود جدی‌تهرانی Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Amir Hassan AH Zarnani امیرحسن زرنانی Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR) Iran Mohsen M Firouzray محسن فیروزرای Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences Iran Mohammad Mehdi MM Akhondi محمدمهدی آخوندی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran akhondi@avicenna.ac.ir Cancer treatmentEmbryo cryopreservationFertility preservationOvarian transposition 449.pdf Jadoul P, Donnez J, Dolmans MM, Squifflet J, Lengele B, Martinez-Madrid B. Laparoscopic ovaryectomy for whole human ovary cryopreservation: technical aspects. Fertil Steril. 2007;87(4):971-5.##Yang H, Lee HH, Lee HC, Ko DS, Kim SS. Assessment of vascular endothelial growth factor expression and apoptosis in the ovarian graft: can exogenous gonadotropin promote angiogenesis after ovarian transplantation? Fertil Steril. 2008;90(4 Suppl): 1550-8.##Kormi Nouri R, Akhondi MA, Behjati Ardekani Z. Psychological aspects of infertility from viewpoint of infertility treating physicians. J Reprod Infertil. 2001;2(3):13-26.##Frederick JL, Ord T, Kettel LM, Stone SC, Balmaceda JP, Asch RH. Successful pregnancy outcome after cryopreservation of all fresh embryos with subsequent transfer into an unstimulated cycle. Fertil Steril. 1995;64(5):987-90.##Selick CE, Hofmann GE, Albano C, Horowitz GM, Copperman AB, Garrisi GJ, et al. Embryo quality and pregnancy potential of fresh compared with frozen embryos--is freezing detrimental to high quality embryos? Hum Reprod. 1995;10(2):392-5.##Bisharah M, Tulandi T. Laparoscopic preservation of ovarian function: an underused procedure. Am J Obstet Gynecol. 2003;188(2):367-70.##Clough KB, Goffinet F, Labib A, Renolleau C, Campana F, de la Rochefordiere A, et al. Laparoscopic unilateral ovarian transposition prior to irradiation: prospective study of 20 cases. Cancer. 1996; 77(12):2638-45.##Hunter MC, Glees JP, Gazet JC. Oophoropexy and ovarian function in the treatment of Hodgkin's disease. Clin Radiol. 1980;31(1):21-6.##Meirow D, Nugent D. The effects of radiotherapy and chemotherapy on female reproduction. Hum Reprod Update. 2001;7(6):535-43.##Morice P, Juncker L, Rey A, El-Hassan J, HaieMeder C, Castaigne D. Ovarian transposition for patients with cervical carcinoma treated by radiosurgical combination. Fertil Steril. 2000;74(4):743-8.##Feeney DD, Moore DH, Look KY, Stehman FB, Sutton GP. The fate of the ovaries after radical hysterectomy and ovarian transposition. Gynecol Oncol. 1995;56(1):3-7.##Thomas PR, Winstanly D, Peckham MJ, Austin DE, Murray MA, Jacobs HS. Reproductive and endocrine function in patients with Hodgkin's disease: effects of oophoropexy and irradiation. Br J Cancer. 1976;33(2):226-31.##Williams RS, Littell RD, Mendenhall NP. Laparoscopic oophoropexy and ovarian function in the treatment of Hodgkin disease. Cancer. 1999;86 (10):2138-42.##Gabriel DA, Bernard SA, Lambert J, Croom RD 3rd. Oophoropexy and the management of Hodgkin's disease. A reevaluation of the risks and benefits. Arch Surg. 1986;121(9):1083-5.##Chen CH, Zhang X, Barnes R, Confino E, Milad M, Puscheck E, et al. Relationship between peak serum estradiol levels and treatment outcome in in vitro fertilization cycles after embryo transfer on day 3 or day 5. Fertil Steril. 2003;80(1):75-9.##Son WY, Yoon SH, Yoon HJ, Lee SM, Lim JH. Pregnancy outcome following transfer of human blastocysts vitrified on electron microscopy grids after induced collapse of the blastocoele. Hum Reprod. 2003;18(1):137-9.##Senn A, Vozzi C, Chanson A, De Grandi P, Germond M. Prospective randomized study of two cryopreservation policies avoiding embryo selection: the pronucleate stage leads to a higher cumulative delivery rate than the early cleavage stage. Fertil Steril. 2000;74(5):946-52.##Wang JX, Yap YY, Matthews CD. Frozen-thawed embryo transfer: influence of clinical factors on implantation rate and risk of multiple conception. Hum Reprod. 2001;16(11):2316-9.##Oktay K, Kan MT, Rosenwaks Z. Recent progress in oocyte and ovarian tissue cryopreservation and transplantation. Curr Opin Obstet Gynecol. 2001; 13(3):263-8.##Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet. 1986;1(8486):884-6.##Oktay K, Newton H, Mullan J, Gosden RG. Development of human primordial follicles to antral stages in SCID/hpg mice stimulated with follicle stimulating hormone. Hum Reprod. 1998;13(5): 1133-8.##Torrents E, Boiso I, Barri PN, Veiga A. Applications of ovarian tissue transplantation in experi-mental biology and medicine. Hum Reprod Update. 2003;9(5):471-81.##Boldt J, Tidswell N, Sayers A, Kilani R, Cline D. Human oocyte cryopreservation: 5-year experience with a sodium-depleted slow freezing method. Reprod Biomed Online. 2006;13(1):96-100.##Stachecki JJ, Cohen J. An overview of oocyte cryopreservation. Reprod Biomed Online. 2004;9 (2):152-63.##Borini A, Sciajno R, Bianchi V, Sereni E, Flamigni C, Coticchio G. Clinical outcome of oocyte cryopreservation after slow cooling with a protocol utilizing a high sucrose concentration. Hum Reprod. 2006;21(2):512-7.##Van der Elst J. Oocyte freezing: here to stay? Hum Reprod Update. 2003;9(5):463-70.##Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rocchetta G, Venturoli S, Flamigni C. Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum Reprod. 2001;16(3):411-6.##Gook DA, Schiewe MC, Osborn SM, Asch RH, Jansen RP, Johnston WI. Intracytoplasmic sperm injection and embryo development of human oocytes cryopreserved using 1,2-propanediol. Hum Reprod. 1995;10(10):2637-41.##Porcu E, Fabbri R, Seracchioli R, Ciotti PM, Magrini O, Flamigni C. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil Steril. 1997;68 (4):724-6.##Pickering SJ, Braude PR, Johnson MH, Cant A, Currie J. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertil Steril. 1990; 54(1):102-8.##Albertini DF, Eppig JJ. Unusual cytoskeletal and chromatin configurations in mouse oocytes that are atypical in meiotic progression. Dev Genet. 1995; 16(1):13-9.##Ghetler Y, Yavin S, Shalgi R, Arav A. The effect of chilling on membrane lipid phase transition in human oocytes and zygotes. Hum Reprod. 2005;20 (12):3385-9.##Vajta G, Holm P, Kuwayama M, Booth PJ, Jacobsen H, Greve T, et al. Open Pulled Straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol Reprod Dev. 1998;51(1):53-8.##Katayama KP, Stehlik J, Kuwayama M, Kato O, Stehlik E. High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertil Steril. 2003;80(1):223-4.##Mandelbaum J, Anastasiou O, Lévy R, Guérin JF, de Larouzière V, Antoine JM. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004;113 Suppl 1:S17-23.##Yoon TK, Chung HM, Lim JM, Han SY, Ko JJ, Cha KY. Pregnancy and delivery of healthy infants developed from vitrified oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril. 2000;74(1):180-1.##Park SE, Son WY, Lee SH, Lee KA, Ko JJ, Cha KY. Chromosome and spindle configurations of human oocytes matured in vitro after cryopreservation at the germinal vesicle stage. Fertil Steril. 1997;68(5):920-6.##Boiso I, Martí M, Santaló J, Ponsá M, Barri PN, Veiga A. A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum Reprod. 2002;17(7): 1885-91.##Wu J, Zhang L, Wang X. In vitro maturation, fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes. Reproduction. 2001;121(3):389-93.##Cha KY, Chian RC. Maturation in vitro of imamture human oocytes for clinical use. Hum Reprod Update. 1998;4(2):103-20.##Trounson A, Wood C, Kausche A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil Steril. 1994;62(2): 353-62.##Tucker MJ, Wright G, Morton PC, Massey JB. Birth after cryopreservation of immature oocytes with subsequent in vitro maturation. Fertil Steril. 1998;70(3):578-9.##Kan A, Kilani S, Tilia L, Mitchell F, Burns K, Chapman M. Pregnancy from intracytoplasmic injection of a frozen-thawed oocyte. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2004;44(3):262-3.##Fadini R, Brambillasca F, Renzini MM, Merola M, Comi R, De Ponti E, et al. Human oocyte cryopreservation: comparison between slow and ultrarapid methods. Reprod Biomed Online. 2009;19 (2):171-80.##Kim SS. Fertility preservation in female cancer patients: current developments and future directions. Fertil Steril. 2006;85(1):1-11.##Gosden RG, Baird DT, Wade JC, Webb R. Restoration of fertility to oophorectomized sheep by ovarian autografts stored at -196 degrees C. Hum Reprod. 1994;9(4):597-603.##Liu J, Van der Elst J, Van den Broecke R, Dhont M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biol Reprod. 2001;64(1):171-8.##Sztein J, Sweet H, Farley J, Mobraaten L. Cryopreservation and orthotopic transplantation of mouse ovaries: new approach in gamete banking. Biol Reprod. 1998;58(4):1071-4.##Almodin CG, Minguetti-Câmara VC, Meister H, Ferreira JO, Franco RL, Cavalcante AA, et al. Recovery of fertility after grafting of cryopreserved germinative tissue in female rabbits following radiotherapy. Hum Reprod. 2004;19(6):1287-93.##Candy CJ, Wood MJ, Whittingham DG. Follicular development in cryopreserved marmoset ovarian tissue after transplantation. Hum Reprod. 1995;10 (9):2334-8.##Salle B, Demirci B, Franck M, Rudigoz RC, Guerin JF, Lornage J. Normal pregnancies and live births after autograft of frozen-thawed hemiovaries into ewes. Fertil Steril. 2002;77(2):403-8.##Radford JA, Lieberman BA, Brison DR, Smith AR, Critchlow JD, Russell SA, et al. Orthotopic reimplantation of cryopreserved ovarian cortical strips after high-dose chemotherapy for Hodgkin's lymphoma. Lancet. 2001;357(9263):1172-5.##Demeestere I, Simon P, Buxant F, Robin V, Fernandez SA, Centner J, et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: case report. Hum Reprod. 2006;21(8):2010-4.##Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 2004;364(9443):1405-10.##Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Fridman E, Zalel Y, et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med. 2005;353(3):318-21.##Schmidt KL, Andersen CY, Loft A, Byskov AG, Ernst E, Andersen AN. Follow-up of ovarian function post-chemotherapy following ovarian cryopreservation and transplantation. Hum Reprod. 2005; 20(12):3539-46.##Jeruss JS, Woodruff TK. Preservation of fertility in patients with cancer. N Engl J Med. 2009;360(9): 902-11.##Nottola SA, Camboni A, Van Langendonckt A, Demylle D, Macchiarelli G, Dolmans MM, et al. Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural study. Fertil Steril. 2008;90(1):23-32.##Nisolle M, Casanas-Roux F, Qu J, Motta P, Donnez J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertil Steril. 2000;74(1):122-9.##Aubard Y, Piver P, Cogni Y, Fermeaux V, Poulin N, Driancourt MA. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 1999;14(8):2149-54.##Fain-Kahn V, Poirot C, Uzan C, Prades M, Gouy S, Genestie C, et al. Feasibility of ovarian cryopreservation in borderline ovarian tumours. Hum Reprod. 2009;24(4):850-5.##Hemmati Sh, Zarnani AH, Mahmoudi AR, Sadeghi MR, Soltanghoraee H, Akhondi MA, et al. Ectopic expression of Sortilin 1 (NTR-3) in patients with ovarian carcinoma. Avicenna J Med Biotech 2009; 1(2):125-31.##

بررسی رابطۀ HLA-G سرمی با موفقیت روش كمك باروری ICSI The Relationship between Soluble Serum HLA-G and ICSI Success Rates 2 1 زمينه و هدف: بارداري، در واقع مانند پیوند عضوي موفق است. عواملی که در عدم دفع جنین مؤثرند هنوز به خوبی شناخته نشدهاند. درصد موفقیت و لانه گزيني جنین حاصل از روشهاي كمك باروري نیز ممکن است به همین عوامل وابسته باشد. ملکول HLA-G یکی ازانواع ملکول های MHC کلاس یک غیر کلاسیک است که اخيراً در ارتباط با بارداري مورد توجه زیادی قرار گرفته است. در اين مطالعه مقدار HLA-Gمحلول در سرم زنان تحت درمان با روش ICSI قبل و بعد از انتقال جنين اندازه گيری و همچنین با مقادیر HLA-G محلول در سرم زنان باردار طبیعی مقایسه شد تا رابطه حضور و غلظت سرمي آن با بارداری موفق تعيين گردد. هدف این مطالعه تعیین نقش HLA-G سرمی و تغییرات غلظت آن در موفقیت یا شکست روشهای كمك باروري است تا در تشخیص، پیشگویی و درمان ناباروری مورد استفاده قرار گیرد. روش بررسی: نمونه سرمی از 107 نفر زن تحت عمل ICSI در گروه آزمایشی قبل و 14 روز بعد از انتقال جنین و24 نمونه سرمی از زنان باردار طبیعی در گروه کنترل در سه ماهه اول بارداری جمع آوری شد. ایزوفرم های HLA-G1,-G5 محلول و HLA-G محلول توتال با روش الایزای ساندویچ بررسی شدند. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از آزمون تي و آزمونهاي غیر پارامتریک K-S، من ویتنی و ویلکاكسون در سطح معنی‌داری 05/0=α استفاده گردید. نتایج: ويژگيهاي دموگرافيك (سن، مدت ناباروری، رژیم درمانی) در گروه آزمایشی با بارداری موفق و ناموفق تفاوت آماری معنی‌داری نداشت. مقدارHLA-G1,-G5 محلول و HLA-G محلول توتال در سرم زنان قبل و بعد از ICSI در گروه با بارداری موفق به ترتیب U/ml8/62±4/47،OD : 58/0±47/1 قبل و U/ml5/69±6/59، OD: 57/0±38/1 بعد از ICSI و در گروه بارداری ناموفق به ترتیب U/ml2/55±7/35،OD :45/0±37/1 قبل و U/ml2/57±7/39، OD: 46/0±31/1 بعد از ICSI بود. به همین ترتیب در گروه کنترل با بارداری طبیعی مقادیر به ترتیبU/ml 92/47±16/53 و OD: 49/0±29/1 بود. در هیچکدام از موارد فوق تفاوت آماری معنی‌داری مشاهده نشد. پس از بررسی و مقایسه 29 مورد بارداری موفق و 78 مورد بارداری ناموفق، میزان موفقیت بارداری با تغییر غلظت ایزوفرم های HLA-G1,-G5 محلول وHLA-G توتال محلول بعد از درمان با روش ICSIدر دو گروه ارتباطی نشان نداد. نتیجه گیری: در زنان تحت درمان با روشهاي كمك باروري رابطه معنی‌داری بین موفقیت بارداری و HLA-G محلول سرمی مشاهده نگردید. بنابراین به نظر میرسد HLA-G سرمی اهمیت تشخیصی چنداني در موفقيت يا شکست اين روشها نداشته باشد. 2 Background: Pregnancy is a successful transplantation. Factors evading rejection of the fetus by the mother’s immune system are poorly understood and success rate and maintenance of embryos in assisted reproductive technologies (ART) may also depend on the same factors. The molecules of HLA-G are non-classical major histocompatibility complex class I antigens that have recently attracted attention in regards to pregnancy. The aim of the present study was to determine the concentration of HLA-G and its correlation with success or failure rates of ICSI. Methods: Serum samples of 107 women who were undergoing ICSI (the case group) were collected before and 14 days after embryo transfer, as were serum samples of 24 women with normal pregnancy (the control group) in the first trimester of pregnancy. Soluble HLA-G1 and G5 isoforms and the total sHLA-G were assayed by sandwich ELISA. Nonparametric Kolmogorov-Smirnov (K-S), Mann Whitney U and Wilcoxon tests were used for statistical analysis. Results: No significant differences were observed in clinical variables including age, infertility duration and treatment regimen between the control and the case groups. Levels of sHLA-G1 and sHLA-G5 and the total sHLA-G prior and after ICSI in the control group, respectively, were 47.4 ± 62.8 U/ml, OD: 1.47 ± 0.58 prior and 59.6 ± 69.5 U/ml, OD: 1.38 ± 0.57 after ICSI. In the non-pregnant group, the values respectively were 35.7 ± 55.2 U/ml, OD: 1.37 ± 0.45 prior and 39.7 ± 57.2 U/ml, OD: 1.31 ± 0.46 after ICSI, corresponding to the control group; 53.16 ± 47.92 U/ml and OD: 1.29 ± 0.49. No significant statistical differences were found between the pregnant, non-pregnant and the control groups. No significant changes in the serum levels of sHLA-G1 and sHLA- G5 isoforms and the total sHLA-G were observed following embryo transfer. Conclusion: No significant correlation was found between sHLA-G and the success of pregnancy in women undergoing ART. It seems that serum HLA-G has no prognostic value in the prediction of ICSI failure. 093 100 Zahra A Alinejad زهرا علی نژاد Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran Zahra_alinejad_p@yahoo.com Reza R Jafarishekib رضا جعفری شکیب Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran Fatemeh F Yari فاطمه یاری Research Center, Iranian Blood Transfusion Organization Research Center, Iranian Blood Transfusion Organization Iran Ziba Z Zahiri زیبا ظهیری Department of Gynecology & Midwifery, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Gynecology & Midwifery, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran Kambiz K Forghan-parast کامبیز فرقان پرست Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran Zahra Z Atrkar Roushan زهرا عطرکار روشن Department of Community Medicine and Biostatistics, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Community Medicine and Biostatistics, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran Farangis F Nagafi فرنگیس نجفی Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Guilan University of Medical Sciences Iran ARTELISAhistocompatibilityHLA-G antigenICSIImplantationIntracytoplasmic sperm injectionIVFleukocyte antigenPregnancySerumsHLA-G1Soluble 447.pdf Carosella ED, Moreau P, Lemaoult J, Rouas-Freiss N. HLA-G: from biology to clinical benefits. Trends Immunol. 2008;29(3):125-32.##LeMaoult J, Le Discorde M, Rouas-Freiss N, Moreau P, Menier C, McCluskey J, et al. Biology and functions of human leukocyte antigen-G in health and sickness. Tissue Antigens. 2003;62(4):273-84.##Hunt JS, Petroff MG, Morales P, Sedlmayr P, Geraghty DE, Ober C. HLA-G in reproduction: studies on the maternal-fetal interface. Hum Immunol. 2000;61(11):1113-7.##Huddleston H, Schust DJ. Immune interactions at the maternal-fetal interface: a focus on antigen presentation. Am J Reprod Immunol. 2004;51(4):283-9.##Le Bouteiller P. Commentary. Major breakthrough in the HLA-G debate: occurrence of pregnancy in human depends on the HLA-G status of preimplantation embryos. Eur J Immunol. 2002;32(2):309-10.##Carosella ED, Moreau P, Aractingi S, Rouas-Freiss N. HLA-G: a shield against inflammatory aggression. Trends Immunol. 2001;22(10):553-5.##Hviid TV. HLA-G in human reproduction: aspects of genetics, function and pregnancy complications. Hum Reprod Update. 2006;12(3):209-32.##Rebmann V, Lemaoult J, Rouas-Freiss N, Carosella ED, Grosse-Wilde H. Report of the Wet Workshop for Quantification of Soluble HLA-G in Essen, 2004. Hum Immunol. 2005;66(8):853-63.##Rebmann V, Pfeiffer K, Pässler M, Ferrone S, Maier S, Weiss E, et al. Detection of soluble HLA-G molecules in plasma and amniotic fluid. Tissue Antigens. 1999;53(1):14-22.##Hackmon R, Hallak M, Krup M, Weitzman D, Sheiner E, Kaplan B, et al. HLA-G antigen and parturition: maternal serum, fetal serum and amniotic fluid levels during pregnancy. Fetal Diagn Ther. 2004;19(5):404-9.##Alinejad Z, Jafari Shakib R, Forghan-Parast K, Zahiri Z, Sadri H, Nagafi F, et al. In vitro fertilized embryos do not secrete detectable HLA-G on day two. Iran J Immunol. 2009;6(4):195-201.##Yari F, Hosseini AZ, Nemat-Gorgani M, Sareh S, Khorramizadeh MR, Mansouri P, et al. Production and characterization of monoclonal antibodies with specificity for human HLA-G isoforms. Hybrid Hybridomics. 2003;22(5):301-6.##Hviid TV, Rizzo R, Christiansen OB, Melchiorri L, Lindhard A, Baricordi OR. HLA-G and IL-10 in serum in relation to HLA-G genotype and polymorphisms. Immunogenetics. 2004;56(3):135-41.##Rebmann V, van der Ven K, Pässler M, Pfeiffer K, Krebs D, Grosse-Wilde H. Association of soluble HLA-G plasma levels with HLA-G alleles. Tissue Antigens. 2001;57(1):15-21.##Pfeiffer KA, Rebmann V, Pässler M, van der Ven K, van der Ven H, Krebs D, et al. Soluble HLA levels in early pregnancy after in vitro fertilization. Hum Immunol. 2000;61(6):559-64.##Steinborn A, Rebmann V, Scharf A, Sohn C, Grosse-Wilde H. Placental abruption is associated with decreased maternal plasma levels of soluble HLA-G. J Clin Immunol. 2003;23(4):307-14.##Hviid TV, Hylenius S, Lindhard A, Christiansen OB. Association between human leukocyte antigen G genotype and success of in vitro fertilization and pregnancy outcome. Tissue Antigens. 2004;64(1): 66-9.##Moreau P, Dausset J, Carosella ED, Rouas-Freiss N. Viewpoint on the functionality of the human leukocyte antigen-G null allele at the fetal-maternal interface. Biol Reprod. 2002;67(5):1375-8.##Hunt JS, Jadhav L, Chu W, Geraghty DE, Ober C. Soluble HLA-G circulates in maternal blood during pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2000;183(3): 682-8.##Favier B, LeMaoult J, Rouas-Freiss N, Moreau P, Menier C, Carosella ED. Research on HLA-G: an update. Tissue Antigens. 2007;69(3):207-11.##Yie SM, Taylor RN, Librach C. Low plasma HLA-G protein concentrations in early gestation indicate the development of preeclampsia later in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2005;193(1):204-8.##Sipak-Szmigiel O, Ronin-Walknowska E, Cybulski C, Plonka T, Lubiński J. Antigens HLA-G, sHLA- G and sHLA- class I in reproductive failure. Folia Histochem Cytobiol. 2007;45 Suppl 1:S137-41.##Ober C, Aldrich C, Rosinsky B, Robertson A, Walker MA, Willadsen S, et al. HLA-G1 protein expression is not essential for fetal survival. Placenta. 1998;19(2-3):127-32.##Menier C, Riteau B, Dausset J, Carosella ED, Rouas-Freiss N. HLA-G truncated isoforms can substitute for HLA-G1 in fetal survival. Hum Immunol. 2000;61(11):1118-25.##Puppo F, Costa M, Contini P, Brenci S, Cevasco E, Ghio M, et al. Determination of soluble HLA-G and HLA-A, -B, and -C molecules in pregnancy. Transplant Proc. 1999;31(4):1841-3.##Rizzo R, Andersen AS, Lassen MR, Sørensen HC, Bergholt T, Larsen MH, et al. Soluble human leukocyte antigen-G isoforms in maternal plasma in early and late pregnancy. Am J Reprod Immunol 2009;62(5):320-38.##Rebmann V, LeMaoult J, Rouas-Freiss N, Carosella ED, Grosse-Wilde H. Quantification and identification of soluble HLA-G isoforms. Tissue Antigens. 2007;69 Suppl 1:143-9.##Hunt JS, Langat DL. HLA-G: a human pregnancy-related immunomodulator. Curr Opin Pharmacol. 2009;9(4):462-9.##

کنترل کیفی وسایل مصرفی در آزمایشگاه ART به روش ارزیابی تحرک اسپرم انسانی (HuSMA) Quality Control of Disposable Objects in ART Laboratories Performing Human Sperm Motility Assays 2 1 زمینه و هدف: برای اطمینان از عدم سمیت مواد مصرفی که برای کشت جنینها و گامتها استفاده می‌شوند از سیستم کنترل کیفی استفاده می‌شود. برای حفظ بالاترین استاندارد در آزمایشگاه ART، تمام وسایل مصرفی در آزمایشگاه ART با کمک روش ارزیابی تحرک اسپرم انسانی (HuSMA) مورد بررسی قرار گرفت. روش بررسی: 17 وسیله مورد استفاده در آزمایشگاه ART با روش HuSMA مورد بررسی قرار گرفتند. این وسایل شامل انواع سرنگ، دستکش، پتری دیش، سر سمپلر، پیپت، ظروف نمونه‌گیری بودند. در هر دو گروه کنترل و آزمایش بعد از 10 دقیقه، 30 دقیقه، 1، 2، 4 و 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفتند و درصد اسپرم‌های در حال تحرک در هر گروه مشخص شد. سپس نسبت درصد اسپرم‌های متحرک گروه تست به گروه کنترل، به عنوان شاخص برای تشخیص سمیت در نظر گرفته شد. در صورتی که این نسبت از85/0 کمتر بود، وسیله مورد نظر به عنوان وسیله توکسیک در نظر گرفته می‌شد. این آزمون برای هر نمونه سه بار تکرار گردید. نتایج: کنترل کیفی با HuSMA نشان داد که 3 نمونه مورد تست شامل دستکش انتقال جنین b و a و دستکش دريافت تخمك a دارای اثر سمی بودند. دستکش انتقال جنینa (0/0SMI=) و دستکش دريافت تخمك a (0/0SMI=) طی10 دقیقه پس از انکوبه شدن سمیت بالایی را نشان دادند؛ و دستکش انتقال جنین b (63/0SMI=) پس از 24 ساعت سمی شناخته شدند (46% اسپرم باتحرک پیشرونده در مقابل 68% اسپرم پیشرونده در نمونه کنترل). همچنین 2 نمونه دیگر، پتری‌دیش e (42/0SMI=) و ظرف جمع‌آوری مايع مني (67/0SMI=) در مرز قرار داشتند و پس از 24 ساعت و با وجود4 بار تکرار آزمون نتایج متفاوتی بدست آمد (2 بار سمی و 2 بار غیر سمی). نتیجه‌گیری: مواردی از وسایل مورد استفاده در آزمایشگاه ART ممکن است اثر سمی بر گامت و جنین داشته باشد و لازم است وسایل مصرفی قبل از استفاده از نظر کیفیت مورد ارزیابی قرار گیرند. برای افزایش دقت HuSMA پیشنهاد می‌شود برای هر نمونه چندین بار آزمون تکرار گردد. 2 Background: ART laboratories are quality controlled to make sure that disposable objects used for the culture of gametes and embryos are toxin-free. To maintain a high standard, all disposable objects in our ART laboratory were tested by human sperm motility assay (HuSMA). HuSMA was used as a measure for QC at the intended ART laboratory. Methods: Eighteen objects that are commonly used in IVF laboratories were tested by HuSMA. The objects included gloves, syringes, culture dishes, pipettes, tips and semen collection dishes. HuSMA was conducted at 10 and 30 minutes and also at 1, 2, 4, and 24 hours of incubation at room temperature. Sperm motility index (SMI) was calculated by dividing the percentage of progressive motile sperms of the test by that of the control at the specified intervals. An SMI value < 0.85 was defined to indicate sperm toxicity. The tests were repeated for three times. Results: QC by HuSMA confirmed the toxicity of three objects, including embryo transfer (ET) gloves A and B, and puncture gloves A. ET gloves A (SMI=0.0) and puncture gloves A (SMI=0.0) were toxic after 10 minutes, but ET gloves B (SMI=0.63) were shown to be toxic after 24 hours (46% progressive motile sperm compared with 68% in the control group). Moreover, two other objects including culture dish (SMI=0.42) and semen collection dish (SMI=0.67) had borderline values after 24 hours; different results in four repeats after 24 hours (twice toxic and twice nontoxic). Conclusion: Some objects which are routinely used in ART laboratories may be toxic and their use should be discontinued as part of QC programs. To increase the efficiency of HuSMA, it seems necessary to do this test more than once for each object. 101 109 Sare S Ashourzadeh ساره عاشورزاده Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Iran sareashoorzadeh@yahoo.com Azam A Agha-Rahimi اعظم آقارحیمی Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Iran Mohammad Ali MA Khalili محمد علی خلیلی Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Infertility Research and Clinical Center, Shahid Sadoughi Medical Sciences University Iran ARTHumanLaboratoryQuality controlSperm motilityToxicity tests 448.pdf Parinaud J, Reme JM, Monrozies X, Favrin S, Sarramon MF, Pontonnier G. Mouse system quality control is necessary before the use of new material for in vitro fertilization and embryo transfer. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1987;4(1):56-8.##Castilla JA, de Assín RR, Gonzalvo MC, Clavero A, Ramírez JP, Vergara F, et al. External quality control for embryology laboratories. Reprod Biomed Online. 2010;20(1):68-74.##De Jonge CJ, Centola GM, Reed ML, Shabanowitz RB, Simon SD, Quinn P. Human sperm survival assay as a bioassay for the assisted reproductive technologies laboratory. J Androl. 2003;24(1):16-8.##Gardner DK. In vitro fertilization: a practical approach. 1st ed. New York: Informa Healthcare;2007. p. 365-7.##Lierman S, De Sutter P, Dhont M, Van der Elst J. Double-quality control reveals high-level toxicity in gloves used for operator protection in assisted reproductive technology. Fertil Steril. 2007;88(4 Suppl): 1266-72.##Quinn P, Warnes GM, Kerin JF, Kirby C. Culture factors in relation to the success of human in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril. 1984; 41(2):202-9.##Ackerman S, Swanson RJ, Stokes G, Veeck L. Culture of preimplantation mouse embryos as a quality control assay for human in vitro fertilization. Gamete Res. 1984;9:145-52.##Fleming TP, Pratt HP, Braude PR. The use of mouse preimplantation embryos for quality control of culture reagents in human in vitro fertilization programs: a cautionary note. Fertil Steril. 1987;47(5): 858-60.##Bertheussen K, Holst N, Forsdahl F, Høie KE. A new cell culture assay for quality control in IVF. Hum Reprod. 1989;4(5):531-5.##Ray BD, McDermott A, Wardle PG, Corrigan E, Mitchell JD, McLaughlin EA, et al. In vitro fertilization: fertilization failure due to toxic catheters. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1987;4(1):58-61.##Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM. Establishing full-term human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br J Obstet Gynaecol. 1980; 87(9):737-56.##Critchlow JD, Matson PL, Newman MC, Horne G, Troup SA, Lieberman BA. Quality control in an invitro fertilization laboratory: use of human sperm survival studies. Hum Reprod. 1989;4(5):545-9.##Hafez ESE, Hafez SD. Atlas of clinical andrology. 1st ed. London: Taylor & Francis Group; 2005. p, 187-8.##Bavister BD, Andrews JC. A rapid sperm motility bioassay procedure for quality-control testing of water and culture media. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1988;5(2):67-75.##Davidson A, Vermesh M, Lobo RA, Paulson RJ. Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization: the one-cell versus the two-cell model. Fertil Steril. 1988;49(3):516-21.##Esterhuizen AD, Bosman E, Botes AD, Groenewald OA, Giesteira MV, Labuschagne GP, et al. A comparative study on the diagnostic sensitivity of rodent sperm and embryos in the detection of endotoxin in Earle's balanced salt solution. J Assist Reprod Genet. 1994;11(1):38-42.##McDowell JS, Swanson RJ, Maloney M, Veeck L. Mouse embryo quality control for toxicity determination in the Norfolk in vitro fertilization program. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1988;5(3): 144-8.##Morimoto Y, Hayashi E, Ohno T, Kawata A, Horikoshi Y, Kanzaki H. Quality control of human IVF/ ICSI program using endotoxin measurement and sperm survival test. Hum Cell. 1997;10(4): 271-6.##Quinn P, Horstman FC. Is the mouse a good model for the human with respect to the development of the preimplantation embryo in vitro?. Hum Reprod. 1998;13 Suppl 4:173-83.##Van den Abbeel E, Vitrier S, Lebrun F, Bertrand E, Devrecker F, Englert Y. Optimized mouse bioassays for the detection of embryology contaminants. Hum Reprod. 1999;14(114):O-205.##Claassens OE, Wehr JB, Harrison KL. Optimizing sensitivity of the human sperm motility assay for embryo toxicity testing. Hum Reprod. 2000;15(7): 1586-91.##

بررسی تأثیر تجویز اتانول و نیکوتین بر کیسه منی موش صحرایی بالغ Effects of Nicotine and Ethanol Administration on the Seminal Vesicle of Adult Rats 2 1 زمينه و هدف: بررسی اثرات سو الکل و سیگار در دستگاه تناسلی به طور عمده روي بافت بیضه و پروستات معطوف بوده است. در حالیکه مطالعات کاملی روی تأثیر تجویز الکل، نیکوتین و مصرف همزمان آنها روی کیسه منی تولید كننده 70% از ترشحات مایع منی انجام نشده است. مقاله حاضر تأثیر تجویز این مواد و مصرف همزمان آنها بر ساختار سلولی کیسه منی را بررسی کرده است. روش بررسي: 50 موش صحرایی نر بالغ Wistar با سن 9 هفته به 5 گروه تقسیم شدند: دست نخورده (بدون هيچ دريافت)، شاهد (سرم فیزیولوژیک 09/0%)، اتانل 20% (gr/kg2)، نیکوتین (mg/kg1/0)، اتانل- نیکوتین که اتانل و نیکوتین را با دوزهای ذکر شده، همزمان دریافت کردند. الکل از طریق گاواژ و نیکوتین به طریق زیر جلدی، به مدت 50 روز تجویز شد. خونگیری قبل از پرفیوژن انجام و کیسه منی برداشته و مقاطع برش داده شده با هماتوکسیلین- ائوزین جهت بررسی مورفولوژیک و مورفومتری رنگ‌آمیزی شد. برای بررسی تفاوت‌های آماری بین گروه‌ها، پس از اطمینان از نرمال بودن یافته‌ها از آزمون آماری One way ANOVA و تست تعقیبی Tucky استفاده شد. حد معنی‌داری آزمونها 05/0p< در نظر گرفته شد. نتایج: کاهش معنی‌داری در طول سلول‌های اپیتلیوم ترشحی، در گروه اتانلی نسبت به شاهد مشاهده شد (0001/0p<). مطالعه کیفی آسین‌های ترشحی حاکی از کاهش چشمگیر ترشحات در فضای اسینی‌های ترشحی در گروه اتانولی در مقایسه به گروه شاهد بود در دو گروه نیکوتینی و اتانل – نیکوتین کاهش طول سلولی از حیث آماری معنی‌دار نبود. ضمناً تفاوت معنی‌داری در سطح هورمون تستوسترون بین گروهها مشاهده نشد. نتیجه‌گیری: تجویز مزمن اتانل بیشترین تأثیر را بر ساختار سلولی- بافتی کیسه منی دارد. کاهش تأثیر تجویز همزمان الکل و نیکوتین بر کیسه منی را می‌توان احتمالاً به کاهش جذب الکل به دنبال تجویز نیکوتین نسبت داد. 2 Background: The effects of cigarette and alcohol on male reproductive system have been studied mainly on the testis and prostate but studies on their co-administration on the seminal vesicle which produces about 70% of the semen volume are scarce. Therefore, the present study evaluated the effects of nicotine and/ or alcohol on the glandular epithelial cells of seminal vesicle in adult rats. Methods: In this study, 50 adult Wistar rats, aged 9 weeks, were randomly divided into five groups, including: sham, control (0.09% normal saline), 20% ethanol (2 ml/kg), nicotine (0.1 mg/kg) and ethanol-nicotine. Ethanol was given via oral gavage but nicotine was administered subcutaneously for 50 days. Blood samples were collected prior to intracardiac perfusion. The seminal vesicles were later dissected and tissue samples were stained by H&E for morphologic and morphometric studies. One-way ANOVA and Tukey’s post-hoc test were used for data analysis. A p-value <0.05 was considered statistically significant. Results: The height of glandular epithelial cells of the seminal vesicle was reduced remarkably in rats in ethanol versus the control group (p<0.0001). However, testosterone concentrations were not significantly different in the two groups. Semen volume, as well as its acidophilic properties in the lumen of most acini were lower in the ethanol comparative to the control group. Conclusion: Ethanol had the most negative effects on the cells and tissue structure of seminal vesicle compared to nicotine. The minimal effects seen by the simultaneous use of alcohol and nicotine on seminal vesicle structure might be attributed to the reduction of alcohol absorption following nicotine administration. 109 116 Mohsen M Basiri محسن بصیری Neuroscience Research Center, Kerman University of Medical Sciences Neuroscience Research Center, Kerman University of Medical Sciences Iran m_basiri@kmu.ac.ir Masoud M Ezat Abadipour مسعود عزت آبادی پور Professor, Anatomy Department, Faculty of Medicine, Kerman Medical Sciences University Professor, Anatomy Department, Faculty of Medicine, Kerman Medical Sciences University Iran Vahid V Hemayatkhah Djahromi وحید حمایت خواه جهرمی Department of Biology, Faculty of Islamic Azad University, Jahrom Branch Department of Biology, Faculty of Islamic Azad University, Jahrom Branch Iran Naghmeh N Shahidi Zandi نغمه شهیدی زندی Department of Biology, Faculty of Islamic Azad University, Jahrom Branch Department of Biology, Faculty of Islamic Azad University, Jahrom Branch Iran Arash A Sarv Azad آرش سرو آزاد Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University Iran Seyed Noureddin SN Nematollahi-Mahani سید نورالدین نعمت‌اللهی ماهانی Department of Anatomy, Afzalipour Faculty of Medicine, Kerman University of Medical Sciences Department of Anatomy, Afzalipour Faculty of Medicine, Kerman University of Medical Sciences Iran CigaretteEthanolNicotineSeminal vesicleTestosterone 453.pdf Bannister P, Losowsky MS. Ethanol and hypogonadism. Alcohol Alcohol. 1987;22(3):213-7.##Florek E, Marszalek A. An experimental study of the influences of tobacco smoke on fertility and reproduction. Hum Exp Toxicol. 1999;18(4):272-8.##Edwards R. The problem of tobacco smoking. BMJ. 2004;328(7433):217-9.##Kulikauskas V, Blaustein D, Ablin RJ. Cigarette smoking and its possible effects on sperm. Fertil Steril. 1985;44(4):526-8.##Reddy S, Londonkar R, Ravindra, Reddy S, Patil SB. Testicular changes due to graded doses of nicotine in albino mice. Indian J Physiol Pharmacol. 1998;42(2):276-80.##Villalta J, Ballescà JL, Nicolás JM, Martínez de Osaba MJ, Antúnez E, et al. Testicular function in asymptomatic chronic alcoholics: relation to ethanol intake. Alcohol Clin Exp Res. 1997;21(1):128-33.##Pakrashi A, Chatterjee S. Effect of tobacco consumption on the function of male accessory sex glands. Int J Androl. 1995;18(5):232-6.##Gomes IC, Cagnon VH, Carvalho CA, De Luca IM. Stereology and ultrastructure of the seminal vesicle of C57/BL/6J mice following chronic alcohol ingestion. Tissue Cell. 2002;34(3):177-86.##Fávaro WJ, Cagnon VH. Immunolocalization of androgen and oestrogen receptors in the ventral lobe of rat (Rattus norvegicus) prostate after long-term treatment with ethanol and nicotine. Int J Androl. 2008;31(6):609-18.##Bianco JJ, Handelsman DJ, Pedersen JS, Risbridger GP. Direct response of the murine prostate gland and seminal vesicles to estradiol. Endocrinology. 2002;143(12):4922-33.##Marker PC, Donjacour AA, Dahiya R, Cunha GR. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev Biol. 2003;253(2):165-74.##Martinez FE, Garcia PJ, Padovani CR, Cagnon VH, Martinez M. A morphometric ultrastructural study of the seminal vesicle of rats submitted to experimental chronic alcoholism. J Submicrosc Cytol Pathol. 1997;29(4):537-42.##Välimäki M, Ylikahri RH. Endocrine effects of alcohol. Prog Alcohol Res. 1985;1:265-86.##Salonen I, Huhtaniemi I. Effects of chronic ethanol diet on pituitary-testicular function of the rat. Biol Reprod. 1990;42(1):55-62.##Meikle AW, Liu XH, Taylor GN, Stringham JD. Nicotine and cotinine effects on 3 alpha hydroxyl-steroid dehydrogenase in canine prostate. Life Sci. 1988;43(23):1845-50.##Cunha GR, Alarid ET, Turner T, Donjacour AA, Boutin EL, Foster BA. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J Androl. 1992;13(6):465-75.##Kim KH, Joo KJ, Park HJ, Kwon CH, Jang MH, Kim CJ. Nicotine induces apoptosis in TM3 mouse Leydig cells. Fertil Steril. 2005;83 Suppl 1:1093-9.##Patterson TR, Stringham JD, Meikle AW. Nicotine and cotinine inhibit steroidogenesis in mouse Leydig cells. Life Sci. 1990;46(4):265-72.##Husain K, Scott BR, Reddy SK, Somani SM. Chronic ethanol and nicotine interaction on rat tissue antioxidant defense system. Alcohol. 2001; 25(2):89-97.##Maria G, Maria J, Guillerrno B, Juan C, Luis G. Effects of chronic ethanol ingestion on the vasoactive intestinal peptide receptor-effector system from seminal vesicle members. Alcohol Clin Exp Res. 1999;23(2):318-23.##Van Thiel DH, Lester R. The effect of chronic alcohol abuse on sexual function. Clin Endocrinol Metab. 1979;8(3):499-510.##Zhu Q, Meisinger J, Emanuele NV, Emanuele MA, LaPaglia N, Van Thiel DH. Ethanol exposure enhances apoptosis within the testes. Alcohol Clin Exp Res. 2000;24(10):1550-6.##Shaarawy M, Mahmoud KZ. Endocrine profile and semen characteristics in male smokers. Fertil Steril. 1982;38(2):255-7.##Rajpurkar A, Jiang Y, Dhabuwala CB, Dunbar JC, Li H. Cigarette smoking induces apoptosis in rat testis. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 2002;21(3): 243-8.##Lüdtke FE, Lammel E, Mandrek K, Peiper HJ, Golenhofen K. Myogenic basis of motility in the pyloric region of human and canine stomachs. Dig Dis. 1991;9(6):414-31.##Mandrek K, Kreis S. Regional differentiation of gastric and of pyloric smooth muscle in the pig: mechanical responses to acetylcholine, histamine, substance P, noradrenaline and adrenaline. J Auton Pharmacol. 1992;12(1):37-49.##Scott AM, Kellow JE, Shuter B, Nolan JM, Hoschl R, Jones MP. Effects of cigarette smoking on solid and liquid intragastric distribution and gastric emptying. Gastroenterology. 1993;104(2):410-6.##Holt S. Observations on the relation between alcohol absorption and the rate of gastric emptying. Can Med Assoc J. 1981;124(3):267-77, 297.##Johnson RD, Horowitz M, Maddox AF, Wishart JM, Shearman DJ. Cigarette smoking and rate of gastric emptying: effect on alcohol absorption. BMJ. 1991;302(6767):20-3.##Aberle NS, Privratsky JR, Burd L, Ren J. Combined acetaldehyde and nicotine exposure depresses cardiac contraction in ventricular myocytes: prevention by folic acid. Neurotoxicol Teratol. 2003;25(6):731-6.##Parnell SE, West JR, Chen WJ. Nicotine decreases blood alcohol concentrations in adult rats: a phenomenon potentially related to gastric function. Alcohol Clin Exp Res. 2006;30(8):1408-13.##Madden PA, Heath AC. Shared genetic vulnerability in alcohol and cigarette use and dependence. Alcohol Clin Exp Res. 2002;26(12):1919-21##Dhawan K, Sharma A. Prevention of chronic alcohol and nicotine-induced azospermia, sterility and decreased libido, by a novel tri-substituted benzoflavone moiety from Passiflora incarnata Linneaus in healthy male rats. Life Sci. 2002;71(26):3059-69.##

بررسی اثرات سم ارگانوکلره آندوسولفان بر برخی پارامترهای تولید مثلی در موش صحرایی نر Effects of Endosulfan on the Reproductive Parameters of Male Rats 2 1 زمينه و هدف: یکی از حشره‌کشها و کرم کش‌های قوی ارگانوکلره مورد استفاده در کشاورزی، آندوسولفان است که مصرف آن تأثير زيادي در کنترل حشرات دارد. این سم در انسانها و حیوانات از طریق خوراکی، استنشاقی و پوستی قابل جذب است. سم ارگانوكلره آندوسولفان در كشتزارها به طور گسترده استفاده مي‌شود. هدف این تحقیق بررسي تاثیر سم مزبور بر صفات تولید مثلی جنس نر بود. روش بررسی: در این تحقیق اثر دراز مدت آندوسولفان Ec 35% روی برخی پارامترهای تولید مثلی جنس نر در رت‌های بالغ بررسی گردید. بدین منظور40 عدد رت نر مورد آزمایش به پنج گروه تقسیم شدند. گروه کنترل هیچ ماده‌ای دریافت نکرد. گروه دارونما محلول نمکی 9/0% گروه تجربی 1،2 و 3 به ترتیب آندوسولفان با دوز mg/kg5، 10 و20 هر سه روز یکبار به مدت 21 روز از طریق گاواژ دریافت کردند. در پایان آزمایشها، موشها با کلروفرم بیهوش شده، خونگیری از قلب انجام گرفت و هورمون‌های FSH، LH و تستوسترون با روش‌های استاندارد آزمایشگاهی ارزیابی گرديدند. سپس موشها کشته شدند و بیضه‌ها همراه اپیدیدیم خارج و خصوصیات مورفولوژیک اسپرمها مطالعه شدند. نتایج بدست آمده با نرم افزار SPSS و با استفاده از آناليز واريانس يك طرفه در سطح 05/0p< ارزیابی شد. نتايج: به دنبال تجويز آندوسولفان میزان هورمون‌های جنسی نر شامل LH و FSH افزایش معنی‌دار نشان داد (05/p<). در صورتی که هورمون تستوسترون دارای کاهش معنی‌دار است. پارامترهای تولید مثلی نظیر تعداد و حرکت اسپرم و وزن بیضه‌ها کاهش معنی‌داری (05/0p<) نسبت به گروه کنترل داشتند. نتيجه‌گيري: آندوسولفان دارای اثرات قابل ملاحظه‌ای بر شاخص‌های تولید مثلی دارد و می‌تواند باعث آسیب‌های جدی گردد. این سم اثرات نامطلوبی بر حرکت و تعداد اسپرمها گذاشته و با تغییر در غلظت هورمونها سبب ناباروری می‌شود. 2 Background: Endosulfan is an organochlorine compound with insecticidal and acaricidal properties and also with widespread agricultural use for insect control. The poison could enter the body through respiration, absorption via skin and ingestion in human beings, or grazing by farm animals. The long-term effects of endosulfan EC 35% on sex hormones and sperm morphology were studied in mature male rats. Methods: In this study, 40 male rats were divided into five groups: the control group did not receive any substances while the placebo group received normal saline and the three test groups, respectively received endosulfan 5, 10 and 20 ml/kg of the total body weight every two days for three weeks. At the end of the experiment, the rats were anesthetized by chloroform and blood samples were collected from their heart for sex hormone evaluation. The rats were later sacrificed and their testes and epididymides were harvested for morphological studies of sperm. Results: Following endosulfan administration, LH and FSH concentrations increased significantly (p<0.05) while testosterone underwent a meaningful decrease. Moreover, reproductive parameters such as sperm count, motility and testicular weight decreased significantly compared to the control group (p<0.05). Conclusion: It seems that endosulfan has an undeniably damaging effect on the testis accompanied by its unfavorable effects on the reproductive system which may lead to infertility due to the changes in sex hormones concentration and sperm count and motility. 117 123 Mehrdad M Modaresi مهرداد مدرسی Department of Physiology, Faculty of Agriculture, Islamic Azad University- Khorasgan Branch Department of Physiology, Faculty of Agriculture, Islamic Azad University- Khorasgan Branch Iran mehrdad_modaresi@hotmail.com Mohammad Reza MR Seif محمدرضا سیف Department of Biology, Payam-e-Noor University Department of Biology, Payam-e-Noor University Iran EndosulfanFSHLHRatSperm countTestosteroneMale infertilitySex hormoneSperm motility 450.pdf Oliveira-Silva JJ, Alves SR, Meyer A, Perez F, Sarcinelli PN, da Costa Mattos RC, et al. [Influence of socioeconomic factors on the pesticides poisoning, Brazil]. Rev Saude Publica. 2001;35(2):130-5. Portuguese.##Hela DG, Lambropoulou DA, Konstantinou IK, Albanis TA. Environmental monitoring and ecological risk assessment for pesticide contamination and effects in Lake Pamvotis, northwestern Greece. Environ Toxicol Chem. 2005;24(6):1548-56.##Betancourt M, Reséndiz A, Fierro EC. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis (CASA) in vitro. Reprod Toxicol. 2006;22 (3):508-12.##Soto AM, Sonnenschein C, Chung KL, Fernandez MF, Olea N, Serrano FO. The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens: an update on estrogenic environmental pollutants. Environ Health Perspect. 1995;103 Suppl 7:113-22.##Jamil K, Shaik AP, Mahboob M, Krishna D. Effect of organophosphorus and organochlorine pesticides (monochrotophos, chlorpyriphos, dimethoate, and endosulfan) on human lymphocytes in-vitro. Drug Chem Toxicol. 2004;27(2):133-44.##Sinha N, Adhikari N, K Saxena D. Effect of endosulfan during fetal gonadal differentiation on spermatogenesis in rats. Environ Toxicol Pharmacol. 2001; 10(1-2):29-32.##Grünfeld HT, Bonefeld-Jorgensen EC. Effect of in vitro estrogenic pesticides on human oestrogen receptor alpha and beta mRNA levels. Toxicol Lett. 2004;151(3):467-80.##Walsh LP, Webster DR, Stocco DM. Dimethoate inhibits steroidogenesis by disrupting transcription of the steroidogenic acute regulatory (StAR) gene. J Endocrinol. 2000;167(2):253-63.##Vittozzi L, Fabrizi L, Di Consiglio E, Testai E. Mechanistic aspects of organophosphorothionate toxicity in fish and humans. Environ Int. 2001;26 (3):125-9.##Gaido K, Dohme L, Wang F, Chen I, Blankvoort B, Ramamoorthy K, et al. Comparative estrogenic activity of wine extracts and organochlorine pesticide residues in food. Environ Health Perspect. 1998;106 Suppl 6:1347-51.##Boereboom FT, van Dijk A, van Zoonen P, Meulenbelt J. Nonaccidental endosulfan intoxication: a case report with toxicokinetic calculations and tissue concentrations. J Toxicol Clin Toxicol. 1998; 36(4):345-52.##

بررسي تاثيراسانس خوراکی پوست پرتقال بر شدت علايم سندرم پيش از قاعدگي، كار آزمايي باليني دو سو كور شاهددار Essential Oil of Citrus Sinensis for the Treatment of Premenstrual Syndrome; a Randomized Double-blind Placebo-controlled Trial 2 1 زمینه و هدف: سندرم پیش از قاعدگی مجموعه‌ای از علایم رفتاری، جسمی و عاطفی با شدت متفاوت است که باعث به وجود آمدن اختلال در روابط فردی و اجتماعی می‌شود. علل این سندرم پیچیده است و بر اساس آن روش‌های درمانی مختلفی از روش‌هاي حمايتي تا جراحي تخمدان مطرح شده است. رويكرد جديد استفاده بیشتر از مکمل‌های غذایی و داروهای گیاهی است. اسانس پوست پرتقال با نام علمی سیتروس ساینسیس دارای ترکیباتی چون لیمونن، فلاندرن وسیترال است که اثرات آرامبخشی، تسکین دهنده سیستم عصبی مرکزی، مانند فلوكسيتين، و ضد اسپاسمی ضد افسردگی، ضد نفخ برای آن ذکر شده است. فلوکستین از داروهاي موثر بر درمان سندرم پیش از قاعدگی مي‌باشد. لذا با توجه به تشابه این دو با هم، پژوهشی با هدف تعیین تاثیر اسانس پوست پرتقال بر علایم سندرم پیش ازقاعدگی در دانشجویان ساکن خوابگاه دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی سال 89-1388 انجام شد. روش بررسی: پژوهش حاضر از نوع کارآزمایی بالینی دوسوکور شاهددار است که روی 80 نفر دانشجوي ساکن خوابگاه دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی انجام شد. نمونه‌های پژوهش به مدت دو ماه متوالی فرم ثبت وضعیت روزانه آینده‌نگر را تکمیل کردند و پس از تایید قطعی تشخیص سندرم پیش از قاعدگی به طور تصادفی به دو گروه 40 نفری تقسیم شدند و به مدت دو ماه متوالی با 10 قطره اسانس پوست پرتقال یا دارونما سه بار در روز، حداقل 14 روز قبل از قاعدگی تحت درمان قرار گرفتند. ابزار گردآوری داده‌ها پرسشنامه و فرم ثبت وضعیت روزانه علایم بود که جهت اعتبارآن از روش اعتبار محتوا و جهت پایایی آن از روش آلفای کرونباخ (80%) استفاده شد. آزمون تی زوجی براي تفاوت شدت سندرم پیش از قاعدگی در داخل گروهها، قبل و بعد از مداخله، وتي مستقل براي برای تفاوت شدت علایم بین دو گروه، آزمون كاي اسكوئر براي تمايل به ادامه مصرف و آزمون دقيق فيشر براي وجود عوارض استفاده شد. سطح معني‌داري براي كليه آزمونها 05/0>p درنظر گرفته شد. نتايج: هر دو گروه از نظر متغيرهاي زمينه‌اي نظير سن، سن منارك و نيز شدت علائم قبل از مداخله اختلاف معني‌دار نداشتند. ميزان کاهش شدت علایم سندرم پیش از قاعدگی بعد از مصرف اسانس پوست پرتقال 08/46% و در گروه دارونما 21/14% بود که بین میزان کاهش شدت علایم بین دو گروه اختلاف معنی‌داری وجود دارد (001/0>p). همچنین ميزان کاهش شدت علایم جسمی در گروه دارو به ميزان 30/24% و در گروه دارونما به ميزان 5% و ميزان کاهش شدت علایم روانی بعد از مصرف دارو 78/21% و در گروه دارونما به ميزان 21/9 درصد بود (001/0p<). نتیجه‌گیری: به نظر می‌رسد اسانس پوست پرتقال در بهبود علایم جسمی و روانی سندرم پیش از قاعدگی موثر است. پیشنهاد می‌شود دارو حداقل به مدت دو ماه در فاز لوتئال جهت درمان استفاده شود. 2 Background: Premenstrual syndrome is characterized by a set of behavioral, somatic and affective symptoms of varying severity that occur 7-10 days before the onset of menstruation and disrupt personal and social life. The symptoms usually subside by the beginning of menstruation flow. Different causes have been proposed for the syndrome as have been medical and surgical methods for its treatment. A recent approach relies more on the use of food supplements and herbal drugs. Citrus essence contains compounds such as limonene, flounder and citral with proposed sedative and antispasmodic effects in addition to its antidepressant properties. These effects are similar to those of fluoxetine which is an effective medication in the treatment of premenstrual syndrome. Therefore, this research was designed to determine the efficacy of citrus essence on the severity of premenstrual symptoms in dormitory students of Shahid Beheshti University of Medical Sciences during 2009-2010. Methods: This study was a randomized, double-blind, placebo-controlled trial done on 80 students suffering from premenstrual syndrome. The students completed a daily symptom rating questionnaire for two consecutive menstrual cycles. Following the definitive diagnosis of PMS, the students were randomly divided into two groups and received, either 10 drops of citrus essence or placebo drops, three times a day during the luteal phase for two cycles. The data collecting tools, a questionnaire and a daily symptom rating form, had been evaluated for content validity and their reliability had been measured by Cronbach's Alpha Reliability Coefficient (0.080). A p-value of 0<0.5 was considered statistically significant. Results: The two groups were similar in terms of demographic characteristics and overall baseline severity of the symptoms. The group on citrus essence witnessed a significant reduction of 46.08% in the symptoms compared to the group on placebo 14.21%, (p<0.001). After the intervention, there were also significant decreases in the severity of physical and psychological symptoms in both citrus essence (respectively, 24.3% and 21.78%) and placebo groups (respectively, 2.07% and 9.21%), (p<0.001). Conclusion: The study showed that citrus essence could reduce the severity of premenstrual syndrome. The essence is suggested to be taken during the luteal phase in two consecutive cycles. 123 130 Giti G Ozgoli Department of Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences Department of Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences Iran gozgoli@yahoo.com Mardjan M Shahveh مرجان شهوه Department of Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences Department of Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences Iran Somayeh S Esmaielli سمیه اسماعیلی Department of Pharmacognosy, Faculty of Traditional Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences Department of Pharmacognosy, Faculty of Traditional Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences Iran Navideh N Nassiri نویده نصیری Faculty of Paramedicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences Faculty of Paramedicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences Iran Citrus essenceHerbal medicinePremenstrual syndrome 454.pdf Teng CT, Filho AH, Artes R, Gorenstein C, Andrade LH, Wang YP. Premenstrual dysphoric symptoms amongst Brazilian college students: factor structure and methodological appraisal. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 2005;255(1):51-6.##Braverman PK. Premenstrual syndrome and premenstrual dysphoric disorder. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2007;20(1):3-12.##Speroff L, Fritz MA. Clinical gynecologic endocrinology and infertility. 7th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. p. 531-46.##Haywood A, Slade P, King H. Assessing the assessment measures for menstrual cycle symptoms: a guide for researchers and clinicians. J Psychosom Res. 2002;52(4):223-37.##Sadighi J, Maftoon F, Ziaei SA. [Herbal medicine: Knowledge, attitude and practice in Tehran]. J Med Plant. 2005;4(13):11-8. Persian.##Prilepskaya V, Ledina A, Tagiyeva A, Revazova F. Vitex agnus castus: Successful treatment of moderate to severe premenstrual syndrome. Maturitas. 2006;55:S55-S6.##Freeman EW. Effects of antidepressants on quality of life in women with premenstrual dysphoric disorder. Pharmacoeconomics. 2005;23(5):433-44.##Pakgohar M, Ahmadi M, Salehi surmaghi MH, Mehran A, Akhondzadeh h. [Effect of Hypericum perforatum L. for treatment of premenstrual syndrome]. J Med Plant. 2005;4(33):33-42. Persian.##Ozgoli G, Selselei EA, Mojab F, Majd HA. A randomized, placebo-controlled trial of Ginkgo biloba L. in treatment of premenstrual syndrome. J Altern Complement Med. 2009;15(8):845-51.##Soltani A. [Encyclopedia of Traditional Medicine Herbal]. 2nd ed. Tehran: Arjmand; 2005. Persian.##Haji Akhondi A, Baligh N. [Guidline of Herbal Medicine]. Tehran: Islamic Azad University; 2005. Persian.##Sargolzaee MR, Faayyazi Bordbar MR, Samari AA, Shakiba M. The comparison of the efficacy of Citrus Fragrance and Fluoxetine in the treatment of major depressive disorder. J Ofogh-E-Danesh. 2004;10(3):43-8. Persian.##Murakami K, Sasaki S, Takahashi Y, Uenishi K, Watanabe T, Kohri T, et al. Dietary glycemic index is associated with decreased premenstrual symptoms in young Japanese women. Nutrition. 2008; 24(6):554-61.##Kaur G, Gonsalves L, Thacker HL. Premenstrual dysphoric disorder: a review for the treating practitioner. Cleve Clin J Med. 2004;71(4):303-18.##Mokhber N, Faayyazi Bordbar MR, Javadi K. [The efficacy of fluoxeteine in treatment of premenstrual syndrome]. J Fundam Ment Health. 2005;6 (23-24):111-5. Persian.##Cohen LS, Miner C, Brown EW, Freeman E, Halbreich U, Sundell K, et al. Premenstrual daily fluoxetine for premenstrual dysphoric disorder: a placebo-controlled, clinical trial using computerized diaries. Obstet Gynecol. 2002;100(3):435-44.##Drief J, Magowan B. Clinical Obstetrics and Gynecology. Edinburgh: Saunders Publishing; 2004.##

نقش مؤلفه‌هاي پيوستگي گروهي در گرايش زنان باردار به شركت در دوره‌هاي آمادگي جسماني The Role of Group Cohesion in Pregnant Women’s Attitude toward Participation in Fitness Classes 2 1 زمينه و هدف: شاخص‌هاي پيوند و همبستگي گروهي از عناصر با اهميتي است كه عملكرد و رفتار افراد را در گروه تحت تأثير قرار مي‌دهد. اين شاخص به ويژه در بين گروه‌هاي ورزشي و تمرينات آمادگي جسماني اهميت اساسي دارد. شواهد پژوهشي نشان مي‌دهند كه تمرينات ورزشي متناسب با شرايط دوران بارداري پيامدهاي مثبت چندي از جمله كاهش اضطراب، افزايش عاطفه مثبت و آمادگي بيشتر رواني و جسمي براي وضع حمل را به دنبال دارد. بنابراين ضرورت انجام اين پژوهش معطوف به ارائه شواهدي براي نقش مؤلفه‌هاي پيوستگي گروهي در گرايش زنان باردار به شركت در دوره‌هاي آمادگي جسماني بوده است. هدف از انجام اين پژوهش نيز بررسي نقش مؤلفه‌هاي پيوستگي گروهي در گرايش زنان باردار به شركت در دوره‌هاي آمادگي جسماني بود. روش بررسي: در اين مطالعه توصيفي‌ـ مقايسه‌اي، شركت‌كنندگان 400 نفر از زنان باردار در سه ماهه دوم بارداري در شهر اصفهان بودند. مؤلفه‌هاي پيوستگي گروهي (شامل جاذبه فردي به گروه اجتماعي، جاذبه فردي به تكليف گروهي، در هم ‌تنيدگي اجتماعي گروه و در هم تنيدگي وظيفه گروه) با استفاده از پرسشنامه محيط گروهي (GEQ) مورد سنجش قرار گرفت. تمرينات آمادگي جسماني در اين پژوهش طي 12 جلسه 20 تا 30 دقيقه‌اي، شامل تمرينات مربوط به پياده‌روي، شنا، حركات ريتميك و ديگر تمرينات هوازي سبك و متوسط بود كه به صورت گروهي به مرحله اجرا درآمد. ميزان غيبت افراد بر حسب جلسه و ميزان تأخير آنها بر حسب دقيقه در هر جلسه در فهرست حضور و غياب ثبت ‌گرديد. در پايان دوره، پرسشنامه محيط گروهي اجرا شد (در پايان دوازدهمين جلسه). سپس افرادي كه دو انحراف استاندارد از نظر غيبت و تأخير نمره بالاتر يا پائين‌تر دريافت كردند، به عنوان افراد داراي غيبت و تأخير زياد و كم طبقه‌بندي شدند. روش‌هاي آماري مورد استفاده، روش‌هاي توصيفي نظير محاسبه ميانگين، انحراف معيار و در سطح استنباطي روش تحليل تشخيصي (مميز) بوده است. سطح معني‌داري مورد استفاده در سطح استنباطي حداقل 05/0 بوده است. نتايج: ميانگين گروه غيبت كم در چهار حوزه جاذبه فردي به گروه اجتماعي (ATG-S)، جاذبه فردي به تكليف گروهي (ATG-T)، در هم تنيدگي اجتماعي به ترتيب گروه (CI-S) و درهم تنيدگي وظيفه گروه (GI-I)، به ترتيب 7/34، 3/28، 3/17 و 9/27 و ميانگين گروه غيبت زياد در چهار حوزه ياد شده، به ترتيب 3/27، 4/23، 9/16 و 7/24 بود. نتايج تحليل تشخيصي (مميز) نشان داد كه گروه داراي غيبت كم در دو حوزة جاذبه فردي به گروه اجتماعي (ATG-S) و جاذبه فردي به تكليف گروهي (ATG-T) به صورت معني‌داري (01/0P<) از گروه داراي غيبت زياد داراي ميانگين‌هاي بالاتري بودند. ميانگين گروه تأخير كم در چهار حوزة مطرح در پيوستگي گروهي (GI-I, GI-S, ATG-T, ATG-S) به ترتيب 6/32، 7/22، 3/27 و 7/17 و مياگين گروه تأخير زياد، 3/27، 1/23، 9/26 و 2/18 بود. نتيجه تحليل تشخيصي نشان داد كه دو گروه داراي تأخير كم و زياد فقط در حوزة جادبه فردي به گروه اجتماعي (ATG-S) با يكديگر داراي تفاوت معني‌دار (05/0P<) هستند. نتيجه‌گيري: جذاب نمودن تمرينات آمادگي جسماني گروهي و همچنين تشكيل گروه همگن و جذاب براي زنان شركت‌كننده در اين نوع تمرينات مي‌تواند به عنوان يك عامل انگيزشي براي پيگيري همراه با پشتكار تمرينات آمادگي جسماني تلقي شود. يعني بايد گروه و فعاليت گروهي (تمرينات آمادگي جسماني) در اين موارد با استفاده از راهبردهاي مختلف تقويت شود. 2 Background: Group cohesion indices are among important factors that influence human performance and behavior within groups. Group cohesion has also an important role in sports and physical exercise groups. Evidence indicates that sportive exercises during pregnancy have some positive effects, such as anxiety relief, heightened spirit and higher physical and psychological adaptation to pregnancy. The main purpose of this study was to compare group cohesion among pregnant women who participated in fitness classes. Methods: This descriptive-comparative study included 400 women in their second trimester of pregnancy in Isfahan, Iran. They filled a Group Environment Questionnaire (GEQ) with four subscales, including attraction to group task, attraction to social group, social group interplay and task group interplay. Physical exercises were performed in twelve 20-30 minutes sessions. Exercises in each session were comprised of side walking, swimming, rhythmic movements and light to medium aerobic exercises. Absenteeism and delays were recorded in each session. In the twelfth session, the GEQ was handed out to the participants and those whose scores were two standard deviations below or above the mean for the group were, respectively, classified into low or high absenteeism or delayed groups. The significance level in the inferential level was 0.05. Results: The mean values for the four domains, i.e. attraction to social group (ATG-S), attraction to group task (ATG-T), social group interplay (GI-S), and task group interplay (GI-I) for the group with low absenteeism were 34.7, 28.3, 17.3 and 25.9, respectively, and for the group with high absenteeism, respectively, were 27.3, 23.4, 16.9 and 24.7. Discriminant analysis showed significant differences between the low and high absenteeism groups in two domains: attraction to social group and attraction to group task (p<0.01). The mean values for groups with low and high delays in the four domains of group cohesiveness (ATG-S, ATG-T, GI-S and GI-I) were 32.6, 22.7, 27.3 and 17.7 and 27.3, 23.1, 26.9 and 18.2, respectively. There was significant differences between the low and high-delay groups in attraction to social group (ATG-S) (p<0.05). Conclusion: Trying to make group physical exercises attractive and forming homogenous groups for the participating women could be a motivating factor for attending such classes with perseverance. 123 130 Mohsen M Golparvar محسن گل‌پرور Department of Psychology, Faculty of Psychology and Educational Sciences, Islamic Azad University- Khorasgan Branch Department of Psychology, Faculty of Psychology and Educational Sciences, Islamic Azad University- Khorasgan Branch Iran mgolparvar@khuisf.ac.ir Parvin P Bahadoran پروین بهادران Department of Nursing and Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Isfahan University of Medical Sciences Department of Nursing and Midwifery, Faculty of Nursing and Midwifery, Isfahan University of Medical Sciences Iran Hamid Reza HR Oriezie حمیدرضا عریضی Department of Psychology, Faculty of Psychology and Educational Sciences, University of Isfahan Department of Psychology, Faculty of Psychology and Educational Sciences, University of Isfahan Iran AttractionGroup CohesionGroup taskInterplayPhysical exercisePhysical fitnessPregnant womenSecond trimesterSocial group 452.pdf Ramzaninezhad R, Hoseini Keshtan M, Dadban Shahamat M, Shafiee Kordshooli Sh. The relationship between collective efficacy, group cohesion and team performance in professional volleyball teams. Braz J Biomotricity. 2009;3(1):31-9.##Sánchez JC, Yurrebaso A. Group cohesion: Relationships with work team culture. Psicothema. 2009; 21(1):97-104.##Ramazaninezhad R, Hoseini Keshtan M. The relationship between coach’s leadership styles and team cohesion in Iran football clubs professional league. Braz J Biomotricity. 2009;3(2):111-20.##Spink KS. Group cohesion and collective efficacy of volleyball teams. J Sport Exerc Psychol. 1990;12(3): 301-13.##Wankel LM, Yardley JK, Graham J. The effects of motivational interventions upon the exercise adherence of high and low self-motivated adults. Can J Appl Sport Sci. 1985;10(3):147-56.##Carron AV, Widmeyer WN, Brawley LR. Group cohesion and individual adherence to physical activity. J Sport Exerc Psychol. 1998;10(2):127-38.##International Socity of Sport Psychology. Physical activity and psychological benefits: A position statement from the international society of sport. J Appl Sport Psychol. 1992;4(1):94-8.##Fox KR. Self-esteem, self-perceptions and exercise. Int J Sport Psychol. 2000;31(2):228-40.##Carron AV, Colman MM, Wheeler J, Stevens D. Cohesion and Performance in Sport: A Meta Analysis. J Sport Exerc Psychol. 2002;24(2):168-88.##Evans CR, Dion Kl. Group cohesion and performance: A meta ananlysis. Small Group Res. 1991;22 (2):175-86.##Mullen B, Copper C. The relation between group cohesiveness and performance: an integration. Psychol Bulletin. 1994;115(2):210-27.##Patterson MM, Carron AV, Loughead TM. The influence of team norms on the cohesion-self-reported performance relationship: a multi-level analysis. Psychol Sport Exerc. 2005;6(4):479-93.##Teoman N, Ozcan A, Acar B. The effect of exercise on physical fitness and quality of life in post menopausal women. Maturitas. 2004;47(1):71-7.##Vandenakker CB, Glass DD. Menopause and aging with disability. Phys Med Rehabil Clin N Am. 2001;12(1):133-51.##Ward A, Morgan WP. Adherence patterns of healthy men and women. J Cardiac Rehabil. 1984;4(1): 143-52.##Asci FH, Kin A, Kosar SN. Effect of participation in an 8 week aerobic dance and step aerobics program on physical self-perception and body image satisfaction. Int J Sport Psychol. 1998;29(4):366-75.##May AM, Duivenvoorden HJ, Korstjens I, van Weert E, Hoekstra-Weebers JE, van den Borne B, et al. The effect of group cohesion on rehabilitation outcome in cancer survivors. Psychooncology. 2008;17(9):917-25.##Annesi JJ, Whitaker AC. Weight loss and psychologic gain in obese women--participants in a supported exercise intervention. Perm J. 2008;12(3): 36-45.##Allgöwer A, Wardle J, Steptoe A. Depressive symptoms, social support, and personal health behaviors in young men and women. Health Psychol. 2001;20(3):223-7.##Fraser SN, Spink KS. Examining the role of social support and group cohesion in exercise compliance. J Behav Med. 2002;25(3):233-49.##McNicholas SL. Social support and positive health practices. West J Nurs Res. 2002;24(7):772-87.##Resnick B, Nigg C. Testing a theoretical model of exercise behavior for older adults. Nurs Res. 2003; 52(2):80-8.##Cramp AG, Brawley LR. Moms in motion: a group mediated cognitive-behavioral physical activity intervention. Int J Behav Nutr Phys Act. 2006;3:23.##Carron AV, Widmeyer WN, Brawley LR. The development of an instrument to assess cohesion in sport teams: the group environment questionnaire. J Sport Exerc Psychol. 1985;7(3):244-66.##Field A. Discovering statistics using spss. 3rd ed. London: Sage Publications; 2009. p. 602.##

مسائل اخلاقی اهدای جنین The Moral Problems of Embryo Donation 2 1 اهدای جنین یکی از فناوری‌های نوینی است که در دهه‌های اخیر برای درمان زوج‌های نابارور به کار گرفته شده است. کاربرد این فناوری همچون دیگر امکانات زیستی و پزشکی جدید، پاره‌ای دغدغه‌های اخلاقی، دینی، حقوقی و اجتماعی را پدید آورده است. این مقالة پژوهشی دغدغه‌های فلسفی‌ـ اخلاقی به کارگیری فناوری اهدای جنین را با در نظر داشتن «چالش‌های اخلاقی کلی در مورد اهدای جنین»، «مسائل اخلاقی در فرایند اهدا» و «مسائل اخلاقی پس از اهدا» طرح و به بررسی و ارزیابی نقادانة آنها می‌پردازد. نتیجه آن است که با رعایت برخی قیود اخلاقی و حرفه‌ای و پیشگیری از سوء استفاده‌های احتمالی، می‌توان استفاده از فناوری جنین را به لحاظ اخلاقی موجه شمرد. 2 Embryo donation is one of assisted reproductive technologies used in the past few decades. Application of this technology, like any other novel biomedical service, has raised certain moral, religious, legal and social concerns. This paper deals with moral / philosophical concerns involved in embryo donation technology, taking into account the “general moral challenges concerning embryo donation”, “moral problems arising during the process of donation” and “moral problems appearing after donation”, and attempts to critically evaluate them. As a preliminary conclusion, utilizing embryo donation technology could be morally justifiable provided that certain moral and professional constraints are observed and probable abuses are prevented. 131 144 Amir Hossein AH Khodaparast امیرحسین خداپرست Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran khodaparast@avicenna.ac.ir Sanaz S Sharifi ساناز شریفی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Ali Reza A Milanifar Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Zohreh Z Behjati Ardakani Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Assisted Reproductive TechniquesEmbryo donationInfertilityLegalMoral 456.pdf Gensler HJ. Ethics: A contemporary introduction. 1st ed. Bahreini H, translator. Tehran: Asemane Khial; 2008. p. 32-3.##Kochi University Repository [Internet]. Japan: MIT and Hewlett-Packard; 2002-2007. What is applied ethics? The Activities of the Centre for Applied Ethics of University of British Columbia; 1996 Dec 24 [cited 2011 feb 27]; [about 10 screens]. Available from: https://ir.kochi-u.ac.jp/dspace/bitstream/1012 6/1013/1/H045-07.pdf##Rasekh M, Khodaparast AH. The scope of bioethics. J Reprod Infertil. 2010;11(4):275-94.##Akhondi MA, Behjati Ardakani Z, Arefi S. [Natural fertilization and the importance of third party reproduction in infertility treatment]. In: A group of authors. Essays on gamete and embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 27-31. Persian.##Behjati Ardakani Z, Akhondi MA, Milanifar A, Modaberi Saber Y. [Counseling, evaluation and screening of donor and recipient in third party reproducetion and the matching process]. In: A group of authors. Essays on gamete and embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 64. Persian.##Pence GE. Classic cases in medical ethics. 1st ed. Vol. 2. Habibi P, translator. Tehran: Research Center of Medical Ethics; 1994. p. 16-64.##Paxson H. With or against nature? IVF, gender and reproductive agency in Athens, Greece. Soc Sci Med. 2003;56(9):1853-66.##The Official Website of Naraghi Arash [Internet]. California: [publisher unknown]; [On Sexual Minorities]; [cited 2011 Feb 27]; [28 pages]. Available from: http://arashnaraghi.org/articles/minorities.pdf. Persian.##Hospers J. Introduction to philosophical analysis. 1st ed. Akrami M, translator. Tehran: Tarhe No; 2005. p. 255-61.##Plato. Laws In: Plato complete works. Lotfi MH, translator. Tehran: Kharazmi; 2001. p. 2140-2.##Human Family Foundation [Internet]. [place unknown: RC Net]; IVF violates human dignity; [cited 2011 Feb 27]; [about 5 screens]. Available from: http://www.rc.net/org/humanfamily/ivf.html##Kant I. Groundwork of the metaphysics of morals. In: Gregor MJ, editor. Practical philosophy. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p. 73.##Kant I. Groundwork of the metaphysics of morals. In: Gregor MJ, editor. Practical philosophy. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p. 80.##Kant I. Groundwork of the metaphysics of morals. In: Gregor MJ, editor. Practical philosophy. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p. 74.##Moore KA. Embryo adaption: The legal and moral challenges. St. Thomas’J Law Public Policy. 2007; 1:116-7.##The Holy See [Internet]. Vatican: Vatican Publishing House; Instruction on the respect for life in its origin and on the dignity of procreation replies to certain questions of the day; 1987 Feb 22 [cited 2011 Feb 27]; [about 22 screens]. Available from: http://www.vatican.va/roman_curia/congregations/cfaith/documents/rc_con_cfaith_doc_19870222_respect-for-human-life_en.html##Islami SH. [Human cloning in Catholicism and Islam]. Qom: The University of Religions and Denominations; 2007. p. 218. Persian.##Mander WJ. God and personality. Heythrop J. 1997;38(4):401-12.##Izutsu T. Creation and the timeless order of things: Essays in Islamic mystical philosophy. 1st ed. Kaviani Sh, translator. Tehran: Scientific & Cultural Publications Compony; 2001. p.15-90.##Eisenberg VH, Schenker JG. Pre-embryo donation: ethical and legal aspects. Int J Gynaecol Obstet. 1998;60(1):51-7.##Farhadi Y, Mousavi Jarrahi A, Haqiqi Z. [Ethical standards in medical research]. 1st ed. Tehran: National Research Center of Medical Sciences; 2004. p. 33-4. Persian.##Etchells E, Sharpe G, Walsh P, Williams JR, Singer PA. Bioethics for clinicians: 1. Consent. CMAJ. 1996;155(2):177-80.##Aramesh K. [Assessment of practical implications of the principles of medical ethics in gamete and embryo donation]. In: A group of authors. Essays on gamete & embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 328-30. Persian.##Larijani B, Zahedi F. Ethical issues in gamete and embryo donation. Res Ethics Sci Technol. 2008;1 (1):3-5.##Shidfar F, Sadeghi S. [To give or sell human gametes- The ethical view]. In: A group of authors. Essays on gamete & embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 390-3. Persian.##Law and Bioethics Department, Avicenna Research Institute; [Sex selection]. In: Hamneshast. Tehran: Avicenna Research Institute; 2009. p. 35-9. Persian.##Asghari F. [Ethical issue in prenatal sex selection]. In: A group of authors. Essays on gamete & embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 342.##Shenfield F, Steele SJ. What are the effects of anonymity and secrecy on the welfare of the child in gamete donation? Hum Reprod. 1997;12(2):392-5.##Safai H. [The shortcomings of Iranian law on the donation of gametes and embryos (comparative study)]. In: A group of authors. Essays on gamete & embryo donation in infertility treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 83-9. Persian.##Mahallati Sh. A study on the legal vacuum regarding child’s rights. 1st ed. Tehran: Women's Socio-Cultural Council; 2005. p. 157-8.##Sadeghi M, Mazaheri MA. [Aspect of parent- child relationship in gamete donation]. In: A group of authors. Essays on gamete & embryo donation in infertility Treatment. Tehran: Samt; 2007. p. 97-8. Persian.##Baran A, Lifton BJ. Adoption. In: Post SG, editors. Encyclopedia of bioethics. New York: Thomson: Macmillan Reference US; 2005. p. 68-74.##Rasekh M. The problem of abortion: Jurisprudential or philosophical? ICMR. 2005;16(3):251-64.##

مقایسه اضطراب، افسردگی و رضایت زناشویی در دو گروه منتخب زنان بارور و نابارور شهر تهران Comparing Anxiety, Depression and Sexual Life Satisfaction in Two Groups of Fertile and Infertile Women in Tehran 2 1 زمینه و هدف: ناباروری تجربه عاطفی دردناکي است؛ واکنش زوجین در مقابل این احساس اندوه به شکل مشکلات روان شناختی از قبیل اضطراب، افسردگی و کاهش در عملکرد شخص بروز می‌نماید. هدف از این تحقیق تعیین میزان اضطراب، افسردگی و رضایت از زندگی زناشویی در زنان نابارور مراجعه‌کننده به مرکز ناباروری ولیعصر (عج) و مقایسه آن با زنان بارور شرق تهران بود. روش بررسی: این مطالعه از نوع توصیفی‌ـ مقایسه‌ای بود که در آن میزان اضطراب، افسردگی و رضایت از زندگی زناشویی در 60 نفر شامل 30 زن نابارور و 30 زن بارور انتخاب شده به روش نمونه‌گیری در دسترس، مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. اطلاعات اولیه شامل سن، مدت ناباروری، مدت ازدواج، تعداد فرزندان، شغل ومیزان تحصیلات ثبت شد. گردآوری داده‌ها با استفاده از پرسشنامه‌های افسردگی بک، اضطراب زانگ و رضایت زناشویی انریچ صورت گرفت. داده‌ها به وسیله آزمون‌هاي استنباطی (مجذور کای، تی مستقل، من‌ـويتني، دقيق فیشر، رگرسیون لجستیک چندگانه) و با استفاده از نرم افزار SPSS ویرایش 18 مورد بررسی قرار گرفت، P کمتر از 5% معنی‌دار در نظر گرفته شد. نتایج: اضطراب و افسردگی در زنان نابارور به‌طور معني‌داري بیشتر از زنان بارور بود (05/0p<)؛ اما تفاوت معنی‌داری در رضایت زناشویی کلی بین دو گروه مشاهده نشد. اضطراب و افسردگی در هیچ کدام از گروهها با سن و مدت ازدواج ارتباط نداشت؛ اما رضایت جنسی در زنان نابارور با افزایش سن و مدت ازدواج، بیشتر از زنان بارور بود. اضطراب، افسردگی و رضایت زناشویی در هر دو گروه با تحصیلات ارتباط معنی‌داری نشان نداد؛ ولی مدت ناباروری در زنان نابارور علیرغم عدم ارتباط با اضطراب و افسردگی، در رضایت جنسی تاثیر داشت. همچنین اضطراب در هیچیک از دو گروه با شغل مرتبط نبود؛ اما شغل، با افسردگی و رضایت زناشویی صرفاً در زنان نابارور ارتباط معني‌دار را نشان داد. افسردگی و روابط جنسی در زنان نابارور خانه‌دار بیشتر از زنان ناباور شاغل بود. نتيجه‌گيري: افراد نابارور نیازمند مراقبت از نظر روانی هستند و دریافت درمان‌های حمایتی در زمینه مسایل روانی کمک قابل توجهی جهت حل مشکل این گروه می‌باشد. 2 Background: Infertility is a major painful emotional distress that is manifested in the form of psychological disorders such as anxiety, depression and reduction of normal sexual function in affected couples. The purpose of this study was to compare anxiety, depression and life satisfaction between fertile and infertile women admitted to Vali-e-Asr Infertility Clinic in Tehran in 2009. Methods: This descriptive study included 60 participants, being composed of 30 infertile and 30 fertile women. The demographic data including marital status, infertility duration, age and occupation were recorded. Zung’s self-rating Anxiety Scale and Beck Depression Inventory (BDI) were used for evaluating anxiety and depression, respectively. The Evaluation and Nurturing Relationship Issues, Communication and Happiness (ENRICH) questionnaire was also used for evaluating the participants’ life satisfaction. Results: Anxiety and depression were significantly higher in infertile compared to fertile women (p < 0.05) but life satisfaction was not much different in the two groups. In both groups, anxiety and depression did not relate with age or infertility duration but life satisfaction grew more in infertile women than fertile women by age and marriage duration. In the two groups, anxiety, depression and sex satisfaction did not relate with education but infertility duration was affected by sexual satisfaction despite having no significant relationship with anxiety or depression. Moreover, depression and sexual dissatisfaction in infertile housekeeper women was more prevalent than infertile employed women but anxiety had no relationship with their occupational status. Conclusion: Infertile women need psychiatric care. Considering the results of this study, suggestions addressing the improvement of psychological health of infertile women through supportive measures seem to be of value. 157 163 Leila L Faal Kalkhoran لیلا فعال کلخوران Department of Psychological Science, Islamic Azad University Department of Psychological Science, Islamic Azad University Iran Hadi H Bahrami هادی بهرامی Department of Psychological Science, Islamic Azad University Department of Psychological Science, Islamic Azad University Iran Noor Ali NA Farrokhi نورعلی فرخی Faculty of Psychological Sciences, Allameh Tabataba&#39;i University Faculty of Psychological Sciences, Allameh Tabataba'i University Iran Hojjat H Zeraati حجت زراعتی Department of Epidemiology and Biostatistics, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Department of Epidemiology and Biostatistics, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences Iran Madjid M Tarahomi مجید ترحمی Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR Iran Majidtarahomi@yahoo.com AnxietyBeck Depression InventoryFertilityInfertilitySexual life satisfactionZung’s self-rating Anxiety Scale 443.pdf Ghorbani B, Milanifar AR. Infertility and Insurance. Tehran: Avicenna Research Institute. 2009. p. 57- 65.##Cedars MI. Infertility. 1st ed. New York: Mc Graw Hill; 2005. p. 175.##Feizi Boranji L. Detection of psychological health, self satisfaction and marital satisfaction in infertile women in Kermanshah city. Medical University of Kermanshah. 2002. p. 59.##Nilforooshan P, Ahmadi SA, Abedi MR, Ahmadi SM. Attitude towards infertility and its relation to depression and anxiety in infertile couples. J Reprod Infertil. 2006;6(5):13-22.##Bahrami N, Sattarzadeh N, Ranjbar Koochaksariie F, Ghojazadeh M. Comparing depression and sexual satisfaction in fertile and infertile couples. J Reprod Infertil. 2007;8(1):52-9.##Volgsten H, Skoog Svanberg A, Ekselius L, Lundkvist O, Sundström Poromaa I. Risk factors for psychiatric disorders in infertile women and men undergoing in vitro fertilization treatment. Fertil Steril. 2010;93(4):1088-96.##Volgsten H, Skoog Svanberg A, Ekselius L, Lundkvist O, Sundström Poromaa I. Prevalence of psychiatric disorders in infertile women and men undergoing in vitro fertilization treatment. Hum Reprod. 2008;23(9):2056-63.##Williams KE, Marsh WK, Rasgon NL. Mood disorders and fertility in women: a critical review of the literature and implications for future research. Hum Reprod Update. 2007;13(6):607-16.##Drosdzol A, Skrzypulec V. Depression and anxiety among Polish infertile couples--an evaluative prevalence study. J Psychosom Obstet Gynaecol. 2009;30 (1):11-20.##Chen TH, Chang SP, Tsai CF, Juang KD. Prevalence of depressive and anxiety disorders in an assisted reproductive technique clinic. Hum Reprod. 2004;19(10):2313-8.##Fassino S, Pierò A, Boggio S, Piccioni V, Garzaro L. Anxiety, depression and anger suppression in infertile couples: a controlled study. Hum Reprod. 2002;17(11):2986-94.##Kormi Nouri R. Psycho-social aspects of infertility. J Reprod Infertil. 2000;1(2):57-68.##Seif D, Alborzi Sh, Alborzi S. Effect of some affective and demographic variables on life satisfaction of infertile women. J Reprod Infertil. 2001;2 (4):66-74.##Pazandeh F, Sharghi SN, Kormi Nouri R, Alavi Majd H. A comparative study of psycho-social aspect between infertile and fertile women referring to health cares center and infertility center in Tehran, 2003. Pejouhandeh. 2005;9(6):355-60.##Repokari L, Punamäki RL, Unkila-Kallio L, Vilska S, Poikkeus P, Sinkkonen J, et al. Infertility treatment and marital relationships: a 1-year prospective study among successfully treated ART couples and their controls. Hum Reprod. 2007;22(5):1481-91.##Kormi Nouri R, Akhondi MA, Behjati Ardekani Z. Psychosocial aspects of infertility from viewpoint of infertility treating physicians. J Reprod Infertil. 2001;2(3):14-25.##Mohammadi MR, Khalaj Abadi Farahani F. Emotional and psychological problems of infertility and strategies to overcome them. J Reprod Infertil. 2001;2(4):34-8.##Karami A. Introduction to test construction and psychological tests. 4th ed. Tehran: Ravansanji publication; 2008. p. 404-25.##Hamidi F. Evaluation of relation between marriage satisfaction and attachment in married student of Rajaee university. Rajaee university. 2005. p. 41-3.##Gholizade N. Assessment and comparison of psychological health and life satisfaction between employed and housekeeper women. Azad Univ J. 2008;5(2):25-38.##Ardeshiri F. Assessment of Group cognitive behavioral counseling effectiveness on decreasing infertile women’s depression in Shahriar city. Azad Univ J. 2004;1(1):50-4.##Shakeri J, Hossieni M, Golshani S, Sadeghi Kh, Fizollahy V. Assessment of general health, stress coping and marital satisfaction in infertile women undergoing IVF treatment. J Reprod Infertil. 2006; 7(3):269-75.##Jonaidy E, Noorani Sadodin Sh, Mokhber N, Shakeri MT. Comparing the marital satisfaction in infertile and fertile women referred to the public clinics in Mashhad in 2006-07. Iran J Obstet Gynecol Infertil. 2009;12(1):7-16.##Lee TY, Sun GH, Chao SC. The effect of an infertility diagnosis on the distress, marital and sexual satisfaction between husbands and wives in Taiwan. Hum Reprod. 2001;16(8):1762-7.##Abedinia N, Ramezanzade F, Aghsa MM. Relation between anxiety and depression with infertility duration. Payesh J. 2003;2(4):253-8.##Khademi A, Al Yasin A, Agha Hoseini M, Ahmadi Abhari A, Esfandi H, Fakhimi Derakhshan K. Depression and infertility. Hayat J. 2004;21:13-21.##

Letter to Editor 2 1 سردبیر محترم، با سلام در دوره یازدهم، شماره چهارم، زمستان 89 فصلنامه باروری و ناباروری، صفحات 237-227 مقاله‌ای با عنوان " ارزیابی اثر آنتی اکسیدانتی عصاره گیاه جینسینگ و ویتامین E بر باروری موش‌های بزرگ آزمایشگاهی نر به دنبال تیمار طولانی مدت با سیکلوفسفامید" به چاپ رسیده است که به یکی از موضوعات مطرح و به روز دنیا، یعنی بعضی روش‌های موثر بر کاهش اثرات مخرب داروهای شیمی درمانی پرداخته است که می‌تواند در راستای کمک به بیماران سرطانی گام موثری باشد. نکات زیر در این مقاله به نظر اینجانبان مورد تأمل است: 1. به منظور بررسی اثر ویتامین E و جینسینگ، گروه‌های دریافت کننده این دو مداخله و گروه‌های اول تا سوم یعنی گروه کنترل، گروه شم و گروهی که سیکلوفسفامید را به صورت تزریق دریافت می‌کرد مقایسه شده‌اند. روش استفاده شده برای مقایسه این گروه‌ها آنالیز واریانس یکطرفه ذکر شده است که برای مقایسه گروه‌هایی که از طریق گاواژ دارو را دریافت کرده بودند صحیح می‌باشد چرا که در این گروه‌ها تفاوت تنها در یک فاکتور (نوع دارو) است. اما گروه سیکلوفسفامید که دارو را به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کرده است با سایر گروه‌ها در دو عامل تفاوت دارد (نوع دارو و روش دریافت دارو) و در نتیجه احتمال مداخله "روش دریافت" در نتایج وجود خواهد داشت. لذا پیشنهاد می‌شود در این رابطه محافظه‌کارانه‌تر اظهار نظر گردد. 2. در قسمت اثر بر وزن اندام‌های جنسی قسمت نتایج ذکر شده است "... مصرف همزمان دو آنتی اکسیدان با هم، کاهش وزن بیضه را نسبت به گروهی که فقط سیکلوفسفامید دریافت کرده بودند به طور معنی‌داری افزایش داد" از این جمله اینطور برداشت می‌شود که مصرف همزمان دو آنتی اکسیدان با هم وزن بیضه را بیشتر از مصرف سیکلوفسفامید تنها می‌کاهد. در صورتی که همانطور که از جدول نتایج هم واضح است منظور نویسندگان دقیقاً عکس آن بوده است. 2 165 166 Seyedeh Shiva Sh Dibaj سیده شیوا دیباج Department of Epidemiology and Reproductive Health, Reproductive Medicine Research Center, Rouyan Institute, ACECR Department of Epidemiology and Reproductive Health, Reproductive Medicine Research Center, Rouyan Institute, ACECR Iran shiva.dibaj@gmail.com Reza R Omani Samani رضا عمانی سامانی Department of Epidemiology and Reproductive Health, Reproductive Medicine Research Center, Rouyan Institute, ACECR Department of Epidemiology and Reproductive Health, Reproductive Medicine Research Center, Rouyan Institute, ACECR Iran No Keyword 464.pdf Shanafelt TD, Lin T, Geyer SM, Zent CS, Leung N, Kabat B, et al. Pentostatin, cyclophosphamide, and rituximab regimen in older patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 2007;109(11):2291-8.##Young SD, Whissell M, Noble JC, Cano PO, Lopez PG, Germond CJ. Phase II clinical trial results involving treatment with low-dose daily oral cyclophosphamide, weekly vinblastine, and rofecoxib in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 2006;12(10):3092-8.##

Response to Editor 2 1 سردبیر محترم، با سلام و تشکر از زحمات حضرتعالی در تعالی علم و پژوهش و با تشکر از دست اندرکاران آن مجله محترم، در خصوص مقاله چاپ شده اینجانب و همکاران با عنوان: " ارزیابی اثر آنتی اکسیدانتی عصاره گیاه جینسینگ و ویتامین E بر باروری موش‌های بزرگ آزمایشگاهی نر به دنبال تیمار طولانی مدت با سیکلوفسفامید"و سئوالات مطرح شده یکی از خوانندگان محترم مقاله مذکور در خصوص آن، ضمن قدردانی از توجه خواننده محترم به مقاله و دقت نظر نامبرده خواهشمند است پاسخ ذیل را به همراه قدردانی از خواننده محترم در یکی از شمارگان آتی خود چاپ نمایید. 1- در خصوص ایراد تجزیه و تحلیل آماری در گروه‌های مورد مطالعه لازم می‌دانم به عرض برسانم که روش‌های استفاده دارو در گروه‌های مورد مطالعه معمولاً به عنوان فاکتور موثر تلقی نمی‌شوند؛ بلکه به عنوان عوامل مخدوش کننده (confounder) مورد توجه قرار می‌گیرند. پژوهشگر برای کاهش یا حذف اثر آنها یک یا چند گروه را بدون احتساب دارو یا عامل موثر به عنوان گروه شم در نظر می‌گیرد. در مطالعات دارای چندین عامل مخدوش کننده معمولاً موثرترین عامل یا عامل‌های فوق مورد توجه قرار می‌گیرند. نشان داده شده است که تزریق داخل صفاقی سرم فیزیولوژیک به عنوان حلال دارویی کمترین اثر مخدوش کنندگی را دارد، بنابراین کمیته نظارت بر موازین اخلاقی در تحقیقات پزشکی و زیستی دانشگاه علوم پزشکی ارومیه در بررسی پیشنهاد مطالعه ضمن اخذ توضیحات لازم در مورد گروه‌های مورد مطالعه استفاده از گروه مستقلی برای بررسی اثر تزریق صفاقی سرم فیزیولوژیک را قابل قبول ندانسته و به حذف آن رای داد. از طرفی چون در مطالعه مذکور داروی سیکلوفسفامید در گروه سوم بصورت داخل صفاقی استفاده شده است و اثر حلال و روش تزریق نسبت به گروه‌های ششم یا هفتم قابل استحصال و در درون گروه‌ها مستتر بود، بنابراین اگر اثر مخدوش کنندگی داشت براحتی قابل حذف می‌شد. با توجه به عدم اجازه کمیته مذکور محققین گروه مطالعه فوق را نداشته و در آنالیز آماری به عنوان عامل مخدوش کننده از گروه دریافت کننده سیکلو فسفامید برای وزن دهی آماری استفاده کردند. از طرفی چون تزریق داخل صفاقی دارای خصلت فاکتوری یا تیماری نیست، بنابراین نمی‌توان آنرا به عنوان عامل اثر در نظر گرفت. در این مطالعه استفاده از داروها به صورت جداگانه یا با هم به عنوان عامل تیمار بوده و گروه‌های شم برای بالانس عوامل مخدوش کنندگی می‌باشد. برای توصیف بیشتر نظر خواننده محترم را به کتاب Biostatistics for animal science-Miroslav Kaps and William R Lamberson (2004) جلب می نمایم. 2- در خصوص اثر استفاده همزمان ویتامین ای و عصاره جینسینگ به همراه سیکلوفسفامید بر روی وزن بیضه، باید به استحضار برسانم حق با خواننده محترم بوده و اثر ممانعتی این دو ترکیب در جلوگیری از کاهش وزن بیضه از نتایج جدول قابل استخراج است که در متن مشاراله کلمه کاهش در اول جمله فوق الذکر باید حذف گردد. متاسفانه نگارش درست این جمله و اصلاح آن از چشم نویسندگان و داوران محترم پوشیده مانده و موجب برداشتی برخلاف نتایج جدول شده است. بدینوسیله از خواننده محترم و نیز سایر خوانندگان عذرخواهی می‌نمایم. 2 166 167 Firouz F Ghaderi Pakdel فیروز قادری پاکدل Department of Physiology, Faculty of Medicine, Urmia University of Medical Sciences Department of Physiology, Faculty of Medicine, Urmia University of Medical Sciences Iran fgpakdell@umsu.ac.ir No Keyword 465.pdf ####